野莴苣及其近似种间亲缘关系研究

林玲; 虞赟; 陈智明; 王德玲; 沈建国; 伏建国

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2017.10.006

野莴苣及其近似种间亲缘关系研究

林玲^{1, 2,},
虞赟^2, ,,
陈智明³,
王德玲⁴,
沈建国²,
伏建国⁵

1.
泉州出入境检验检疫局, 福建泉州 362000
2.
福建出入境检验检疫局技术中心, 福建福州 350001
3.
福州出入境检验检疫局, 福建福州 350015
4.
福建农林大学, 福建福州 350002
5.
江苏出入境检验检疫局, 江苏南京 210000

基金项目:

国家质检总局科技计划项目 2015IK043

国家质检公益性行业科研专项 201410076

福建省科技计划重大专项 2017NZ0003-1-7

详细信息

作者简介:
林玲(1980-), 女, 农艺师, 研究方向:植物检疫(E-mail:303880739@qq.com)

通讯作者:
虞赟(1981-), 女, 高级农艺师, 研究方向:植物检疫(E-mail:3900091@qq.com)

中图分类号: Q78
计量
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出版历程
- 收稿日期: 2017-07-15
- 修回日期: 2017-09-07
- 刊出日期: 2017-10-27

Genetic Comparisons Between Lactuca pulchella (Pursh) DC and Its Closely Related Lettuce Species

1.
Quanzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Quanzhou, Fujian 362000, China
2.
Inspection & Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau/Fujian Key laboratory for Technology Research of Inspection and Quarantine, Fuzhou, Fujian 350001, China
3.
Fuzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou, Fujian 350015, China
4.
Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
5.
Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing Jiangsu 210000, China

摘要

摘要: 利用PCR方法对野莴苣及其11种近似种DNA进行扩增，获得ITS、matK 和rbcL 序列，分析遗传相似系数和聚类分析图谱，探讨野莴苣及其近似种的亲缘关系。通过野莴苣及其近似种ITS序列分析发现：野莴苣和生菜、莴苣、毒莴苣的相似性分别为93.6%、93.1%、92.6%，野莴苣与乳苣的相似性仅为87.8%；matK 序列研究发现：野莴苣和生菜、莴苣、毒莴苣的相似性分别为99.2%、99.0%、99.1%，而野莴苣与乳苣的相似性仅为98.3%，结果表明，野莴苣与莴苣属的生菜、莴苣、毒莴苣的亲缘关系更近，与乳苣属的乳苣亲缘关系次之。通过对比rbcL 序列发现：野莴苣和生菜相似度达100%，与莴苣、翅果菊、毒莴苣、刺毛莴苣、宿根莴苣的相似度均达99.7%，而野莴苣与乳苣的相似度却为99.4%，将野莴苣归为莴苣属更加合理。
- 野莴苣 /
- 近似种 /
- 亲缘关系
Abstract: The genetic similarity coefficients and cluster analysis maps on Lactuca pulchella (Lp) and its 11 closely related species were obtained by using PCR to amplify ITS, matK and rbcL gene from the total DNA fragments of the lettuce varieties. Based on the ITS sequences, a similarity between Lp and L. sativa var. ramose was found to be 93.6%; between Lp and L. sativa , 93.1%; between Lp and L. serriola , 92.6%;and, between Lp and Mulgedium tataricum , the lowest at 87.8%. According to the matK sequences, a similarity between Lp and L. sativa var. ramose was shown to be 99.2%;between Lp and L. sativa , 99.0%, ; between Lp and L. serriol , 99.1%; and, between Lp and M.tataricum , 98.3%. It appeared that Lp was related closer to the Lactuca species than Mulgedium . By comparing the rbcL , Lp and L. sativa L. var. ramosa had a perfect match with a 100% similarity; whereas, Lp and L. sativa , L. indica , L.serriola , L. hirsute or L. perennis , at 99.7%;and, Lp and M. tataricum , at 99.4%. Consequently, it was concluded that Lp belonged to the genus Lactuca .
- Lactuca pulchella /
- closely related species /
- genetic relationship

HTML全文

野莴苣是我国重要的进境检疫性有害杂草^[1], 在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中其拉丁名为： Lactuca pulchella (Pursh) DC.。野莴苣的学名较为混乱，分类地位不明确，其中文名也与毒莴苣L.serriola L.相混淆^[2-8]。近年，科学家们在利用分子生物学方法对植物类群进行识别和鉴定方面做了大量研究^[9-18]，鉴于野莴苣在我国口岸鲜有截获，也未见有分布报道，野莴苣相关研究在我国尚属空白。本研究根据国际生命条形码联盟推荐的鉴定陆地植物的核心DNA条形码及辅助条形码^[19]中的核糖DNA片段ITS(Internal Transcribed Spacer)、叶绿体matK (Maturase K)和rbcL (ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase Large Gene)，分析野莴苣及其近似种乳苣Mulgedium tataricum (L.) DC.、莴苣Lactuca sativa L.、翅果菊Lactuca indica L.等12个材料的ITS、matK 和rbcL 序列，以期厘清野莴苣的分类地位，及其与近似种的亲缘关系。

1. 材料和方法

1.1 材料

供试材料为野莴苣及其近似种，12个样品如表 1所示。

表 1 供试材料名称

Table 1. Test materials

试验编号	名称	拉丁名
A1	生菜	Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.
A2	苣荬菜	Sonchus arvensis L.
A3	莴苣	L.sativa L.
A4	苦苣菜	S. oleraceus L.
A5	翅果菊	L. indica L.
A6	毒莴苣	L. serriola L.
A7	刺毛莴苣	L. hirsuta Muhl. ex Nutt.
A8	黄鹌菜	Youngia japonica (L.)DC.
A9	乳苣	Mulgedium tataricum (L.) DC.
A10	宿根莴苣	L. perennis L.
A11	雀苣	L. viminea L.
A12	野莴苣	L.pulchella (Pursh) DC.

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1.2 方法

1.2.1 引物选取

利用NCBI数据库中已经报道过的野莴苣近似种相关ITS、matK 序列，并根据Primer Premier 5.0软件设计ITS、matK 引物。选取引物ITS、matK 和通用引物rbcL 进行扩增，扩增反应所使用的引物序列详见表 2。

表 2 PCR所用引物序列

Table 2. Primers used for PCR

引物名称	引物序列(5'-3')	目标片断 /bp
ITS-F	GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG	722
ITS-R	TCCTCCGCTTATTGATATGC
matK -F	ATACCTTACCCAGCCCATCT	580
matK -R	AGCATTTGACTGCGTACCAT
rbcL -F	ATGTCACCACAAACAGAAAC	718
rbcL -R	TCGCATGTACCTGCAGTAGC

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1.2.2 植物DNA提取

使用北京天根生化科技有限公司所生产的植物基因组DNA试剂盒提取。

1.2.3 PCR扩增反应程序

经优化条件后，建立PCR反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环；72℃延伸10 min；4℃保温。

1.2.4 PCR扩增反应体系

序列扩增时采用引物1和引物2，PCR扩增反应为50 μ L体系，其组成成分见表 3。2×Taq PCR MasterMix由Promega公司生产。

表 3 PCR扩增反应体系

Table 3. PCR amplification reaction system

成分	体积/μ L
2×Taq PCR MasterMix	25
引物-F	2
引物-R	2
ddH₂O	18
DNA template	3
总体积	50

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1.2.5 序列测定与分析

PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序完成后的序列，在NCBI数据库的DNA序列进行比对, 验证测序的准确性，并对野莴苣及其11个近似种进行亲缘关系分析。

1.3 亲缘关系分析方法

通过对利用引物ITS、matK 和rbcL 得到的DNA序列进行分析比较，并用DNAMAN软件绘制遗传相似系数和聚类分析图谱。

2. 结果与分析

通过利用DNAMAN软件对野莴苣及其11个近似种共12个材料DNA序列比对分析，得到亲缘关系分析图表(表 4~6、图 1)。

表 4 野莴苣及其近似种ITS序列的遗传相似系数

Table 4. Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on ITS sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	81.0	100
A3	100	82.5	100
A4	80.3	91.2	81.9	100
A5	91.2	81.4	91.8	81.6	100
A6	100	82.8	100	82.1	91.9	100
A7	88.7	77.2	88.7	78.0	96.3	88.7	100
A8	82.6	80.6	83.9	80.4	82.1	84.1	77.2	100
A9	93.0	81.7	93.5	80.8	91.5	93.6	87.8	83.5	100
A10	85.7	78.4	85.4	77.1	87.0	85.6	86.1	78.0	85.0	100
A11	74.6	74.8	75.7	73.9	75.9	75.8	71.1	74.6	76.7	74.5	100
A12	93.6	78.4	93.1	77.3	87.3	92.6	84.6	80.4	87.8	82.5	74.2	100
注：A1为生菜；A2为苣荬菜；A3为莴苣；A4为苦苣菜；A5为翅果菊；A6为毒莴苣；A7为刺毛莴苣；A8为黄鹌菜；A9为乳苣；A10为宿根莴苣；A11为雀苣；A12为野莴苣。下表同。

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表 5 野莴苣及其近似种matK 序列的遗传相似系数

Table 5. Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on matK sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	97.9	100
A3	99.8	98.0	100
A4	97.7	99.2	97.7	100
A5	98.1	96.7	98.6	96.9	100
A6	99.8	98.0	100	97.7	98.6	100
A7	98.6	97.5	99.0	97.1	97.9	98.9	100
A8	98.1	98.2	98.2	97.9	97.3	98.2	97.3	100
A9	98.1	96.7	98.6	96.9	100	98.6	97.9	97.3	100
A10	98.8	97.3	98.8	97.1	97.7	98.9	98.1	97.8	97.7	100
A11	96.7	97.3	97.4	96.7	96.7	97.3	97.0	97.6	96.7	96.5	100
A12	99.2	97.5	99.0	97.5	98.2	99.1	98.4	97.8	98.3	98.1	96.7	100

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表 6 野莴苣及其近似种rbcL 序列的遗传相似系数

Table 6. Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on rbcL sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	99.1	100
A3	100	99.0	100
A4	99.0	100	99.1	100
A5	100	99.0	100	99.1	100
A6	100	99.0	100	99.1	100	100
A7	100	99.0	100	99.1	100	100	100
A8	98.9	99.2	99.0	99.2	99.0	99.0	99.0	100
A9	99.8	98.7	99.7	98.7	99.7	99.7	99.7	98.7	100
A10	100	93.0	93.6	99.1	93.9	94.0	93.6	93.5	93.7	100
A11	99.2	99.2	99.2	99.5	99.2	99.2	99.2	99.3	98.9	92.0	100
A12	100	98.8	99.7	99.1	99.7	99.7	99.7	98.6	99.4	99.7	98.9	100

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图 1 野莴苣及其近似种的聚类分析

Figure 1. Cluster analysis on L. pulchella and its close relative species

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从野莴苣及其近似种ITS序列的遗传相似系数(表 4)和聚类分析图谱(图 1)可以看出，莴苣和生菜、毒莴苣的相似性高达100%，验证了生菜、莴苣、毒莴苣为同一属植物；野莴苣和生菜、莴苣、毒莴苣的相似性相对较高，分别为93.6%、93.1%、92.6%；而野莴苣与乳苣的相似性仅为87.8%；野莴苣与其他供试材料黄鹌菜、苣荬菜、苦苣菜相似性更低，分别为80.4%、78.4%、77.3%。生菜、莴苣、毒莴苣均为莴苣属，说明野莴苣与莴苣属的亲缘关系更近，乳苣为乳苣属，表明野莴苣与乳苣属的亲缘关系次之，与供试的其他属近似种的亲缘关系则更远。

野莴苣及其近似种matK 序列的遗传相似系数(表 5)和聚类分析图谱(图 1)发现，莴苣和毒莴苣的相似性高达100%；野莴苣和生菜、毒莴苣、莴苣的相似性相对较高，分别为99.2%、99.1%、99.0%；而野莴苣与乳苣的相似性仅为98.3%，野莴苣与供试的其他近似种的相似系数均低于99%，结果表明野莴苣与生菜、莴苣、毒莴苣的亲缘关系更近，野莴苣与乳苣等其他供试近似种的亲缘关系次之。同时也说明了野莴苣与莴苣属的亲缘关系比野莴苣与乳苣属的亲缘关系更相近。

野莴苣及其近似种rbcL 序列的遗传相似系数(表 6)和聚类分析图谱(图 1)表明，野莴苣和生菜相似度达100%，与莴苣、毒莴苣、刺毛莴苣、宿根莴苣等莴苣属近似种的相似度均达到99.7%，而野莴苣与乳苣的相似度却为99.4%，再次说明野莴苣与莴苣属的亲缘关系更为接近，与乳苣属的亲缘关系次之。从试验结果也可看出，rbcL 序列的遗传相似系数都极为接近，均达到98%以上，仅仅依靠此数据难以将乳苣属和莴苣属进行准确区分。

比较野莴苣及其近似种的ITS序列、matK 序列和rbcL 序列的遗传相似系数和聚类分析图谱，将野莴苣归为莴苣属更为合理，部分文献[2]将其划入乳苣属欠妥。

3. 讨论与结论

野莴苣现分布于美国、加拿大，我国尚未有分布的报道。野莴苣为我国进境检疫性有害杂草，由于其可危害蔬菜、牧草及大田等作物，严重影响作物生长，且极难防除，因此，澳大利亚、秘鲁等国家也将其列入危险性杂草。

目前，野莴苣的分类地位较为混乱。《北美植物志》中将野莴苣划入乳苣属，定名为Mulgedium pulchellum (Pursh) G. Don^[2]；然而《密苏里植物志》甚至将野莴苣与乳苣(异名：L.tatarica)定义为同一种植物^[3]；美国农业部却将野莴苣定名为L. tatarica (L.) C.A. Mey. var. pulchella (Pursh) Breitung，认为其是乳苣的变种^[4]。《中国植物志》及相关研究学者将L. seriola 称为“野莴苣”^[5-6]，甚至将野莴苣作为毒莴苣的异名^[7]，然而在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》里L. serriola 被命名为毒莴苣，L.Pulchella 则被命名为野莴苣^[1]。此外还发现野莴苣的还有异名M.tataricum (L.) C.A.Mey，从而造成了野莴苣的分类地位和学名较为混乱^[8]。

本研究通过对野莴苣及其近似种12个样品的DNA进行提取，探讨其ITS、matK 和rbcL 序列，分析遗传相似系数和聚类分析图谱，结果表明，野莴苣与莴苣属Lactuca L.的亲缘关系更近，与乳苣属Mulgedium . Cass.的亲缘关系次之。因此，将野莴苣归为莴苣属更为合理。

由于野莴苣及其近似种种间亲缘关系属性有交叉，因此，在今后的研究中，可继续寻找其他序列用于研究，将不同序列分析比对，从而更好地分析野莴苣及其近似种的亲缘关系。

图 1 野莴苣及其近似种的聚类分析

Figure 1. Cluster analysis on L. pulchella and its close relative species

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表 1 供试材料名称

Table 1 Test materials

试验编号	名称	拉丁名
A1	生菜	Lactuca sativa L. var. ramosa Hort.
A2	苣荬菜	Sonchus arvensis L.
A3	莴苣	L.sativa L.
A4	苦苣菜	S. oleraceus L.
A5	翅果菊	L. indica L.
A6	毒莴苣	L. serriola L.
A7	刺毛莴苣	L. hirsuta Muhl. ex Nutt.
A8	黄鹌菜	Youngia japonica (L.)DC.
A9	乳苣	Mulgedium tataricum (L.) DC.
A10	宿根莴苣	L. perennis L.
A11	雀苣	L. viminea L.
A12	野莴苣	L.pulchella (Pursh) DC.

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表 2 PCR所用引物序列

Table 2 Primers used for PCR

引物名称	引物序列(5'-3')	目标片断 /bp
ITS-F	GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG	722
ITS-R	TCCTCCGCTTATTGATATGC
matK -F	ATACCTTACCCAGCCCATCT	580
matK -R	AGCATTTGACTGCGTACCAT
rbcL -F	ATGTCACCACAAACAGAAAC	718
rbcL -R	TCGCATGTACCTGCAGTAGC

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表 3 PCR扩增反应体系

Table 3 PCR amplification reaction system

成分	体积/μ L
2×Taq PCR MasterMix	25
引物-F	2
引物-R	2
ddH₂O	18
DNA template	3
总体积	50

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表 4 野莴苣及其近似种ITS序列的遗传相似系数

Table 4 Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on ITS sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	81.0	100
A3	100	82.5	100
A4	80.3	91.2	81.9	100
A5	91.2	81.4	91.8	81.6	100
A6	100	82.8	100	82.1	91.9	100
A7	88.7	77.2	88.7	78.0	96.3	88.7	100
A8	82.6	80.6	83.9	80.4	82.1	84.1	77.2	100
A9	93.0	81.7	93.5	80.8	91.5	93.6	87.8	83.5	100
A10	85.7	78.4	85.4	77.1	87.0	85.6	86.1	78.0	85.0	100
A11	74.6	74.8	75.7	73.9	75.9	75.8	71.1	74.6	76.7	74.5	100
A12	93.6	78.4	93.1	77.3	87.3	92.6	84.6	80.4	87.8	82.5	74.2	100
注：A1为生菜；A2为苣荬菜；A3为莴苣；A4为苦苣菜；A5为翅果菊；A6为毒莴苣；A7为刺毛莴苣；A8为黄鹌菜；A9为乳苣；A10为宿根莴苣；A11为雀苣；A12为野莴苣。下表同。

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表 5 野莴苣及其近似种matK 序列的遗传相似系数

Table 5 Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on matK sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	97.9	100
A3	99.8	98.0	100
A4	97.7	99.2	97.7	100
A5	98.1	96.7	98.6	96.9	100
A6	99.8	98.0	100	97.7	98.6	100
A7	98.6	97.5	99.0	97.1	97.9	98.9	100
A8	98.1	98.2	98.2	97.9	97.3	98.2	97.3	100
A9	98.1	96.7	98.6	96.9	100	98.6	97.9	97.3	100
A10	98.8	97.3	98.8	97.1	97.7	98.9	98.1	97.8	97.7	100
A11	96.7	97.3	97.4	96.7	96.7	97.3	97.0	97.6	96.7	96.5	100
A12	99.2	97.5	99.0	97.5	98.2	99.1	98.4	97.8	98.3	98.1	96.7	100

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表 6 野莴苣及其近似种rbcL 序列的遗传相似系数

Table 6 Genetic similarity coefficients of L. pulchella and its closely related species based on rbcL sequences

(单位/%)
样品编号	A1	A2	A3	A4	A5	A6	A7	A8	A9	A10	A11	A12
A1	100
A2	99.1	100
A3	100	99.0	100
A4	99.0	100	99.1	100
A5	100	99.0	100	99.1	100
A6	100	99.0	100	99.1	100	100
A7	100	99.0	100	99.1	100	100	100
A8	98.9	99.2	99.0	99.2	99.0	99.0	99.0	100
A9	99.8	98.7	99.7	98.7	99.7	99.7	99.7	98.7	100
A10	100	93.0	93.6	99.1	93.9	94.0	93.6	93.5	93.7	100
A11	99.2	99.2	99.2	99.5	99.2	99.2	99.2	99.3	98.9	92.0	100
A12	100	98.8	99.7	99.1	99.7	99.7	99.7	98.6	99.4	99.7	98.9	100

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参考文献(18)

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[2]	Flora of North America Editorial Committee. Flora of North America, North of Mexico[M]. New York:Oxford University Press, 2006, 19-21:259.
[3]	Flora of Missouri Editorial Committee.Flora of Missouri[OL].[2017-06-05].http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=11&taxon_id=200024120.
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施引文献(4)

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1. 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 引物选取
1.2.2 植物DNA提取
1.2.3 PCR扩增反应程序
1.2.4 PCR扩增反应体系
1.2.5 序列测定与分析
1.3 亲缘关系分析方法
2. 结果与分析
3. 讨论与结论

野莴苣及其近似种间亲缘关系研究

作者简介: 林玲(1980-), 女, 农艺师, 研究方向:植物检疫(E-mail:303880739@qq.com)

通讯作者: 虞赟(1981-), 女, 高级农艺师, 研究方向:植物检疫(E-mail:3900091@qq.com)

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