多杀性巴氏杆菌为革兰氏阴性的球杆状或短杆状菌，无鞭毛，不形成芽胞，有荚膜，是引起家禽和野禽霍乱的病原体^[1]。抗菌药物在禽霍乱的防治中发挥了重要作用，但随着抗菌药物的不合理应用，特别是将抗菌药物以次治疗剂量添加到饲料中，多杀性巴氏杆菌的耐药率不断提高，耐药范围更广，多重耐药的现象越来越多^[2]。国内外学者研究发现，多杀性巴氏杆菌的耐药可能与耐药质粒、耐药基因的突变、外排泵的过量表达、整合子介导等因素有关^[3]，其中耐药质粒是最重要的一个因素。如Corinna等的报道，牛源多杀性巴氏杆菌耐药菌中存在10.8 kb的耐药质粒，介导氟苯尼考和氯霉素耐药^[4]，质粒携带的耐药基因可在细菌间穿梭。为了解禽源多杀性巴氏杆菌的耐药性与质粒的相关性，本研究探讨了2013年以来分离菌的药物敏感性及质粒携带情况，以期为禽病防治提供科学依据。

菌株编号为F201301~F201312、F201401~F201408，福建省农业科学院畜牧兽医研究所2013年以来从福建省及邻近省份疑似禽霍乱病例分离、鉴定并保存的禽源多杀性巴氏杆菌，鉴定方法参照程龙飞等^[5]的方法。培养基为胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptic Soy Agar，TSA)和胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth，TSB)，均购自Dfico公司。

药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司，Supercoiled DNA Ladder购自大连宝生物工程(TakaRa)有限公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司，氯霉素购自上海生工生物工程股份有限公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。

用于试验的药物有：青霉素、氨苄青霉素、阿莫西林、头孢唑啉、多粘菌素B、丁胺卡那霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、壮观霉素、新霉素、红霉素、四环素、强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、复方新诺明、甲砜霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、利福平。纸片扩散法测定菌株对常用抗生素的敏感性按参考文献^[6]的方法进行，质控菌株为大肠杆菌ATCC25922。按中国食品药品检定研究院制定的《抗菌药物药敏试验判断标准》进行判定。

细菌接种TSB后，37℃振荡培养12 h，然后加入氯霉素至终浓度170 μg·mL^-1，继续37℃振荡培养12 h。按试剂盒说明书进行提取各菌株的质粒，然后取5 μL样品，用1%琼脂糖凝胶电泳，电泳后以凝胶成像系统记录试验结果。

药物敏感性试验结果(表 1)表明，所有分离株均表现多重耐药性，未见对所有菌株敏感的药物，所有菌株对克林霉素均不敏感。16株以上敏感的药物有氧氟沙星、利福平、头孢唑啉、多粘菌素B、强力霉素、左氧氟沙星、氨苄青霉素、恩诺沙星和复方新诺明。16株以上耐受的药物有青霉素和克林霉素。

表 1(Tab.1)

表 1 分离菌的药敏试验 Tab.1 Drug sensitivity tests on isolated strains 药物 敏感 中介 耐药 菌株数 敏感率/% 菌株数 中介率/% 菌株数 耐药率/% 青霉素 2 10 0 0 18 90 氨苄青霉素 16 80 2 10 2 10 阿莫西林 8 40 5 25 7 35 头孢唑啉 18 90 2 10 0 0 多粘菌素B 17 85 2 10 1 5 丁胺卡那霉素 13 65 3 15 4 20 庆大霉素 8 40 10 50 2 10 卡那霉素 4 20 6 30 10 50 链霉素 4 20 7 35 9 45 壮观霉素 7 35 10 50 3 15 新霉素 5 25 11 55 4 20 红霉素 2 10 18 90 0 0 四环素 6 30 7 35 7 35 强力霉素 17 85 3 15 0 0 诺氟沙星 7 35 9 45 4 20 恩诺沙星 16 80 4 20 0 0 环丙沙星 6 30 14 70 0 0 氧氟沙星 19 95 1 5 0 0 左氧氟沙星 16 80 4 20 0 0 复方新诺明 16 80 1 5 3 15 甲砜霉素 4 20 2 10 14 70 氟苯尼考 13 65 1 5 6 30 林可霉素 0 0 5 25 15 75 克林霉素 0 0 0 0 20 100 利福平 18 90 2 10 0 0

表 1 分离菌的药敏试验 Tab.1 Drug sensitivity tests on isolated strains

质粒图谱如图 1所示，20株分离菌中13株含有质粒，共有8个谱型，质粒的个数1~7个不等，最小的质粒约为2 kb，最大的超过12 kb。

图 1 禽源多杀性巴氏杆菌分离株的质粒 Fig. 1 Plasmids in P. multocida isolates 注：1~12为分离菌F201301~F201312；13~20为分离菌F201401~F201408；M为Supercoiled DNA Ladder。

分离菌的质粒谱、耐药数量和耐药种类如表 2所示，质粒携带的数量与耐药种类没有必然的联系。氟苯尼考、多粘菌素B和复方新诺明3种药物只在携带有质的菌株中是耐药的。

表 2(Tab.2)

表 2 质粒谱与耐药数量和耐药种类 Tab.2 Plasmids number and names of resistant drugs 菌株号 质粒谱型 耐药数量 耐药种类 F201301 无 9 阿莫西林、丁胺卡那霉素、卡那霉素、链霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201302 无 12 阿莫西林、氨苄青霉素、甲砜霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、壮观霉素、新霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素 F201303 无 8 阿莫西林、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素 F201304 无 7 诺氟沙星、甲砜霉素、卡那霉素、新霉素、青霉素、林可霉素、克林霉素 F201307 无 3 林可霉素、克林霉素、青霉素 F201406 无 5 四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201408 无 4 卡那霉素、林可霉素、克林霉素、青霉素 F201305 A 9 丁胺卡那霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201309 A 5 阿莫西林、甲砜霉素、卡那霉素、林可霉素、克林霉素 F201311 A 2 克林霉素、青霉素 F201312 A 10 阿莫西林、丁胺卡那霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201401 A 6 链霉素、壮观霉素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201306 B 11 阿莫西林、氨苄青霉素、丁胺卡那霉素、诺氟沙星、复方新诺明、卡那霉素、链霉素、林可霉素、克林霉素、青霉素、甲砜霉素 F201308 C 4 氟苯尼考、甲砜霉素、克林霉素、青霉素 F201310 D 5 多粘菌素B、链霉素、甲砜霉素、克林霉素、青霉素 F201402 E 7 阿莫西林、氟苯尼考、诺氟沙星、复方新诺明、林可霉素、克林霉素、青霉素 F201403 F 9 氟苯尼考、诺氟沙星、卡那霉素、链霉素、壮观霉素、四环素、林可霉素、克林霉素、青霉素 F201404 G 4 氟苯尼考、复方新诺明、克林霉素、青霉素 F201405 H 4 氟苯尼考、甲砜霉素、克林霉素、青霉素 F201407 H 5 氟本尼考、甲砜霉素、林可霉素、克林霉素、青霉素

表 2 质粒谱与耐药数量和耐药种类 Tab.2 Plasmids number and names of resistant drugs

本试验结果说明，近期发生的禽霍乱，选择氧氟沙星、利福平、头孢唑啉、多粘菌素B、强力霉素、左氧氟沙星、氨苄青霉素、恩诺沙星和复方新诺明比较合适。与孙健等^{[7, 8, 9, 10, 11, 12]}的报道不尽相同，可能与不同地区的用药习惯、饲料中添加的药物不同有关。

细菌耐药性是疾病防治中的一个突出问题，细菌的获得性耐药基因大多是由移动性DNA元件携带，通过转化、接合和转导等方式在基因组内或基因组间产生位移，这些移动性DNA元件可能是接合性质粒、转座子、噬菌体和整合子等。其中耐药性质粒是很重要的一个因素^[13]。不同源多杀性巴氏杆菌的质粒携带率差异较大，兔源为92%，禽源为24%～71%，猪源为47%～51%，牛源为47%，质粒大小一般介于1~100 kb^[14]。本研究结果表明，65%的禽源多杀性巴氏杆菌携带质粒，最小的质粒约为2 kb，最大的超过12 kb。质粒携带率和质粒大小均与前人的研究相符。多杀性巴氏杆菌质粒具有链霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素、青霉素和磺胺类等药物的抗性^[15]。本研究只有携带质粒的菌株对氟苯尼考、多粘菌素B和复方新诺明3种药物耐受，说明质粒可能与这些药物的耐药性有关。具体与这些药物耐药相关的质粒序列有待进一步研究。