Differentiation between Reciprocal-crossed Hybrids of Dendrobium officinale and D.huoshanense Using SSR Markers
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摘要: 以铁皮石斛与霍山石斛的正、反交F1代共63株为试验材料，利用SSR标记鉴定杂种真实性。结果表明，在21对石斛基因组引物中，筛选出双亲多态性引物3对，多态性引物占比为14.3%。用此3对引物可鉴定出铁皮石斛×霍山石斛杂交苗中25株真杂种，比例为78.1%，可鉴定出霍山石斛×铁皮石斛杂交苗中28株真杂种，比例为90.3%。Abstract: The authenticity of hybrids created by reciprocal crossing between Dendrobium officinale and D. huoshanense was not always apparent. To resolve the confusion, this study applied SSR markers to differentiate them among 63 F1 generation of the hybrids. Three out of 21 pairs of the SSR primers were found to have polymorphic bands, i.e., 14.3% of all, in the parental lines. By using these 3 pairs of primers, 25 out of 32 known (D. officinale×D. huoshanense) hybrids were correctly identified rendering a positive identification rate of 78.1%; while, 28 out of 31 known (D. huoshanense×D. officinale) hybrids were positively identified with a rate of 90.3%.
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Keywords:
- Dendrobium officinale /
- Dendrobium huoshanense /
- reciprocal cross /
- SSR /
- hybrid identification
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石斛Dendrobium为我国传统名贵中药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳及清音明目等功效。霍山石斛D. houshanense因其药用历史悠久、品质上乘[1-2]，被认为是石斛中的极品，但由于霍山石斛野生资源稀少，植株矮小，生长缓慢，栽培难度大，尚难以进行大规模产业化推广[2]，对霍山石斛的种质改良具有重要的现实意义。铁皮石斛D.officinale是药用栽培品种最为广泛的品种之一，与霍山石斛有较近的亲缘关系[4]，相对霍山石斛，铁皮石斛具有环境适应性高、生长迅速、生物产量大、规模化栽培成熟等优点，对铁皮石斛品质的改良也是铁皮石斛产业研究重点[5]。通过人工杂交聚合霍山石斛和铁皮石斛优良基因，可能选育出生长速度快，品质好的新品种。
传统的杂交后代真实性鉴定主要采用形态学方法，此种方法鉴定周期长，受环境条件影响大。DNA分子标记具有可靠性高，信息量大，检测方便等优点，特别是具有共显性特性的SSR标记已成功应用于葡萄[6-7]、竹[8]、玉米[9]等多种植物杂种真实性鉴定。在石斛属中，SSR标记已应用于不同种间及种内的亲缘关系研究[10-11]，但未见用于杂种鉴定的报道。本研究对铁皮石和霍山石斛的正、反交63株F1代进行杂种真实性鉴定，以期为石斛的遗传研究与新品种选育提供基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以铁皮石斛与霍山石斛为亲本材料，通过人工授粉进行正、反杂交，无菌萌发后通过单个种子形成的原球茎分离培育单株株系。以随机选择方式在正、反交单株株系中分别抽取32株、31株样品，剪取嫩叶样品置于-20℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取和检测
样品DNA的提取采用改良CTAB法。用紫外分光光度计检测DNA浓度和琼脂凝胶电泳检测DNA质量后，将样品DNA稀释至10 ng·μL-1至并于-20℃保存。
1.2.2 引物扩增及SSR反应扩增
2016年10月由上海华大基因公司合成21对SSR引物，其中11对引物参考邱道寿等[10]的方法合成，其中10对引物参考任羽等[11]的方法合成。引物序列见表 1。
表 1 用于SSR标记的引物序列Table 1. Sequences of SSR primers引物名称 上游引物
(5′-3′)下游引物
(5′-3′)目标片段长度
/bpDR31 AGAGGGAGAGTGCAAGAG CGCTATTTCCATCCCTCC 219~230 OA07 CCTATCCGAGGAGAACCATAA AAGCTTTGAGATTCTTTTGTGACT 160~174 OA08 AGGCAAAATATAACATACCTCAAT AATCAAGCCATTTATCTCCTCT 166~180 OA12 GCATTCTTTTGCCTAATTCAGGAA TCCACCCTTTCATCCAAATACTTC 163~287 OA15 ACAGCGTTAACATAAACCATAAGC CTGCCCGCAGATTCAGC 221~277 OA18 GGAACGGAGAAGATTAAGACAACC TGCCCTCACATGCCGTATT 179~217 OA20 CATATATTAGCCACTTCACTCTC ATGTCCACCTCCCTAAAATAGTA 222~266 OA24 GAGCAACGGGAGGGATAGAGATAT ACCTCTGTCTCCCTCTTGTCCATC 313~351 OA25 GGAAGGGCCTAAGTGGATG GCGTACCATGCTTAACATTCA 139~181 S122 GTGACTCGAGCCTTGGAATACG ACGCCGGTGAAAGAAGAAGAG 187~205 S130 CTCATGCATAAATTTAGGGTAGA ACAACACGAACAAGTAGTCATC 310~328 DM2 GAGTCGTAAGAGGCGAGTTGT AATGGATGGTATCTATGTCCGTAT 276~310 DM3 CTCCGGCGCTAGCTGTTGC TCACTTGCGGATGGGGAGC 178~200 DM88 AGCATTTTGAGATGGGATGATC ATTGTCCTCGCCGATATGAGTA 190~230 DM81 CTCCAATACCGATATGCTG TCGGCTACAGGTAAGTGG 100~115 DM123 ATAGTGGGATAAAGGCTTG ATCAGTATCCACAACATTTA 180~210 DM137 CTGACTGAGGTGCAGAGGTTTG CCTGATGATGAGTATGAAGAGCC 130~160 DM178 TCCTCCAGCTTAACACCATCA CGCCACCCTACACTAAGAAAA 290~310 DM186 GCCTTCTACAGCACGGGTCT GGAATCTGAAACCAGGAGGC 180~280 DM198 AAAAGCACTCAAAGACAAAATCAA GATGAGTGAGGGATGGGTGC 210~270 DM199 GTGTCTGCCCGAGTAAAAGC AGCTCACGGTTACCAGGTCT 216~235 SSR 20 μL PCR反应体系包括：2×Taq MasterMix，无菌水9 μL，SSR上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，58℃复性1 min，72℃延伸30 s，共40个循环后，72℃延伸7 min，于4℃保存PCR产物。扩增产物用8%聚丙烯酰胺凝胶上恒压电泳(120 V，70 min)，Ultra GelRed核酸染料染色20 min，用100 bp DNA ladder H3 RTU作为分子质量标记，凝胶成像系统观察结果并拍照记录。
1.2.3 杂种SSR鉴定
从21带备选引物中筛选出亲本都有明显条带的SSR引物，用于铁皮石斛杂种后代真假鉴定。后代扩增图谱中具有亲本特征条带的为真杂种，只有母本特征带的后代为假杂种[12]。
2. 结果与分析
2.1 引物筛选
将SSR引物组合在父母本中进行PCR扩增，引物在亲本中检测出的多态性条带为1~5个，经过多次试验，筛选出条带清晰、稳定的引物，最终选用了在父母本中均有多态性的引物用于杂种后代鉴定及验证。
在21对引物筛选中，其中扩增出有多态引物8对，占38.1%。根据有无父本特异位点，筛选出DM178、DM186、DM199引物用于铁皮石斛与霍山石斛的正、反后代鉴定。具有父本特异位点引物共有3对，占14.2%。
2.2 杂种后代的SSR鉴定结果
在霍山石斛×铁皮石斛杂种后代检测中，引物DM199鉴定率最高，共23株具有父本特异位点(图 1)，真杂种率达71.9%。引物DM178和DM186扩增中具有父本特异位点分别有14株和12株，真杂种率分别为43.8%和37.5%。3个引物都没检测到具有父本特异位点共有7株，占21.9%，为疑似假杂种。3个引物中至少有1个引物检测到具有父本特异位点共有25株，真杂种率为78.1%。
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图 1 引物DM199对霍山石斛×铁皮石斛杂种苗扩增结果注：M为Mark; ♀为霍山石斛; ♂为铁皮石斛; 1~32为杂交实生苗。图 2同。Figure 1. Amplification of primer DM199 in F1 (D. huoshanense×D. officinale) hybrid在铁皮石斛×霍山石斛杂种后代检测中，引物DM199鉴定率最高，31株后代中有23株具有父本特异位点(图 2)，真杂种率达74.2%。引物DM178和DM186扩增中具有父本特异位点分别有15株和12株，真杂种率分别为48.4%和38.7%。3个引物都没检测到具有父本特异位点共有3株，占9.7%，为疑似假杂种。3个引物中至少有1个引物检测到具有父本特异位点共有28株，真杂种率为90.3%。
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图 2 引物DM186对铁皮石斛×霍山石斛杂种苗扩增结果Figure 2. Amplification of primer DM199 in F1 (D. officinale×D. huoshanense)hybrid综合不同引物SSR标记结果，杂交后代中共有10株利用3个引物都没检测到具有父本特异位点，不能确定为真杂种。3个引物同时扩增出父本特异位点有7株，2个引物同时扩增出父本特异位点有33株；只有1个引物扩增出父本特异位点有13株。综合上述结果可知，铁皮石斛×霍山石斛正反交63株后代中，3个引物中共检测到有53株具有父本特异位点，占84.1%，可确定为真杂种(表 2)。不同引物标记鉴定结果有一定的重合，这种重合表明鉴定结果更准确。由此可见，在试验中可增加分子标记的引物数量提高杂种鉴定的准确性。
表 2 可扩增具有父本特征SSR引物Table 2. SSR markers with special bands from male parent杂交组合 引物 总株数 具有父本特征的株数 真杂种率/% 霍山石斛铁×皮石斛 DM178 32 14 43.8 Dendrobium huoshanense×Dendrobium officinale DM186 32 12 37.5 DM199 32 23 71.9 小计 32 25 78.1 铁皮石斛×霍山石斛 DM178 31 15 48.4 Dendrobium officinale×Dendrobium huoshanense DM186 31 12 38.7 DM199 31 23 74.2 小计 31 28 90.3 3. 讨论与结论
杂交育种是培育石斛新品种的重要途径，石斛是多年生草本植物，常规的人工杂交育种周期长，加上石斛属植物基因杂合性高，部分石斛可自花授粉结实等原因，杂交结实中实生苗可能存在自交后代苗，有必要对杂交后代实生苗进行早期杂种鉴定，早期去除假杂种后代，节约育种成本，提高育种效率。进行杂种鉴定的方法有细胞学鉴定，形态学鉴定，孢粉学鉴定及同工酶鉴定等多种方法，在实际应用中多采用形态学鉴定方法，但这种方法受外部环境的影响大，鉴定不够准确，周期长的缺点。
DNA分子标记鉴定技术是在DNA水平上鉴定亲本与杂交后代的遗传差异，具有不受环境影响、检测快速准确的优点。采用分子标记进行杂种鉴定已应用在多种作物，SSR标记为共显性，能够区分纯合位点和杂合位点，并且重复性及稳定性好[6]。目前，SSR标记技术已广泛地应用于品种纯度及真实性鉴定。李晓辉等[9]研究了72个亲本自交系的SSR标记遗传多态性，结果表明，用SSR核心引物组合和亲子鉴定标准，可对杂交种进行亲子鉴定。张婧等[13]仅用1对SSR引物可鉴定出全部的柳枝稷F1植株为真实杂交后代。本研究中使用的SSR标记鉴定出84.1%的单株为真实杂交后代，研究结果与以上研究结果相似。
杂交后代苗即使为真杂种，其扩增谱带也不一定是父母本条带之和，而会出现条带的缺失或新增。条带的缺失可能是在配子形成过程中染色体的交换引起突变或DNA分子碱基修饰引起的突变[14]，某些杂种位点在和引物结合时受到干扰或抑制，造成条带无法显示出来[15]，可以造成的位点丢失。所以本研究鉴定杂种真实性的方法是：具有父本特异位点为真杂种，没有父本特异位点为疑似假杂种。采用人工授粉杂交方法获得了铁皮石斛与霍山石斛正反交后代群体，并随机采集了63个样本。采用3对SSR引物鉴定杂交后代苗的杂交种的真伪性，尽管不同引物标记的鉴定结果不完全一致，但共有53株被其中1个以上的SSR标记鉴定为真实杂交种。由于石斛的生长周期长，形态学标记鉴定杂种真实性所需时间长，受环境影响大，难于鉴定出形态相似的材料，本研究表明SSR分子标记可有效应用于石斛杂交种鉴定。
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图 1 引物DM199对霍山石斛×铁皮石斛杂种苗扩增结果
注：M为Mark; ♀为霍山石斛; ♂为铁皮石斛; 1~32为杂交实生苗。图 2同。
Figure 1. Amplification of primer DM199 in F1 (D. huoshanense×D. officinale) hybrid
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图 2 引物DM186对铁皮石斛×霍山石斛杂种苗扩增结果
Figure 2. Amplification of primer DM199 in F1 (D. officinale×D. huoshanense)hybrid
表 1 用于SSR标记的引物序列
Table 1 Sequences of SSR primers
引物名称 上游引物
(5′-3′)下游引物
(5′-3′)目标片段长度
/bpDR31 AGAGGGAGAGTGCAAGAG CGCTATTTCCATCCCTCC 219~230 OA07 CCTATCCGAGGAGAACCATAA AAGCTTTGAGATTCTTTTGTGACT 160~174 OA08 AGGCAAAATATAACATACCTCAAT AATCAAGCCATTTATCTCCTCT 166~180 OA12 GCATTCTTTTGCCTAATTCAGGAA TCCACCCTTTCATCCAAATACTTC 163~287 OA15 ACAGCGTTAACATAAACCATAAGC CTGCCCGCAGATTCAGC 221~277 OA18 GGAACGGAGAAGATTAAGACAACC TGCCCTCACATGCCGTATT 179~217 OA20 CATATATTAGCCACTTCACTCTC ATGTCCACCTCCCTAAAATAGTA 222~266 OA24 GAGCAACGGGAGGGATAGAGATAT ACCTCTGTCTCCCTCTTGTCCATC 313~351 OA25 GGAAGGGCCTAAGTGGATG GCGTACCATGCTTAACATTCA 139~181 S122 GTGACTCGAGCCTTGGAATACG ACGCCGGTGAAAGAAGAAGAG 187~205 S130 CTCATGCATAAATTTAGGGTAGA ACAACACGAACAAGTAGTCATC 310~328 DM2 GAGTCGTAAGAGGCGAGTTGT AATGGATGGTATCTATGTCCGTAT 276~310 DM3 CTCCGGCGCTAGCTGTTGC TCACTTGCGGATGGGGAGC 178~200 DM88 AGCATTTTGAGATGGGATGATC ATTGTCCTCGCCGATATGAGTA 190~230 DM81 CTCCAATACCGATATGCTG TCGGCTACAGGTAAGTGG 100~115 DM123 ATAGTGGGATAAAGGCTTG ATCAGTATCCACAACATTTA 180~210 DM137 CTGACTGAGGTGCAGAGGTTTG CCTGATGATGAGTATGAAGAGCC 130~160 DM178 TCCTCCAGCTTAACACCATCA CGCCACCCTACACTAAGAAAA 290~310 DM186 GCCTTCTACAGCACGGGTCT GGAATCTGAAACCAGGAGGC 180~280 DM198 AAAAGCACTCAAAGACAAAATCAA GATGAGTGAGGGATGGGTGC 210~270 DM199 GTGTCTGCCCGAGTAAAAGC AGCTCACGGTTACCAGGTCT 216~235 
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表 2 可扩增具有父本特征SSR引物
Table 2 SSR markers with special bands from male parent
杂交组合 引物 总株数 具有父本特征的株数 真杂种率/% 霍山石斛铁×皮石斛 DM178 32 14 43.8 Dendrobium huoshanense×Dendrobium officinale DM186 32 12 37.5 DM199 32 23 71.9 小计 32 25 78.1 铁皮石斛×霍山石斛 DM178 31 15 48.4 Dendrobium officinale×Dendrobium huoshanense DM186 31 12 38.7 DM199 31 23 74.2 小计 31 28 90.3
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