核桃楸Juglans mandshurica Maxim属于被子植物门双子叶植物纲胡桃科胡桃属落叶乔木，主要分布于我国东北地区(小兴安岭及张广才岭)，与水曲柳、黄檗合称东北三大名贵树种，也是重要的药源植物^[1]。目前对核桃楸叶的研究主要涉及其化学成分及提取物的抑菌活性等方面，研究表明核桃楸叶中的主要成分为反油酸、1，8-桉叶素、胡桃叶醌、α-氢化胡桃醌、多酚复合物等^[2]。多酚类物质是一种广泛存在于植物体内的次生代谢产物，由于其具有清除自由基的强抗氧化活性^[3]，能够抗辐射、抗衰老、抗肿瘤、降血脂等，被广泛应用于医药、食品和化工等领域^[4-5]。多酚类物质主要包括花色苷类、黄酮类、黄酮醇类、酚酸等^[6]。研究表明，多酚类物质含量的检测方法主要包括酒石酸亚铁法、福林酚法以及直接紫外光谱法等10余种方法，检测方法简单可靠^[7]。笔者以没食子酸为标准品，运用响应面法对核桃楸叶多酚类物质的提取工艺进行优化，并对其抗氧化活性进行了对比研究。

1.   材料与方法

1.1   仪器、材料与试剂

仪器：RE-2000B旋转蒸发仪；KQ3200DE型数控超声波清洗器；800型电动离心机；TU-1901紫外分光光度计。材料：核桃楸叶于2015年采自东北林业大学实验林场。试剂：没食子酸标准品，中国药品生物制品检定所；福林酚等其他试剂均为分析纯。

1.2   多酚提取的试验方法

1.2.1   多酚标准曲线及回归方程的建立

多酚含量测定采用Folin-Ciocalteu法进行测定^[8]。精确配制1.00 mg·mL^-1没食子酸标准溶液。分别准确量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL加入50 mL容量瓶中定容。准确移取定容后溶液1.0 mL加入到10 mL容量瓶中，加入10%福林酚试剂5 mL，混匀静置5 min，加入7.5%的Na₂CO₃溶液4.0 mL，定容静置1 h，在765 nm波长条件下用紫外分光光度计测定吸光度A。得其线性回归方程为：A = 0.0081c -0.0251(其中c为没食子酸标准品的浓度μg·mL^-1，A为吸光度)，R² = 0.9995。

1.2.2   多酚提取条件的选择

控制液料比、超声时间和超声温度，测定60%、70%、80%、95%等4个体积分数的乙醇对核桃楸叶多酚提取含量的影响。控制超声时间、乙醇体积分数和超声温度，测定10:1、15:1、20:1、30:1等4个液料比对核桃楸叶多酚提取含量的影响。控制液料比、乙醇体积分数和超声温度，测定20、30、40、50 min等4个超声时间对核桃楸叶多酚提取含量的影响。控制乙醇体积分数、液料比和超声时间，测定20、40、60、80℃等4个温度对核桃楸叶多酚提取含量的影响。

1.2.3   响应面(Box-Behnken)试验设计

基于单因素试验，选择乙醇体积分数、液料比和超声时间进行3因素3水平响应面试验设计(BBD)试验设计，获得最佳提取工艺^[9]。各试验设计因素水平见表 1。

表  1  BBD试验设计因素与水平

Table  1.  Levels and factors of Box-Behnken design

水平	酒精体积分数/%	液料比/(mL:g)	超声时间/min
-1	60	10:1	20
0	70	15:1	30
1	80	20:1	40

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1.2.4   多酚的提取及含量测定

称取核桃楸叶子粗粉10.0 g，按照液料比15:1加入不同体积分数的乙醇。超声震荡，抽滤，将滤液旋转蒸发浓缩。将浓缩液倒入100 mL容量瓶，定容待测。将待测液稀释100倍，取出1 mL稀释液加入10 mL容量瓶中，加入10%的福林酚试剂5.0 mL，混匀静置5 min，加入7.5%的Na₂CO₃溶液4.0 mL，定容，静置1 h，在765 nm波长条件下用紫外分光光度计测定吸光度A，将吸光值代入到回归方程，可得核桃楸叶中的多酚含量。

1.3   核桃楸叶多酚抗氧化性试验

核桃楸叶的抗氧化性试验通过测定其对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子和DPPH自由基的清除能力来进行分析。分别采用水杨酸法^[10]、重氮偶合比色法^[11]、邻苯三酚法^[12]和DPPH法^[13]，分别测定4种自由基在510、538、320、517 nm处的吸光度，来衡量其清除能力。试验以蒸馏水为空白样，采用4~20 μg·mL^-1共5个浓度梯度的样品，分别测定其吸光度A₀和A_n。多酚提取物抗氧化能力以清除率E衡量。以强氧化剂抗坏血酸和化学防腐剂苯甲酸对照。清除率的计算公式为：

E=[(A₀-A_n)/A₀]×100%

式中：E为清除率；A₀为空白样的吸光度；A_n为样品的吸光度。

2.   结果与分析

2.1   核桃楸叶多酚提取条件的优化

单因素试验得到的适宜提取条件是乙醇体积分数70%，液料比15:1，超声时间30 min，超声温度60℃。且试验结果证明，相比于乙醇提取分数、液料比和超声时间，超声温度对多酚类物质的提取率影响较小。在单因素试验适宜提取条件的基础上进行试验，得到核桃楸叶多酚类物质的提取率为3.46%。

基于单因素试验，选择乙醇体积分数、液料比和超声时间进行3因素3水平响应面试验设计(BBD)，获得最佳提取工艺。BBD试验设计结果见表 2。

利用响应面设计软件Design-Expert 8.0.6进行回归方程分析，得到以核桃楸叶中多酚提取率Y为目标函数的回归方程：

Y=3.46-0.19X₁+0.11X₂+0.061X₃-0.12X₁X₂+0.005X₁X₃+0.12X₂X₃-0.82X₁²-0.78X₂²-0.83X₃²

表  2  BBD试验设计结果

Table  2.  Results of data analysis on Box-Behnken experiment

序号	乙醇体积分数/%	液料比/(mL:g)	超声时间/min	多酚提取率/%
1	60	15:1	20	1.98
2	70	20:1	20	1.81
3	70	15:1	30	3.46
4	70	20:1	40	2.24
5	80	10:1	30	1.75
6	80	20:1	30	1.61
7	60	10:1	30	1.89
8	70	10:1	20	1.71
9	80	15:1	20	1.59
10	70	15:1	30	3.46
11	80	15:1	40	1.66
12	70	15:1	30	3.46
13	60	20:1	30	2.21
14	70	15:1	30	3.46
15	70	10:1	40	1.65
16	60	15:1	40	2.03
17	70	15:1	30	3.46

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根据回归方程方差分析，核桃楸叶多酚提取率的R²值为0.995 9，变异系数CV = 3.27%，表明回归模型显著，拟合程度好，有实际应用意义。显著性分析结果显示，方程的二次项(X_i²)影响非常显著。一次项(X_i)中液料比和超声时间对方程影响非常显著，乙醇体积分数对方程影响不显著。交互影响(X_iX_j)相对不显著，乙醇体积分数与液料比以及液料比与超声时间对方程影响显著性良好，乙醇体积分数与超声时间对方程影响不显著。即主要因素的效应关系为：液料比>超声时间>乙醇体积分数。

响应面图是各因素响应值构成的三维立体的曲线图，能更直观的表示因素之间的交互作用及核桃楸叶多酚提取的最优条件，依据回归模型绘制响应面图，如图 1所示。

图  1  乙醇体积分数、液料比、超声时间对多酚提取率影响的响应

Figure  1.  Response surface diagram on yield of polyphenol affected by ethanol volume, solvent:solid ratio and time of extraction

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由图 1可以看出，乙醇体积分数A、液料比B和超声时间C任意2个因素对多酚提取率的交互影响。响应面等高线图越圆，2个因素之间的交互作用对多酚提取率的影响越小；响应面等高线图越扁平，因素之间的相互影响就越大^[9]。由图 1-a可以看出，乙醇体积分数A与液料比B的交互作用对多酚提取率的影响较大，分别在乙醇体积分数70%和液料比15:1处出现极值。由图 1-b可以看出，整个响应面图呈现最圆的趋势，说明乙醇体积分数A与超声时间C的交互作用对多酚提取率的影响较小，分别在乙醇体积分数70%和超声时间30 min处出现极值。由图 1-c可以看出，液料比B与超声时间C的交互作用对多酚提取率的影响较大，分别在液料比15:1和超声时间30 min时出现极值。

2.2   核桃楸叶多酚提取物抗氧化性分析

通过测定核桃楸叶多酚提取物对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子和DPPH自由基的清除能力来评价其抗氧化能力，其对4种自由基的清除能力以清除率的形式表示。核桃楸叶多酚提取物对4种自由基的清除率见表 3。

表  3  多酚提取物对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子和DPPH自由基的清除率

Table  3.  Scavenging capacities of polyphenol extract on hydroxyl radicals, nitrite ions, super-oxide anions and DPPH free radicals

样品浓度/(μg·mL-1)	羟基自由基清除率/%				亚硝酸根离子清除率/%				超氧阴离子清除率/%				DPPH自由基清除率/%
	提取多酚	苯甲酸	抗坏血酸		提取多酚	苯甲酸	抗坏血酸		提取多酚	苯甲酸	抗坏血酸		提取多酚	苯甲酸	抗坏血酸
4	19.9	15.7	29.4		19.6	15.7	29.4		23.2	20.4	30.7		79.6	71.1	83.3
8	33.4	21.1	42.1		29.7	23.2	38.5		41.4	29.0	48.5		84.5	76.5	89.4
12	39.2	32.7	61.9		36.9	29.7	49.1		58.9	32.7	65.4		88.2	79.2	94.1
16	54.3	38.3	68.3		49.1	36.4	57.5		76.1	39.3	81.1		93.7	82.6	99.3
20	62.4	44.7	78.6		58.9	44.2	66.3		89.7	45.2	90.2		96.9	86.3	99.9

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由表 3可以看出，核桃楸叶多酚提取物、化学防腐剂苯甲酸和强抗氧化剂抗坏血酸对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子和DPPH自由基均有一定的清除能力。从清除率大小可以看出，提取多酚对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子和DPPH自由基的最大清除率分别为62.4%、58.9%、89.7%和96.9%。同时，与化学防腐剂苯甲酸和强抗氧化剂抗坏血酸进行对照试验，得到化学防腐剂苯甲酸和强抗氧化剂抗坏血酸对4种自由基的清除能力大小顺序与核桃楸叶多酚提取物相同。提取多酚的抗氧化能力介于苯甲酸和抗坏血酸之间，其相对顺序为抗坏血酸>提取多酚>苯甲酸。

如图 2所示，核桃楸叶子提取多酚对4种自由基的清除率随着提取多酚浓度的增大不断增大。在试验浓度范围内，随着浓度的增加，清除率曲线斜率不断变小，即清除率的增长速率不断减缓。最后趋于平稳，即清除率最大值。由此可推算核桃楸叶多酚类物质对4种自由基的清除能力大小，即抗氧化生物活性。由图 2可知，核桃楸叶多酚类物质对4种自由基的抗氧化生物活性强弱顺序是DPPH自由基>超氧阴离子>羟基自由基>亚硝酸根离子。其中，多酚类物质对DPPH自由基的清除能力尤为显著。试验证明，多酚类物质与强抗氧化剂抗坏血酸抗氧化能力相近。

图  2  提取多酚抗氧化能力比较

Figure  2.  Antioxidant capacity of polyphenol extract

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3.   讨论与结论

多酚类物质是一种具有多元酚结构的植物次生代谢产物，本研究通过没食子酸标准品鉴定证实核桃楸叶中含有多酚类物质成分，并通过响应面法对其提取条件进行优化，同时进行了核桃楸叶多酚类物质的抗氧化性研究。

多酚类物质广泛存在于茶叶、藜麦、核桃等植物当中。王桂林等^[11]通过单因素试验在超声辅助的条件下对藜麦多酚进行了提取，得到藜麦多酚的得率为2.15%。王茂生等^[8]运用响应面法在超声辅助的条件下对核桃叶多酚进行了提取，其核桃多酚含量可达4.04 mg·g^-1。本研究在单因素试验的基础上，通过响应面法采用3因素3水平进行核桃楸叶多酚类物质提取的工艺条件优化设计，得到最佳提取条件为乙醇体积分数70%，超声时间30 min，超声温度60℃，液料比15:1，多酚类物质最大提取率可以达到3.46%。

多酚类物质具有较强的抗氧化性和清除自由基的能力。刘畅等^[14]研究证明了多酚类物质对羟基自由基、超氧自由基和DPPH均有较强的清除作用。ZHANG Xin等^[15]研究得到多酚类物质的酚羟基结构及其较大的电离电位决定了其具有强氧化性。本研究证实了核桃楸叶多酚类物质对羟基自由基、亚硝酸根离子、超氧阴离子、DPPH自由基均有较强的清除能力，且随着核桃楸叶多酚提取物浓度的增加，其清除能力在试验浓度范围内逐渐减弱，其对4种自由基的清除能力强弱顺序为：DPPH自由基>超氧阴离子>羟基自由基>亚硝酸根离子，其中，多酚类物质对DPPH自由基的清除能力尤为显著。同时，通过对比发现，核桃楸叶提取多酚抗氧化活性优于化学防腐剂苯甲酸，但略低于强抗氧化剂抗坏血酸。试验证明，核桃楸叶多酚提取物具有较强的抗氧化性，是一种天然的抗氧化剂，具有很好的开发和利用价值。