Optimized Fermentation for Production of Xanthan Gum Using Xanthomonas axonopodis
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摘要: 为了获得更高品质的黄原胶，优化黄原胶高产菌株地毯草黄单胞菌FJAT-10151的发酵工艺，通过单因素及正交设计对培养基（碳源、氮源和无机盐离子）和发酵条件（发酵时间、pH、装液量和接种量）进行优化，试验获得最佳发酵培养基为葡萄糖30 g·L-1、豆饼粉30 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、pH值9.0。在装液量50 mL/250 mL、接种量8%培养条件下发酵72 h，黄原胶产量达到21.0 g·L-1，是初始培养条件产量8.65 g·L-1的2.43倍。优化发酵工艺后，黄原胶品质提高，丙酮酸含量从8.9%升高到16.3%，而蛋白质含量从15.27%降低到4.8%。Abstract: Conditions of fermentation to produce extracellular xanthan gum by using Xanthomonas axonopodis FJAT-10151 were optimized to maximize quality of the gum. Single factor and orthogonal experiments on medium composition (including sources of carbon, nitrogen and inorganic ions) and fermentation conditions (including pH, time duration, fill volume and inoculum ratio) were conducted. It was found that using a medium consisting of glucose 30 g·L-1, soybean cake powder 30 g·L-1, and KH2PO4 2 g·L-1 at pH 9.0 with a filled culture of 50 mL containing 8% of inoculum per 250 mL flask, a yield of 21.0 g·L-1 of xanthan gum could be obtained after fermentation for 72 h. The production capacity was 243% higher than that prior to the optimization. More importantly, a higher quality of xanthan gum with the content of pyruvic acid increased from 8.9% to 16.3% and the content of protein decreased from 15.27% to 4.8% was realized.
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Keywords:
- Xanthomonas axonopodis /
- xanthan gum /
- orthogonal design
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微生物多糖种类繁多，因其独特性质在多个行业具有重要应用。黄原胶是黄单胞菌发酵生产的一种重要微生物多糖，具有悬浮性、乳化性、增稠性、耐酸碱盐和假塑性等[1-2]，在食品、化妆品和石油等行业具有广泛的应用[3-5]。国际上对黄原胶的需求以7%~8%的速度逐年增加，国内生产的黄原胶存在产品质量低下、生产得率较低等问题，无法满足国内市场需求，距国际市场的需求尚有较大差距[6]。
目前可产黄原胶的菌种有野油菜黄单胞菌Xanthomonas campestris[7-8]、野油菜黄单胞菌的变种[9]和地毯草黄单胞菌[10]等。黄原胶的产量和质量不仅受菌株[2]的影响，而且也受培养基中营养物质种类和培养条件的影响[8]。黄原胶是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酰基和丙酮酸构成，丙酮酸含量影响黄原胶的性质[11]。发酵工艺条件的优化对黄原胶产量和质量都具有重要影响，在黄原胶的实际工业生产中具有重要意义。产黄原胶工艺条件的优化主要是对碳源、氮源、无机盐离子、发酵时间、pH、装液量、接种量等的优化[7]，主要有正交试验法[12]和响应面法[13]。
为了获得高品质的黄原胶，提高地毯草黄单胞菌Xanthomonas axonopodisFJAT-10151产黄原胶的产量和质量，采用正交试验法对FJAT-10151发酵生产黄原胶的碳源、氮源、无机盐离子、发酵时间、pH、装液量和接种量等工艺条件进行优化，为其商业化应用提供指导。
1. 材料与方法
1.1 菌株
地毯草黄单胞菌Xanthomonas axonopodis FJAT-10151，保存于中国微生物菌种保藏中心。
1.2 培养基与试剂
氢氧化钠、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖均购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸购自浙江三鹰化学试剂有限公司；牛肉浸粉购自北京陆桥技术有限责任公司；酵母浸粉、蛋白胨、琼脂均购自北京奥博生物技术有限责任公司；玉米淀粉购自源叶生物；CaCl2、MgSO4、KH2PO4购自西陇化工股份有限公司，MnSO4购自天津市恒星化学试剂有限公司；FeSO4购自天津市福晨化学试剂厂；CuSO4购自天津市大茂化学试剂厂；以上试剂均为分析纯，豆饼粉为自制黄豆研磨粉。
活化培养基：TSB培养基(美国BD公司)；种子培养基：蔗糖20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、酵母浸粉5 g·L-1、pH7.0。发酵培养基：葡萄糖30 g·L-1、蛋白胨10 g·L-1、酵母浸粉10 g·L-1、KH2PO4 2.5 g·L-1、pH7.0，装液量为50 mL/250 mL。
1.3 发酵液的制备
菌种活化：将菌种FJAT-10151接种在TSB培养基上，于28℃恒温培养24 h；种子扩大培养：挑取FJAT-10151单菌落接种到种子培养基，30℃ 170 r·min-1培养16 h，扩大培养；摇瓶发酵：发酵培养基装液量50 mL/250 mL、接种量5%、28℃、170 r·min-1摇床培养72 h。
1.4 黄原胶提取方法
将发酵液离心分离，收集上清液。在上清液中加入3倍体积冰乙醇沉降黄原胶，4℃静置过夜。离心分离后，用无水乙醇洗涤3遍，氮气吹干，称量备用。
1.5 单因素试验
本研究分别选用30 g·L-1玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖为不同碳源，30 g·L-1豆饼粉为氮源，2 g·L-1 KH2PO4为无机盐离子，pH 7，装液量50 mL/250 mL、接种量5%、28℃、170 r·min-1摇床培养72 h后，制备黄原胶，每个处理设置3个平行重复，筛选发酵培养基的最优碳源。
选择最优碳源，如上述方法探讨氮源(30 g·L-1蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉、豆饼粉)、无机盐离子(2 g·L-1 KH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、CuSO4、MnSO4)、发酵时间(12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h)、pH、装液量(25、50、75、100、125 mL/250 mL)、接种量(2%、4%、6%、8%、10%)对黄原胶产量的影响。
1.6 正交试验
选择影响较大的3个因素：葡萄糖、豆饼粉、KH2PO4为发酵因素，每个因素各选3个水平，按L9(34)正交表设计发酵试验，每组3个平行，试验设计见表 1。
表 1 L9(34)正交试验分析因素与水平Table 1. Factors and levels of orthogonal experiment因素 因素/(g·L-1) 葡萄糖 豆饼粉 KH2PO4 -1 20 10 1 0 30 20 2 1 40 30 4 1.7 黄原胶质量的测定
苯酚-硫酸法[14]测定黄原胶中中性多糖的含量：0.1 g黄原胶溶于100 mL超纯水中，取0.4 mL黄原胶溶液，超纯水补足至1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和加3 mL浓硫酸，震荡混匀后沸水浴20 min，冷却至室温，在490 nm处测定吸光度，以葡萄糖为对照。
咔唑法[15]测定黄原胶中丙酮酸的含量：0.1 g黄原胶溶于100 mL超纯水中，取1 mL黄原胶溶液，超纯水补足至4 mL，加入10 mL浓硫酸硼砂溶液，冰浴冷却至4℃，沸水浴10 min后冰浴冷却至4℃。再加入0.2 mL咔唑试剂，摇匀，沸水浴15 min后冰浴冷却至4℃，在530 nm处测定吸光度，以葡萄糖醛酸为对照。
考马斯亮蓝法[16]测定黄原胶中蛋白的含量：0.1 g黄原胶溶于100 mL超纯水中，取1 mL黄原胶溶液，加入5 mL的考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，放置5 min后，在580 nm下比色测定吸光度，以牛血清白蛋白为对照。
1.8 地毯草黄单胞菌的透射电镜观察
离心发酵液收集菌体，超纯水洗涤3次，采用负染法对不同发酵时间的菌体进行透射电镜观察。用3%戊二醛固定样品后铜网底片，再用1%的磷钨酸染色，干燥后用透射电子显微镜观察。
2. 结果与分析
2.1 碳源对FJAT-10151黄原胶产量的影响
碳源对黄原胶产量的影响见图 1，以葡萄糖为碳源时，黄原胶的产量明显高于其他碳源，虽与以麦芽糖为碳源相当，但因葡萄糖价格比麦芽糖便宜，因此选择最优碳源为葡萄糖。
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图 1 黄原胶产量随碳源的变化注：图上不同字母表示经Duncan法检测在0.05水平上差异显著，下同。Figure 1. Change on xanthan gum production by varying carbon source2.2 氮源对FJAT-10151黄原胶产量的影响
氮源对黄原胶产量的影响见图 2，以豆饼粉为氮源时，黄原胶的产量明显高于其他氮源，差异显著，因此最优氮源为豆饼粉。
2.3 无机盐离子对FJAT-10151黄原胶产量的影响
无机盐的需求量虽然很少，但与菌体生长和发酵正常进行都有密切关系。本研究选用的无机盐离子对黄原胶产量的影响见图 3，添加KH2PO4使黄原胶的产量显著高于空白对照；添加MgSO4基本没有影响；添加CaCl2、CuSO4、FeSO4、MnSO4会抑制黄原胶的生产；只有添加适合的无机盐才能促进黄原胶的合成，因此选择最优无机盐为KH2PO4。
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图 3 黄原胶产量随无机盐离子的变化Figure 3. Change on xanthan gum production by varying inorganic salt addition2.4 发酵时间对FJAT-10151黄原胶产量的影响
发酵时间对黄原胶产量的影响见图 4，黄原胶的产量随发酵时间的延长而增大，当发酵时间超过72 h，黄原胶产量基本保持不变，所以选择最佳发酵时间为72 h。
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图 4 黄原胶产量随发酵时间的变化Figure 4. Change on xanthan gum production by varying fermentation 18:13:092.5 装液量对FJAT-10151黄原胶产量的影响
装液量不同导致体系中的氧含量不同，只有合适的装液量，才能满足空间的高效利用，利于体系通气，以及菌株对营养的摄入。本研究选用的装液量对黄原胶产量的影响见图 5，当装液量为25 mL/250 mL时，碳源的转化率高，但发酵后期由于营养物质不足阻碍发酵进行，从而影响黄原胶的产量；当装液量为75、100、125 mL/250 mL时，由于溶氧不足，营养物质未充分利用，碳源的转化率低，因而黄原胶产量也不高；当装液量为50 mL/250 mL，兼顾溶氧量和营养物利用率，利于黄原胶的合成，因此选择最优装液量为50 mL/250 mL。
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图 5 黄原胶产量随装液量的变化Figure 5. Change on xanthan gum production due to filled culture volume2.6 初始pH对FJAT-10151黄原胶产量的影响
发酵液初始pH对黄原胶产量的影响见图 6，初始pH 9.0时，黄原胶的产量最大，因此选择最优初始pH为9.0。
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图 6 黄原胶产量随初始pH的变化Figure 6. Change on xanthan gum production due to initial pH of medium2.7 接种量对FJAT-10151黄原胶产量的影响
接种量对黄原胶产量的影响见图 7，接种量为8%时，黄原胶的产量最大，且离散度最小，3个平行之间差异小，重现性好，利于工厂化生产，因此选择最优接种量为8%。
2.8 最优发酵培养基的选择
正交试验结果见表 2。培养基中选用葡萄糖30 g·L-1、豆饼粉30 g·L-1、KH2PO4 4 g·L-1(5号样本)时，黄原胶产量17.713 g·L-1最大。极差分析，比较R值，豆饼粉>葡萄糖>KH2PO4，说明豆饼粉对黄原胶产量的影响最大，无机盐离子KH2PO4对黄原胶产量的影响最小。黄原胶产量与葡萄糖和豆饼粉的质量浓度正相关，所以选择葡萄糖质量浓度40 g·L-1、豆饼粉质量浓度30 g·L-1；黄原胶产量与KH2PO4质量浓度不成正相关，当KH2PO4质量浓度为2 g·L-1时黄原胶的产量最大，对该质量浓度的培养基进行验证，黄原胶的产量为18.267 g·L-1。当葡萄糖30 g·L-1时的转化率为59.04%，40 g·L-1时的转化率为45.67%，综合考虑成本问题，选择葡萄糖30 g·L-1、豆饼粉30 g·L-1、KH2PO42 g·L-1为最优发酵培养基，黄原胶产量为21.0 g·L-1，是初始培养条件产量8.65 g·L-1[19]的2.43倍。
表 2 正交优化结果极差分析Table 2. Range analysis on orthogonal test results水平 因素/(g·L-1) 黄原胶产量
/(g·L-1)葡萄糖 豆饼粉 KH2PO4 1 40 30 1 15.29±1.83 2 20 20 4 13.61±1.22 3 40 10 4 11.14±0.55 4 20 30 2 14.39±0.48 5 30 30 4 17.71±1.02 6 40 20 2 16.34±0.19 7 30 20 1 13.83±0.43 8 30 10 2 12.07±0.37 9 20 10 1 9.51±0.09 低 20 10 1 - 中 30 20 2 - 高 40 30 4 - Ⅰ 0.625 0.545 0.644 - Ⅱ 0.713 0.730 0.713 - Ⅲ 0.727 0.790 0.708 - R 0.102 0.245 0.070 - 2.9 黄原胶质量的变化
黄原胶的品质测定见表 3，优化培养基后获得的黄原胶中丙酮酸含量升高，蛋白质含量降低，黄原胶品质更高。
表 3 黄原胶中中性糖、丙酮酸和蛋白质的含量Table 3. Neutral sugar, pyruvic acid and protein contents in xanthan gum produced from fermentation项目 中性糖
/%丙酮酸
/%蛋白质
/%标准曲线 葡萄糖 葡萄糖醛酸 牛血清白蛋白 相关系数(R2) 0.9980 0.9982 0.9980 黄原胶1 36.81 8.9 15.27 黄原胶2 25.3 16.3 4.8 注：黄原胶1：基础培养基提取的黄原胶[10]；黄原胶2：优化培养基后提取的黄原胶。中性糖线性方程为OD490nm=0.0331CGlu +0.1151；丙酮酸线性方程为OD530nm=15.256CGlcA+0.0782；蛋白质线性方程为OD580nm=0.0293CBSA +0.4233。 2.10 地毯草黄单胞菌的电镜观察
地毯草黄单胞菌FJAT-10151菌体的透射电镜扫描图如图 8所示，明显看到丝状的黄原胶，菌体外面形成了厚厚的荚膜，黄原胶聚集或缠绕在细胞表面，且许多菌体通过黄原胶连在一起。
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图 8 地毯草黄单胞菌FJAT-10151的透射电镜观察Figure 8. Electron microscopy of X. axonopodis FJAT-101513. 讨论与结论
黄原胶是次生代谢物，处于对数生长期的菌体细胞不合成分泌丝状的黄原胶，只有终止生长后的细胞才合成分泌丝状黄原胶[17]。本研究通过优化碳源、氮源、无机盐离子、发酵时间、pH、装液量、接种量等，缩短菌株的生长期和延长稳定期，从而提高黄原胶的产量。
本研究通过正交试验获得地毯草黄单胞菌FJAT-10151发酵生产黄原胶的最优工艺条件：葡萄糖30 g·L-1、豆饼粉30 g·L-1、KH2PO4 2 g·L-1、装液量50 mL/250 mL、初始pH 9.0、接种量8%、发酵时间72 h，黄原胶产量为21.0 g·L-1，是初始产量8.65 g·L-1[10]的2.43倍，提高了143%。
黄原胶中丙酮酸含量与其品质密切相关，它赋予黄原胶良好的拟塑性和低剪切速率下的高黏度特性[18]，田益玲等[19]利用丙酮酸含量控制黄原胶质量。通过不同菌种、不同工艺和配方获得的黄原胶，其丙酮酸含量差别很大[20]。地毯草黄单胞菌FJAT-10151在优化发酵工艺后，可以获得更高品质的黄原胶：丙酮酸含量从8.9%升高到16.3%，是程蓉等[21]优化野油菜黄单胞菌培养基获得黄原胶(丙酮酸含量4.82%)的3.4倍，是莫晓燕等[12]优化野油菜黄单胞菌培养基获得黄原胶(丙酮酸含量3.32%)的4.9倍；另外，蛋白质含量从15.27%降低到4.8%。
本研究优化生产黄原胶发酵工艺条件，提高了黄原胶的产量、改善了黄原胶的胶体性能。
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图 1 黄原胶产量随碳源的变化
注：图上不同字母表示经Duncan法检测在0.05水平上差异显著，下同。
Figure 1. Change on xanthan gum production by varying carbon source
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图 3 黄原胶产量随无机盐离子的变化
Figure 3. Change on xanthan gum production by varying inorganic salt addition
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图 4 黄原胶产量随发酵时间的变化
Figure 4. Change on xanthan gum production by varying fermentation 18:13:09
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图 5 黄原胶产量随装液量的变化
Figure 5. Change on xanthan gum production due to filled culture volume
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图 6 黄原胶产量随初始pH的变化
Figure 6. Change on xanthan gum production due to initial pH of medium
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图 8 地毯草黄单胞菌FJAT-10151的透射电镜观察
Figure 8. Electron microscopy of X. axonopodis FJAT-10151
表 1 L9(34)正交试验分析因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
因素 因素/(g·L-1) 葡萄糖 豆饼粉 KH2PO4 -1 20 10 1 0 30 20 2 1 40 30 4 
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表 2 正交优化结果极差分析
Table 2 Range analysis on orthogonal test results
水平 因素/(g·L-1) 黄原胶产量
/(g·L-1)葡萄糖 豆饼粉 KH2PO4 1 40 30 1 15.29±1.83 2 20 20 4 13.61±1.22 3 40 10 4 11.14±0.55 4 20 30 2 14.39±0.48 5 30 30 4 17.71±1.02 6 40 20 2 16.34±0.19 7 30 20 1 13.83±0.43 8 30 10 2 12.07±0.37 9 20 10 1 9.51±0.09 低 20 10 1 - 中 30 20 2 - 高 40 30 4 - Ⅰ 0.625 0.545 0.644 - Ⅱ 0.713 0.730 0.713 - Ⅲ 0.727 0.790 0.708 - R 0.102 0.245 0.070 -
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表 3 黄原胶中中性糖、丙酮酸和蛋白质的含量
Table 3 Neutral sugar, pyruvic acid and protein contents in xanthan gum produced from fermentation
项目 中性糖
/%丙酮酸
/%蛋白质
/%标准曲线 葡萄糖 葡萄糖醛酸 牛血清白蛋白 相关系数(R2) 0.9980 0.9982 0.9980 黄原胶1 36.81 8.9 15.27 黄原胶2 25.3 16.3 4.8 注：黄原胶1：基础培养基提取的黄原胶[10]；黄原胶2：优化培养基后提取的黄原胶。中性糖线性方程为OD490nm=0.0331CGlu +0.1151；丙酮酸线性方程为OD530nm=15.256CGlcA+0.0782；蛋白质线性方程为OD580nm=0.0293CBSA +0.4233。
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