番鸭Muscovy duck，又名麝香鸭，原产于中、南美洲，栖息于热带地区。番鸭性情温顺，不喜欢游水，具有一定飞翔能力。番鸭具有生长速度快、饲料报酬高、瘦肉率高、胴体脂肪含量低、具有野禽风味等优点。随着人们生活水平的不断提高，消费习惯的转变，对畜禽肌肉的风味和口感提出了更高的要求。动物体内的脂肪是影响肌肉品质极其重要的因素，同时，脂肪组织在维持动物机体正常的生理代谢和功能起着重要的作用。番鸭加工和烹饪的风味和品质都受到脂肪沉积量的影响。鸭的品种、饲养环境、饲料营养成分和遗传等因素均可影响鸭的脂肪沉积，其中遗传因素是由众多脂肪沉积相关功能基因所控制的^[1]。

脂肪型脂肪酸结合蛋白(Adipocyte fatty-acid binding protein, A-FABP)是脂肪酸结合蛋白中的一种，是细胞内蛋白质，最先在脂肪组织中被发现，并在脂肪细胞中高度表达，故得此名。脂肪型脂肪酸结合蛋白可以与脂肪酸结合，根据机体需要储存或释放脂肪酸，参与甘油三酯的形成和脂解过程，从而调节细胞内脂肪合成^[2-3]。郭晓敏等^[4]在雪山鸡A-FABP基因外显子1发现了1个同义突变，基因型为CC型、CT型和TT型，TT型个体的腿肌中C16:0脂肪酸含量显著高于CT型和CC型个体。在中国环颈雉群体中，A-FABP基因可检测到C1106T、C621G、C51T、G1223A 4个SNPs位点的多态性，共形成21种单倍型组合，其中H9H11和H1H4单倍型组合能提高屠宰性状和肌内脂肪含量^[5]。采用PCR-RFLP方法可在拜城油鸡公鸡群体中发现多态性，形成AA、AB和BB 3种基因型；18周龄时，BB型肌间脂宽显著高于AA型，BB型和AB型腹脂重、腹脂率显著高于AA型；24周龄时，BB型体重、肌间脂宽、腹脂重均显著高于AA型^[6]。赵旭庭等^[7]在樱桃谷鸭第2内含子中发现了A78T、T78C、T93C和C134T 4个单核苷酸突变，形成了AA型、AB型和BB型，其中BB型腹脂重、腹脂率显著高于AA型和AB型，BB型皮脂率和腿肌脂肪含量显著高于AB型。张海波等^[8]在樱桃谷鸭、金定鸭、苏牧麻鸭群体中检测到A-FABP基因第1内含子存在C377T、C409T、T422C、G945A、T965C、T967T、C974T、A1022T、C1059T 9处碱基突变，后6个突变形成的基因型对血清甘油三酯含量有一定影响。A-FABP基因包含了4个外显子和3个内含子，而目前报道的单核苷酸突变主要涉及外显子1、内含子1、内含子2，还有许多未知的突变位点没有被发现。在A-FABP基因点突变和禽类脂肪沉积、肌肉品质等指标的关联分析中发现起到重要作用的点突变不多，以A-FABP基因作为家禽脂肪沉积的候选基因的效果还不明显，尚需发掘更多的突变位点来进行验证，最终筛选出最适合的位点用于家禽育种。

本试验将PCR-SSCP和直接测序方法相结合，以期检测番鸭群体在A-FABP基因上是否存在单核苷酸多态，同时测定早期体重、13周龄屠宰性能和常规肉品质等指标，分析A-FABP基因单核苷酸多态与生产性能指标的相关性，以期为番鸭良种繁育提供参考。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验样品为同期出雏的健康黑羽番鸭，公鸭96只，母鸭66只，每个个体佩戴翅号，混群饲养。

1.2   试验设计

在饲养过程中，测定7个时间点的空腹体重，测定时间点为初生、2、4、6、8、10、13周龄。在最后一次称重结束后采血、屠宰，采血是抽取翅静脉血，用肝素钠抗凝，5 000 r·min^-1离心2 min，留取红细胞用于提取基因组DNA。在13周龄时对饲养番鸭进行屠宰性能和肉品质测定，屠宰性能测定包括了宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重，并计算相应的比例；肉品质测定包括了pH值、剪切力、失水率，各个指标测定方法参考中华人民共和国农业行业标准NY/T823-2004。

1.3   引物设计

根据A-FABP基因序列设计引物F1和F2，扩增外显子1、部分内含子2和外显子3，引物的基本信息见表 1。

表  1  引物基本信息

Table  1.  Basic information of primers

引物名称	核苷酸序列5′-3′	扩增区域	产物长度 /bp	退火温度 /℃
F1	F：TCATACTATCTTCCCGTCTT	外显子1	194	56
	R：ATTCAGCATTCCTTCCCTTT
F2	F：TCTTCAGTCCATAGCACCCC	部分内含子2、外显子3	171	57
	R：AAAAGGAACTCACCACCACC

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.4   基因组DNA的制备

取10 μL血液红细胞、470 μL细胞裂解液(成分浓度：0.1 mol·L^-1 NaCl，10 mmol·L^-1 Tris-Cl，100 mmol·L^-1 EDTA pH8.0)、10 μL SDS(10%)和10 μL蛋白质酶K(10 μg·mL^-1)进行混合，放置于55℃环境中轻轻摇荡过夜，然后采用酚/氯仿法抽提和乙醇沉淀法获取基因组DNA，将提取好的基因组DNA溶于超纯水中，测定DNA质量，并调整质量浓度为50~100 ng·μL^-1。

1.5   PCR-SSCP法检测多态性

以番鸭基因组DNA为模板，分别对2对引物进行PCR扩增，PCR总反应体系为25 μL，其中10×buffer(无Mg²⁺) 2.5 μL、10 mmol·L^-1的dNTPs 2 μL、25 mmol·L^-1的MgCl₂ 1.5 μL、5 U·μL^-1 Taq酶0.2 μL、10 pmol·L^-1上下游引物各1 μL、100 ng·μL^-1 DNA模板1 μL、加ddH₂O至25 μL。

PCR扩增条件：94℃变性5 min；94℃ 30 s，55/57℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保温。

扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，然后经过凝胶成像系统拍摄照片查看PCR扩增效果，如果PCR产物在琼脂糖凝胶中只有一条带，而且比较清晰，产物片段大小又和试验设计一致，那么就可以进行SSCP检测。SSCP检测采用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染法凝胶染色，最后根据凝胶中的条带分布情况来判断基因型。

1.6   对有多态性片段进行测序

根据基因型的判定结果，查看纯合子的种类，每种纯合子选择1个代表性的样品进行琼脂糖凝胶电泳，再用试剂盒纯化回收PCR产物并进行克隆，挑选出阳性菌落进行培养提取质粒，酶切鉴定后送上海桑尼生物科技有限公司测序分析，通过软件比对不同基因型的PCR产物测序序列，获得突变位置和突变类型。

1.7   数据处理

统计群体在各个多态位点的各种基因型的数量，计算它们在各个品种中的频率，统计群体遗传信息参数，了解品种之间基因型分布存在差异情况。运用SPSS 13.0软件分析番鸭生产性能在不同基因型之间是否存在显著性差异。

2.   结果与分析

2.1   PCR-SSCP检测结果和测序分析

用设计的引物对基因组DNA进行PCR扩增，经过琼脂糖凝胶电泳检测，2对引物的PCR产物条带单一，大小与预测结果一致。采用SSCP方法检测发现引物F2扩增的片段上存在多态性(图 1)，共出现3种基因型，其中纯合型定义为AA型和BB型，杂合型为AB型。

图  1  引物F2的PCR-SSCP结果

Figure  1.  PCR-SSCP of primer F2

下载: 全尺寸图片 幻灯片

通过比较AA型和BB型的核苷酸序列发现两者之间发生了A-C突变，此位点位于第2内含子第201处(图 2)。

图  2  纯合基因型之间序列突变

Figure  2.  Sequence mutation in homozygous genotype

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   群体遗传信息统计

在番鸭群体中AA型、AB型和BB型的基因型频率分别为0.679 0、0.290 1和0.030 9，AA型所占比例要明显高于AB型和BB型。番鸭群体以A等位基因为优势等位基因，其基因频率为0.824 1，而B等位基因频率较低，只有0.175 9。番鸭群体的纯合度、杂合度和多态信息含量分别为0.710 0、0.290 0和0.247 9。

2.3   不同基因型群体体重分析

在多重比较分析中样本数低于3以下的无统计学意义，本试验中公、母鸭的BB型样本数少于3个，未列入统计。由表 2可知，除第2、4周龄外，公鸭AA型体重显著高于AB型；母鸭体重在各个测定时期不同基因型之间均无显著性差异。

表  2  不同周龄番鸭体重在基因型之间的差异

Table  2.  Body weights of muscovy ducks with different genotypes and ages

(单位/g)
周龄 /周	公鸭不同基因型体重(样本量N)			母鸭不同基因型体重(样本量N)
	AA(66)	AB(28)		AA(47)	AB(19)
0	50.8±4.62a	47.4±3.66b		49.0±3.22ab	48.2±3.56b
2	324.0±34.55a	325.8±31.37a		297.1±26.47b	292.7±35.74b
4	818.6±92.03a	793.9±93.95a		633.1±68.41b	639.6±77.50b
6	1598.6±176.30a	1514.1±158.02b		1177.4±108.43c	1210.3±150.46c
8	2235.4±248.78a	2056.5±221.16b		1544.1±138.72c	1563.5±153.46c
10	2784.5±286.29a	2583.8±335.92b		1780.4±150.96c	1796.0±136.21c
13	3178.4±317.73a	2979.6±320.03b		1884.8±175.27c	1916.8±154.42c
注：同行数据后字母相同表示基因型之间数据无显著差异(P>0.05)，字母不同表示基因型之间存在显著性差异(P＜0.05)，下表同。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   不同基因型群体屠宰性能比较

由表 3可知，AA型公鸭的宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重、腹脂重、腹脂率指标显著高于AB型。在母鸭中，AA型腹脂重、腹脂率显著高于AB型。

表  3  不同基因型公、母鸭群体屠宰性能

Table  3.  Indices on slaughtered carcass of muscovy ducks of different genotypes

项目	公鸭基因型(样本量N)			母鸭基因型(样本量N)
	AA(48)	AB(21)		AA(42)	AB(18)
宰前活重/g	3219.0±279.65a	2999.4±342.79b		1905.6±175.99c	1918.9±159.04c
屠体重/g	2946.3±257.63a	2765.5±309.44b		1719.4±165.14c	1730.0±159.27c
屠宰率/%	91.58±3.41ab	92.24±1.75a		90.21±2.04b	90.13±2.89b
半净膛重/g	2747.7±254.6a	2563.5±299.7b		1571.5±162.8c	1596.7±160.8c
半净膛率/%	85.34±2.58a	85.46±1.80a		82.45±3.29b	83.12±2.89b
全净膛重/g	2548.6±244.14a	2382.3±264.85b		1430.5±150.71c	1451.7±137.34c
全净膛率/%	79.18±3.67a	79.48±2.38a		75.70±4.69b	75.63±2.84b
胸肌重/g	460.2±54.99a	418.4±57.63b		267.7±34.21c	263.8±32.51c
胸肌率/%	18.05±1.18ab	17.47±1.84b		18.71±1.25a	18.17±1.37ab
腿肌重/g	296.9±39.17a	287.9±41.62a		143.8±15.34b	152.1±14.95b
腿肌率/%	11.65±1.20a	12.18±1.95a		10.09±0.84b	10.50±0.88b
腹脂重/g	45.9±8.07a	36.7±8.04b		42.7±7.56a	37.3±6.18b
腹脂率/%	1.81±0.35c	1.54±0.34d		2.97±0.53a	2.56±0.38b

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.5   不同基因型群体常规肉品质的比较

由表 4可知，在公、母鸭胸肌、腿肌中不同基因型之间pH值、剪切力、失水率均无显著差异。

表  4  不同基因型间肌肉常规肉品质比较

Table  4.  The comparison of muscle common meat quality among different genotypes

部位	项目	公鸭基因型(样本量N)			母鸭基因型(样本量N)
		AA(48)	AB(21)		AA(42)	AB(18)
胸肌	pH	6.02±0.38a	6.08±0.19a		5.95±0.17a	6.00±0.18a
	剪切力/N	30.61±5.18ab	32.29±7.17a		27.77±5.97b	29.09±6.25ab
	失水率/%	37.00±3.55a	37.64±5.24a		37.28±3.31a	35.79±4.49a
腿肌	pH	6.27±0.34 a	6.19±0.21a		6.23±0.15a	6.28±0.14a
	剪切力/N	34.08±5.44a	34.48±6.28a		32.00±6.09a	33.53±6.12a
	失水率/%	33.94±4.74a	32.31±4.95ab		29.41±4.82c	30.06±3.04bc

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

A-FABP基因对禽类脂肪沉积有着重要的作用，寻找禽A-FABP基因存在的单核苷酸多态，并分析其与生产性能的相关性，对群体选择具有指导性意义。鸭A-FABP基因的点突变研究已经取得一定进展，在山麻鸭、巢湖鸭、金定鸭等9个我国地方鸭品种群体中，A-FABP基因在第1内含子中存在6个单核苷酸突变，分别为A923G、T943C、C945T、T952C、T1000A和C1037T，大多数鸭品种之间基因型频率存在显著性差异^[9]。樱桃谷鸭A-FABP基因第2内含子中存在A78T、T78C、T93C和C134T 4个单核苷酸突变^[7]。前面所述的山麻鸭、巢湖鸭等我国地方鸭品种和樱桃谷鸭等均属于河鸭属，而番鸭属于栖鸭属，它们和河鸭属在基因组序列上存在一定的差异，故A-FABP基因存在的单核苷酸多态也不一样。张海波等在番鸭群体中A-FABP基因第一内含子第1074、1089处分别发现了T-G、A-C突变，而在金定鸭、樱桃谷鸭等河鸭第一内含子中发现了C337T、C409T、T422C、G945A、T965C、T967C、C974T、A1022T等8处突变^[10]。在本试验中所研究的对象是番鸭，设计的引物用于扩增番鸭A-FABP基因外显子1、部分内含子2和外显子3，在番鸭群体中只发现了1个A-C突变，位于第2内含子第201处碱基。在番鸭群体中共存在AA、AB、BB 3种基因型，基因型频率分别为0.679 0、0.290 1和0.030 9，A等位基因频率显著性高于B等位基因频率，说明了番鸭群体中B等位基因是由A等位基因突变而来的可能性较高。群体杂合度和多态信息含量一般可以用来衡量群体多态性丰富程度，本试验番鸭群体纯合度为0.710 0，杂合度为0.290 0，多态信息含量为0.247 9，为低度多态。一般情况下群体杂合度和多态信息含量值越小，说明群体可选择的潜力越小。本试验的番鸭正处于选育阶段，可能前期的选择已经对此位点产生了间接的影响，采用常规的方法再对此位点的选择效果比较小，但是可以通过分子标记技术进行基因型确定，选配得到所需要的基因型个体。

A-FABP可以与细胞内脂肪酸进行结合，其工作原理是将脂肪酸运输到氧化场所，通过调节脂肪酸的浓度来控制体内脂类代谢过程。本试验分析了A-FABP基因多态位点对番鸭早期体重和屠宰性能的影响，结果发现除第2、4周龄外，AA型公鸭早期体重显著性高于AB型公鸭，母鸭不同基因型之间无显著性差异，这可能与公、母鸭的生长速度不同有关，公鸭早期体重增速快，个体之间容易拉开差距，而母鸭个体相对小，在前期生长过程中个体之间差距小，在10周龄左右，公番鸭体重是母番鸭的1.5倍左右。在屠宰性能测定时，不同基因型间公鸭的宰前活重、屠体重、半净膛重、全净膛重、胸肌重等差异结果与体重的结果一致。在脂肪沉积方面，AA型公、母鸭的腹脂重和腹脂率显著性高于同性别的AB型鸭，说明A-FABP基因的突变对脂肪沉积有显著影响。这与Wang等^[11]在鸡上的报道较为相似，他们采用PCR-RFLP方法分析了2个系鸡群A-FABP基因多态性，发现该基因与腹脂重、腹脂率有关联，并推断A-FABP基因是影响腹脂沉积的重要基因或与其相连锁。罗桂芬等^[12]在北京油鸡A-FABP基因第1内含子中发现了多态，不同基因型之间腹脂率、皮脂率和肌内脂肪存在极显著差异，这与本试验结果较为相似，但是他们在北京油鸡中发现体重在不同基因型间无显著性差异，而本研究在番鸭公鸭发现不同基因型之间存在显著性差异。常规肉质性状在一定程度上可以反映肉质的优劣，在本试验中，相同性别番鸭不同基因型之间在同样肌肉组织中常规肉质指标均不存在显著性差异，说明A-FABP在该位点的突变不能影响番鸭肌肉品质，这可能与番鸭脂肪沉积能力较低有关，使得肌肉组织中的脂肪沉积量较低。