Codon Usage Bias of Chalcone Synthase Gene CHS in Kiwifruit
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摘要: 为了解猕猴桃查尔酮合成酶基因（Chalcone Synthase，CHS）的密码子使用特征，采用CodonW、SPSS、MEGA软件和EMBOSS在线程序等分析猕猴桃CHS密码子偏好性，并构建单双子叶植物CHS系统发育树。研究结果表明，猕猴桃CHS有效密码子数（ENc）、总G和C含量（GC）和密码子第3位上G或C含量（GC3s）分别为57.21、0.533和0.607；同义密码子相对使用度（RSCU）大于1.0的密码子数为30，但不存在偏好性极强的密码子；聚类分析结果发现，基于密码子使用偏好性分类可将单双子叶进行准确归类，而CHS序列相似性聚类结果并不理想；密码子使用频率分析表明，猕猴桃CHS与模式生物拟南芥和大肠杆菌基因组间密码子使用偏好性差异相对较小。研究认为，猕猴桃CHS密码子偏好性较弱，但倾向使用G和C，且以G或C结尾的密码子；单双子叶植物CHS间存在严格的密码子使用法则；此外，拟南芥和大肠杆菌可能是猕猴桃CHS遗传转化和异源表达较为理想的受体系统。Abstract: To investage codon usage characteristic of chalcone synthase gene of kiwifruit, CodonW, SPSS, MEGA software and EMBOSS online program were used to analyse codon usgae bias (CUB) of CHS, and phylogenetic tree of CHS between monocotyledon and dicotyledon was constructed in this paper. The results showed that, the effective number of codons (ENc), total GC content (GC) and GC content on the 3rd site (GC3s) was 57.21, 0.533 and 0.607, respectively. The number of condons, the number of relative synonymous codon usage (RSCU) of which was more than 1.0, was 30, but no codons was with strongly CUB. The cluster tree of CHS based on CUB was closer to the real category system than it did by sequence similarity. According to codon usage frequency, the CUB between CHS of kiwifruit and Arabidopsis thaliana, Escherichia coli were more similar. These results indicated that, the CUB level of CHS was low in kiwifruit, but it was bias toward GC rich codons and synonymous codons with G or C at 3rd codon position. And CHS in monocotyledons and dicotyledons had the distinctive CUB rules. In addition, Arabidopsis thaliana and Escherichia coli migth be the best receptors for genetic transformation and heterologous expression of CHS in kiwifruit.
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Keywords:
- Kiwifruit /
- chalcone synthase /
- codon usage bias /
- cluster analysis
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猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属多年生藤本果树，其果实中富含酚类化合物、微量元素、氨基酸和维生素C等多种营养和保健成分。猕猴桃栽培主要包括红肉、黄肉和绿肉等品种，尤其红肉猕猴桃因其果肉颜色鲜艳，风味优良而广受欢迎。花青素的积累是果实着色的重要环节。研究发现，红肉猕猴桃内果皮中的红色物质也由花青素构成[1]。目前，植物花青素的分子研究较为广泛，花青素的合成和转运参与的功能基因较多，主要包括查尔酮合成酶CHS[2]、查尔酮异构酶CHI[3]、黄烷酮羟基化酶F3H[4]和二氢黄酮醇还原酶DFR[5]等。其中，查尔酮合成酶CHS是植物聚酮合成酶家族的一员，能够催化3个分子的丙二酰辅酶A和1个分子的对香豆酰辅酶A形成查尔酮，在植物黄酮类化合物合成途径中发挥重要作用[6]。研究表明，查尔酮合成酶基因CHS在猕猴桃果实转色开始期表达急剧升高，而注射CHS-RNAi干扰载体后果肉颜色变浅，花青素含量降低[2, 7]。可见，CHS在猕猴桃果实着色过程中可能发挥重要的功能。
自然界长期进化过程中，生物体或基因会逐渐形成适应环境所需的密码子使用法则，在这一过程中编码同一氨基酸的多个同义密码子并非均等随机使用，即存在密码子使用偏好性(Codon usage bias，CUB)。密码子使用偏好性能够反映基因的起源和进化规律，且与基因的转录水平[8]、内含子含量[9]、蛋白质翻译效率[10]和DNA甲基化[11]等密切相关。开展密码子使用偏好性研究对基因功能和分子进化机理的阐明具有重要参考价值。鉴于此，本试验以GenBank中登录的猕猴桃查尔酮合成酶基因CHS为研究对象，采用CodonW、SPSS19.0、MEGA5.2软件和EMBOSS在线程序分析其密码子使用偏好性，同时基于密码子使用偏好性和核酸序列相似性构建CHS系统发育树，以期为猕猴桃CHS后续研究提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 基因序列获得
试验所研究猕猴桃CHS从GenBank中搜索并下载，全长1 475 bp，5′-UTR、3′-UTR和ORF分别124 bp、184 bp和1 170 bp，编码389个氨基酸，GenBank登录号为KF157394.1。以CHS为检索名从NCBI中下载其他单子叶植物和双子叶植物查尔酮合成酶基因序列。
1.2 方法
1.2.1 密码子使用偏好性参数分析
采用CodonW分析CHS有效密码子数(Effective number of codons，ENc)、密码子总G和C含量(GC)、密码子第1、2和3位上G和C含量(GC1s、GC2s和GC3s)、密码子适应指数(Codon adaptation index，CAI)和同义密码子相对使用度(Relative synonymous codon usage，RSCU)等密码子偏好性参数。采用EMBOSS在线程序中的CUSP模块分析CHS密码子使用频率。模式生物拟南芥Arabidopsis thaliana、烟草Nicotiana sylvestris、大肠杆菌Escherichia coli以及酵母菌Saccharomyces cerevisiae的基因组密码子使用偏好性来源于Codon Usage Database在线数据库。
1.2.2 聚类分析
以1.2.1分析获得的物种间CHS同义密码子相对使用度RSCU为基础，基于SPSS19.0采用离差和平方法(Word法)构建单双子叶植物间CHS系统发育树，同时采用MEGA5.2组间邻接法进行CHS序列相似性聚类分析。
2. 结果与分析
2.1 密码子使用偏好性参数分析
有效密码子数ENc是密码子偏好性的重要衡量标准。试验中，猕猴桃CHS ENc值为57.21，远远高于35[12]而接近61，表明该基因密码子使用偏好性较低，氨基酸编码过程中对碱基的选择较为随机。而在密码子组成成分上，猕猴桃CHS的GC值为0.533，说明其偏好使用含有较多G和C的密码子。此外，GC1s、GC2s和GC3s分别为0.572、0.403和0.604，可见猕猴桃CHS密码子第1位和第3位倾向使用G或C，尤其对G或C结尾密码子有很强的选择偏好性。而猕猴桃CHS密码子适应指数CAI仅为0.224，远小于1.0，也说明其密码子使用偏好性较弱。
2.2 同义密码子相对使用度分析
同义密码子相对使用度RSCU表示特定密码子在对应同义密码子中的相对概率。猕猴桃CHS RSCU分析结果如表 1所示，偏好性较强(RSCU>1.0)的密码子个数达到30个。在这些偏好性较强的密码子中，RSCU值均介于1.0~2.0，并不存在偏好性极强的密码子，由此也进一步反映猕猴桃CHS密码子使用偏好性较弱。此外，在编码半胱氨酸(Cys)时，猕猴桃CHS对TGC和TGT均等选择，而AGA则完全不参与精氨酸(Arg)的编码过程。
表 1 猕猴桃CHS同义密码子相对使用度Table 1. RSCU of kiwifruit CHS in Actinidia chinensis Planch氨基酸 密码子 RSCU 丙氨酸Ala GCA 0.75 GCC 1.63 GCG 0.50 GCT 1.13 精氨酸Arg AGA 0 AGG 1.76 CGA 0.35 CGC 1.76 CGG 1.06 CGT 1.06 天冬酰胺Asn AAC 1.78 AAT 0.22 天冬氨酸Asp GAC 1.16 GAT 0.84 半胱氨酸Cys TGC 1 TGT 1 谷氨酰胺Gln CAA 0.91 CAG 1.09 GAA 0.67 GAG 1.33 甘氨酸Gly GGA 0.52 GGC 0.77 GGG 1.42 GGT 1.29 组氨酸His CAC 0.75 CAT 1.25 异亮氨酸Ile ATA 0.32 ATC 1.42 ATT 1.26 亮氨酸Leu CTA 0.57 CTC 1.86 CTG 0.86 CTT 0.86 TTA 0.29 TTG 1.57 赖氨酸Lys AAA 0.67 AAG 1.33 苯丙氨酸Phe TTC 0.77 TTT 1.23 脯氨酸Pro CCA 0.80 脯氨酸Pro CCC 1.40 CCG 0.60 CCT 1.20 丝氨酸Ser AGC 1.64 AGT 1.09 TCA 0.82 TCC 1.09 TCG 0.55 TCT 0.82 苏氨酸Thr ACA 0.17 ACC 1.57 ACG 0.87 ACT 1.39 酪氨酸Tyr TAC 1.33 TAT 0.67 缬氨酸Val GTA 0.13 GTC 1.29 GTG 1.42 GTT 1.16 注：下划线表示偏好性较强的密码子。 2.3 聚类分析
基于密码子偏好性进行单双子叶植物CHS聚类分析，结果如图 1-A所示。13个物种按照单双子叶的不同分为2个大类，表明单双子叶植物间CHS具有严格的密码子偏好模式差异。此外，双子叶植物类群又可以分为2个亚类群，类群Ⅰ中包含5种木本植物，类群Ⅱ包含2种草本植物，可见，双子叶植物中草本植物和木本植物之间CHS密码子使用规则也存在明显界限，而猕猴桃与甜橙Citrus sinensis的密码子使用特性较为相似。基于序列相似性的CHS聚类结果中，除拟南芥Arabidopsis thaliana外，其余双子叶植物均能准确归类，而单子叶植物CHS间的相似性较弱(图 1-B)。可见，双子叶植物间CHS的进化方向和动力可能较为一致，而在长期进化过程中部分单子叶植物开始朝不同的方向进行特征或功能分化。综合分析，单双子叶植物间CHS具有严格的密码子使用法则，可为物种间真实系统分类提供重要参考标准。
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图 1 基于密码子使用偏好性(A)和序列相似性(B)CHS聚类分析Figure 1. Phylogenetic tree analysis of CHS based on CUB (A) and sequence similarity (B)2.4 异源转化受体系统筛选
密码子偏好性是物种间基因异源转化效率的重要影响因子，通常认为，二者密码子使用频率比值介于0.5~2.0则使用偏好性差异较小，否则差异明显。猕猴桃CHS与模式生物拟南芥(CHS/At)、烟草(CHS/Ns)、大肠杆菌(CHS/Ec)和酵母菌(CHS/Sc)基因组之间的密码子使用频率比值如图 2所示，与4种模式基因组密码子使用偏好性差异较大的密码子个数分别为17、20、17和20个，表明在模式植物遗传转化过程中拟南芥可作为猕猴桃CHS较为理想的载体，而大肠杆菌可能更有利于该基因异源表达。然而，猕猴桃CHS与这些模式基因组仍存在部分偏好性差异极显著的密码子，在后续研究中仍需对这些密码子进行优化和定向改造。
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图 2 猕猴桃CHS与模式基因组密码子使用频率比较Figure 2. Comparison of CUB between kiwifruit CHS and representative organism genome3. 讨论
密码子使用偏好性是物种或基因长期进化和自然环境适应性的结果，对揭示基因的起源和进化具有重要参考价值。然而，猕猴桃中相关方面的研究尚未见报道。本试验中，猕猴桃CHS有效密码子数达到57.21，密码子适应指数为0.224，结果均表明猕猴桃CHS密码子使用偏好性较弱，在编码氨基酸过程中对密码子的选择具有较高的随机性；而在同义密码子相对使用度分析中，所有密码子的RSCU值均较小，预示该基因可能并不存在极强选择偏好的密码子或最优密码子群。密码子成分分析发现，猕猴桃CHS仍倾向使用G和C，且以G或C结尾的密码子，并不符合Murray[13]等公布的大部分双子叶植物密码子特性，可见猕猴桃CHS存在特殊的密码子使用和进化方式。此外，根据Novembre[14]和赖瑞联[15]等的观点推测，猕猴桃CHS进化过程中可能以由AT向GC突变为主。
亲缘关系较近的密码子往往表现相似的密码子使用法则，密码子使用偏好性分析可为物种间遗传关系和系统分类提供理论依据[15-16]。试验中，基于核酸序列相似性的CHS聚类结果发现，无论单子叶植物类群或双子叶植物类群CHS均难以准确归类，而密码子偏好性聚类结果更符合CHS真实系统分类学。结果预示着物种间CHS在长期进化过程中可能因为不同的进化方向和动力而逐渐产生序列特征差异，而单双子叶植物间仍存在的严格的密码子使用法则，与龙眼ARF3[17]、野生蕉FAD7[18]和橄榄CHI[19]研究结果较一致。由此也说明，采用序列相似性聚类和密码子使用偏好性聚类相结合更有利于提高分类结果的准确性。
采用遗传背景更为明确、技术手段更为成熟的模式生物系统进行基因异源转化是目前基因功能鉴定的常用方法之一。而目标基因和模式基因组之间的密码子使用偏好性差异会影响转化和表达效率，试验中往往有必要对其密码子进行优化和定向改造[20-21]。本研究表明，拟南芥和大肠杆菌可能作为猕猴桃CHS遗传转化和异源表达较为理想的受体，然而在具体试验中仍需对部分密码子进行优化。研究结果为猕猴桃CHS后续功能验证提供了重要理论依据。
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图 1 基于密码子使用偏好性(A)和序列相似性(B)CHS聚类分析
Figure 1. Phylogenetic tree analysis of CHS based on CUB (A) and sequence similarity (B)
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图 2 猕猴桃CHS与模式基因组密码子使用频率比较
Figure 2. Comparison of CUB between kiwifruit CHS and representative organism genome
表 1 猕猴桃CHS同义密码子相对使用度
Table 1 RSCU of kiwifruit CHS in Actinidia chinensis Planch
氨基酸 密码子 RSCU 丙氨酸Ala GCA 0.75 GCC 1.63 GCG 0.50 GCT 1.13 精氨酸Arg AGA 0 AGG 1.76 CGA 0.35 CGC 1.76 CGG 1.06 CGT 1.06 天冬酰胺Asn AAC 1.78 AAT 0.22 天冬氨酸Asp GAC 1.16 GAT 0.84 半胱氨酸Cys TGC 1 TGT 1 谷氨酰胺Gln CAA 0.91 CAG 1.09 GAA 0.67 GAG 1.33 甘氨酸Gly GGA 0.52 GGC 0.77 GGG 1.42 GGT 1.29 组氨酸His CAC 0.75 CAT 1.25 异亮氨酸Ile ATA 0.32 ATC 1.42 ATT 1.26 亮氨酸Leu CTA 0.57 CTC 1.86 CTG 0.86 CTT 0.86 TTA 0.29 TTG 1.57 赖氨酸Lys AAA 0.67 AAG 1.33 苯丙氨酸Phe TTC 0.77 TTT 1.23 脯氨酸Pro CCA 0.80 脯氨酸Pro CCC 1.40 CCG 0.60 CCT 1.20 丝氨酸Ser AGC 1.64 AGT 1.09 TCA 0.82 TCC 1.09 TCG 0.55 TCT 0.82 苏氨酸Thr ACA 0.17 ACC 1.57 ACG 0.87 ACT 1.39 酪氨酸Tyr TAC 1.33 TAT 0.67 缬氨酸Val GTA 0.13 GTC 1.29 GTG 1.42 GTT 1.16 注：下划线表示偏好性较强的密码子。 
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