益生芽胞杆菌是能改善肠道菌群、有益宿主的活性芽胞杆菌，国内外常用的有蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus、枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis、凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans和地衣芽胞杆菌Bacillus licheniformis等。益生芽胞杆菌有以下功效：激活机体免疫，调节肠道菌群^[1]；产生抑菌物质^[2]，抑制病菌繁殖扩散^[3]；提高氨基酸转化率^[4]，增强营养^[5]。此外，其抗逆性强，营养要求不高，生产工艺易掌握^[6]，针对抗生素滥用的危害^[7]和食品安全的关注，益生芽胞杆菌是更绿色、安全的抗生素替代品。

现阶段益生芽胞杆菌的研究方向主要包括生物学性质、饲用效果、产酶及抑菌等，多数研究以产酶或抑菌作为发酵优化的指标，供试芽胞杆菌的益生功能薄弱，例如胥海东^[8]通过培养基优化只提高枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BDT-3的蛋白酶活力，文凤云等^[9]借助培养条件优化只提高多粘芽胞杆菌Paenibacillus polymyxa Dw-6的抑菌效果。然而具有高酶活和抑菌效果双重功能的益生芽胞杆菌更能适应养殖业的发展，在饲料添加剂行业有更广阔的应用前景。美丽短芽胞杆菌Brevibacillus formosus的相关研究集中在抗真菌性能方面，如拮抗烟草黑胫病菌Phytophthora parasitica var. nicotianae^[10]、枇杷炭疽病菌^[11]、猕猴桃叶枯病菌^[12]，蛋白酶及抑制肠道细菌的研究鲜少报道。

本研究从蛋白酶活力和抑菌效果2个指标优化FJAT-10011的发酵培养基和培养条件，为增强美丽短芽胞杆菌B. Formosus的益生功效和基础理论研究提供借鉴，同时丰富畜禽、水产养殖等饲料添加剂方面的益生菌资源库，开拓益生菌市场。

美丽短芽胞杆菌Brevibacillus formosus FJAT-10011、大肠杆菌Escherichia coli FJAT-301由福建省农业科学院农业生物资源研究所保存。

仪器设备：洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；X-Mark微孔板分光光度计；恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)等。

主要试剂：干酪素(国药集团化学试剂有限公司)；酪氨酸(北京百灵威科技有限公司)；福林酚(德国默克密理博公司)；其余均为化学纯或分析纯。

将 FJAT-10011于NA平板上划线，30℃下培养24 h后挑取单菌落接种于50 mL /250 mL NA培养液中，30℃、170 r·min^-1恒温振荡摇床上培养12 h。将培养好的种子液以1%的接种量接种于50 mL/250 mL NA培养液中，30℃、170 r·min^-1的恒温振荡摇床上培养24 h，4 000×g下离心10 min，取上清液用0.22 μm的无菌过滤器过滤，于-20℃中保存。

试验组：酶液(1.3中的无细胞发酵上清液)和1%酪蛋白分别于40℃水浴5 min，取1 mL酪蛋白与2 mL酶液均匀混合，40℃反应30 min。以2 mL 10%的三氯乙酸终止反应，静置10 min后4 000×g离心10 min。取离心后上清液1 mL，加入5 mL 0.4 mol·L^-1的碳酸钠和1 mL福林酚试剂(原液稀释10倍)，混匀后40℃保温20 min，冷却到室温，测定680 nm处的吸光值。

对照组：2 mL酶液沸水浴20 min，冷却后加入2 mL 10%的三氯乙酸，接着加入1 mL 1%的酪蛋白，40℃反应30 min，静置10 min后4 000×g离心10 min，其他步骤同试验组。在40℃、pH7.0条件下，每毫升酶液1 min水解酪素产生1 μg酪氨酸所需的酶量定义为1个活力单位(U)，表示为U·mL^-1[14]。

抑菌活性测定采用平板扩散法^[15]。活化的大肠杆菌Escherichia coli于NA培养液中扩大培养，调节指示菌的菌悬液浓度为10⁸cfu·ml^-1(血球计数法及无菌水稀释)。吸取指示菌液50 μL，加入到熔化并冷却至45℃左右的50 mL半固体NA培养基(琼脂含量0.8%)中，混匀，倾覆在已凝固的NA平板上。待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔(直径6 mm)，每孔加0.22 μm无菌过滤的发酵上清液100 μL，将平板置于30℃恒温培养箱内正置培养24 h后，测量抑菌圈直径。

在NA培养液的基础上分别对氮源种类(1%的不同氮源替换1%的蛋白胨)、氮源浓度、碳源种类、碳源浓度、金属离子种类这5个因素进行单因素优化，在优化后的发酵培养基上再分别对温度、pH、接种量、装液量这4种培养条件进行单因素优化，所有试验均设3个重复。

表 1(Tab.1)

表 1 单因素试验因素与水平Tab.1 Factors and levels of single-factor test 序号 各因素变量 各水平变量 1 氮源(10 g·L-1) 豆粉、蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸粉、干酪素 2 碳源(10 g·L-1) 可溶性淀粉、玉米淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖 3 可溶性淀粉浓度(g·L-1) 5、7.5、10、12.5、15 4 蛋白胨浓度(g·L-1) 5、7.5、10、12.5、15 5 金属离子(0.05%) 硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、氯化钙、磷酸氢二钾 6 温度/℃ 20、25、30、35、40 7 初始pH 5.5、6、6.5、7、7.5、8.0 8 接种量/% 1、2、3、4、5 9 装液量/mL 30、40、50、60、70

表 1 单因素试验因素与水平 Tab.1 Factors and levels of single-factor test

对可溶性淀粉及蛋白胨浓度、温度、pH、接种量、装液量按照L₈(2⁷)正交表进行6因素2水平正交试验，检测各因素对菌株产酶能力和抑菌能力的影响。并按照最优培养基配方和培养条件进行发酵，每隔一定时间取样，绘制生长、产酶及抑菌曲线。

试验数据结果采用统计软件SPSS 17.0处理，对数据进行方差分析，用Duncan法进行显著性分析。

表 2(Tab.2)

表 2 正交试验因素水平Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment 水平 因素 可溶性淀粉(A)/(g·L-1) 蛋白胨(B)/(g·L-1) 温度(C)/℃ pH(D) 接种量(E)/% 装液量(F)/mL 1 12.5 12.5 25 5.5 1 30 2 15 15 30 6.0 2 40

表 2 正交试验因素水平 Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment

氮源对菌株FJAT-10011产酶及抑菌效果的影响见图 1。优化发酵培养基：氮源1%、牛肉浸粉0.3%、NaCl 0.5%，pH7.0。蛋白酶活力大小顺序为豆粉>牛肉浸粉>蛋白胨>干酪素、酵母浸粉，以豆粉、酵母浸粉作为氮源后发酵液中的酶活力分别为6.31、0.28 U·mL^-1，豆粉是酵母浸粉酶活力的22.5倍。抑菌效果的大小顺序为蛋白胨>酵母浸粉，抑菌直径分别为16.24、16.00 mm，牛肉浸粉、干酪素和豆粉作氮源的上清液对大肠杆菌没有拮抗作用，蛋白胨与酵母浸粉对蛋白酶活力和抑菌的影响均不显著，选择蛋白酶活力和抑菌都较高的蛋白胨作为氮源。

图 1(Fig. 1)

图 1 氮源对产酶及抑菌的影响 注：不同小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)，下同。 Fig. 1 Effect of nitrogen source on protease and antibacterial activities

蛋白胨质量浓度对蛋白酶活力和抑菌效果的影响见图 2。蛋白胨质量浓度12.5 g·L^-1与其他4个浓度对蛋白酶活力的影响差异显著(P＜0.05)，蛋白胨质量浓度7.5 g·L^-1时酶活力为0.11 U·mL^-1，12.5 g·L^-1时酶活力为0.43 U·mL^-1，是7.5 g·L^-1酶活力的3.9倍。蛋白胨质量浓度5 g·L^-1与其他4个质量浓度对抑菌效果的影响差异显著(P＜0.05)，蛋白胨质量浓度15 g·L^-1时的抑菌直径为13.69 mm，看作100%，在蛋白胨质量浓度7.5~15.0 g·L^-1之间发酵液的相对抑菌效果均高于94%，蛋白胨质量浓度5 g·L^-1时的抑菌直径为10.76 mm，相对抑菌效果为79%。综合酶活力和抑菌结果，选择12.5 g·L^-1的蛋白胨作为适宜质量浓度。

图 2(Fig. 2)

图 2 蛋白胨浓度对产酶及抑菌的影响 Fig. 2 Effect of peptone concentration on protease and antibacterial activities

碳源对菌株FJAT-10011产酶及抑菌效果的影响见图 3。优化发酵培养基：碳源1%、蛋白胨1%、牛肉浸粉0.3%、NaCl 0.5%，pH7.0。蛋白酶活力大小顺序为：麦芽糖>葡萄糖>可溶性淀粉，蛋白酶活力均高于1.4 U·mL^-1，玉米淀粉和蔗糖作碳源的发酵液中蛋白酶活力低于0.5 U·mL^-1。抑菌效果的大小顺序为：可溶性淀粉>玉米淀粉>蔗糖>麦芽糖>葡萄糖，可溶性淀粉作碳源的发酵液抑菌直径为17.78 mm，葡萄糖抑菌直径为13.42 mm，是可溶性淀粉抑菌效果的75%。麦芽糖、可溶性淀粉和葡萄糖对蛋白酶活力的影响差异不显著，但可溶性淀粉与麦芽糖和葡萄糖对抑菌效果的影响差异显著(P＜0.05)，同时借鉴郝晓娟等^[16]对短短芽胞杆菌抑菌优化的结果，选择可溶性淀粉为碳源。

图 3(Fig. 3)

图 3 碳源对产酶及抑菌的影响 Fig. 3 Effect of carbon source on protease and antibacterial activities

可溶性淀粉浓度对蛋白酶活力和抑菌效果的影响见图 4。蛋白酶活力随可溶性淀粉浓度的增大而升高，可溶性淀粉质量浓度5 g·L^-1时蛋白酶活力为0.75 U·mL^-1，12.5 g·L^-1时蛋白酶活力为3.88 U·mL^-1，是5 g·L^-1时酶活力的5.17倍。可溶性淀粉质量浓度高于12.5 g·L^-1时，蛋白酶活力降低，15 g·L^-1时蛋白酶活力为3.12 U·mL^-1，为12.5 g·L^-1时酶活力的80%。可溶性淀粉质量浓度为12.5 g·L^-1时发酵液抑菌直径为19.31 mm，看作100%，可溶性淀粉质量浓度在5~15 g·L^-1的相对抑菌效果均大于93%。因此选择12.5 g·L^-1的可溶性淀粉为适宜质量浓度。

图 4(Fig. 4)

图 4 可溶性淀粉浓度对产酶及抑菌的影响 Fig. 4 Effect of starch content on protease and antibacterial activities

金属离子对菌株FJAT-10011蛋白酶活力及抑菌效果的影响见图 5。优化发酵培养基：蛋白胨1%、牛肉浸粉0.3%、NaCl 0.5%、金属离子0.05%，pH7.0。蛋白酶活力的大小顺序为：硫酸镁>磷酸氢二钾>硫酸亚铁>硫酸锰>氯化钙，其中硫酸镁和磷酸氢二钾对蛋白酶活力影响差异不显著，镁离子蛋白酶活力为1.62 U·mL^-1，钙离子蛋白酶活力为0.32 U·mL^-1，仅为镁离子酶活力的20%；氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸镁之间对抑菌效果的影响不显著，钾离子抑菌直径16.77 mm，钙离子抑菌直径为16.4 mm，添加硫酸锰和硫酸亚铁的发酵液没有抑菌效果。因此补充镁离子和钾离子有利于提高蛋白酶和抑菌效果。

图 5(Fig. 5)

图 5 金属离子对产酶及抑菌的影响 Fig. 5 Effect of metal ions on protease and antibacterial activities

温度对菌株FJAT-10011蛋白酶活力及抑菌效果的影响见图 6。优化后发酵培养基：可溶性淀粉1.25%、蛋白胨1.25%、牛肉浸粉0.3%、NaCl 0.5%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.05%，pH7.0。低于25℃时菌体难生长，没有蛋白酶和抑菌物质产生；高于25℃时，蛋白酶活力随温度的升高而降低，抑菌效果随着温度的升高而增强，40℃时蛋白酶活力为0.51 U·mL^-1，抑菌直径18.77 mm；25℃时蛋白酶活力为7.88 U·mL^-1，抑菌直径15.42 mm，酶活力和抑菌效果分别是40℃时的15.5倍和82%。25℃与其他温度对蛋白酶和抑菌效果的影响差异显著(P＜0.05)，选择25℃作为发酵温度。

图 6(Fig. 6)

图 6 温度对产酶及抑菌的影响 Fig. 6 Effect of temperature on protease and antibacterial activities

初始pH对菌株FJAT-10011蛋白酶活力及抑菌效果的影响见图 7。发酵液中蛋白酶活力随pH的升高而降低，pH8.0的蛋白酶活力为0.38 U·mL^-1，pH5.5的蛋白酶活力为10.21 U·mL^-1，是pH8.0酶活力的26.9倍。pH5.5与其他pH之间对抑菌效果的影响差异显著(P＜0.05)，pH6.5的抑菌直径为17.85 mm，看作100%，pH5.5至pH8.0的范围内相对抑菌效果均高于91%。综合蛋白酶和抑菌结果，选择pH5.5作为发酵的初始pH。微生物生长的最适pH和产物合成的最适pH不一定一致，pH对菌体生长和代谢产物形成的影响是多方面的，它直接影响酶的活性，以及菌体的正常生长代谢繁殖等^[17]。

图 7(Fig. 7)

图 7 初始pH对产酶及抑菌的影响 Fig. 7 Effect of initial pH on protease and antibacterial activities

接种量对菌株FJAT-10011蛋白酶活力及抑菌效果的影响见图 8。接种量低于2%时，蛋白酶活力随接种量的增加而升高，接种量1%时蛋白酶活力为3.84 U·mL^-1，接种量2%时蛋白酶活力为5.4 U·mL^-1，是1%接种量的1.4倍；接种量高于2%时，蛋白酶活力随接种量的增加而降低，接种量4%时蛋白酶活力为1.58 U·mL^-1，为2%接种量酶活的29%；接种量2%与其他接种量对蛋白酶活力的影响差异显著(P＜0.05)。接种量5%与其他接种量对抑菌效果影响差异显著(P＜0.05)，最低抑菌直径(接种量5%)是最高抑菌直径(接种量1%)的94%，1%与2%接种量对抑菌效果的影响差异不显著，因此选择蛋白酶活力略高的2%接种量。

图 8(Fig. 8)

图 8 接种量对产酶及抑菌的影响 Fig. 8 Effect of inoculum rate on protease and antibacterial activities

装液量对菌株FJAT-10011蛋白酶活力及抑菌效果的影响见图 9。细菌的生长会受到氧气量的影响，而溶氧量可以通过培养瓶内培养基体积的大小来控制^[18]。蛋白酶活力随装液量的增大而减少，抑菌效果随装液量的增大而增大，装液量70 mL的酶活力和抑菌直径分别为1.29 U·mL^-1、18.04 mm，30 mL时的酶活力和抑菌直径分别为3.25 U·mL^-1、15.53 mm，分别为70 mL酶活力和抑菌效果的2.5倍和86%。30 mL的装液量与其他装液量对蛋白酶或抑菌活力的影响差异显著(P＜0.05)，选择30 mL的装液量。

图 9(Fig. 9)

图 9 装液量对产酶及抑菌的影响 Fig. 9 Effect of liquid medium filling volume on protease and antibacterial activities

对可溶性淀粉、蛋白胨、温度、pH、接种量、装液量6个因素，依据L₈(2⁷)正交表进行正交试验。

结果(表 3)表明，6个因素的极差大小决定因素对蛋白酶活力及抑菌效果的影响程度，次序为：可溶性淀粉>蛋白胨>接种量>温度>装液量>pH。比较各因素的均值1与均值2大小后可知，菌株FJAT-10011产蛋白酶及抑菌活性的最佳培养条件是A₁B₁C₁D₁E₁F₁，即可溶性淀粉12.5 g·L^-1、蛋白胨12.5 g·L^-1、牛肉浸粉3 g·L^-1、氯化钠5 g·L^-1，温度25℃，初始pH5.5，接种量1%，装液量30 mL。在最佳条件下进行3次验证试验，平均酶活和抑菌直径分别为8.41 U·mL^-1、15.71 mm，比初始发酵水平蛋白酶活力与抑菌活性分别提高了141、1.3倍。

表 3(Tab.3)

表 3 正交试验结果分析Tab.3 Results and analysis of orthogonal test 可溶性淀粉(A)/(g·L-1) 蛋白胨(B)/(g·L-1) 温度(C)/℃ pH(D) 接种量(E)/% 装液量(F)/mL 综合百分比/% 1 12.5 12.5 25 6.0 1 40 185 2 15 12.5 30 6.0 1 30 196 3 12.5 15 30 6.0 2 30 186 4 15 15 25 6.0 2 40 154 5 12.5 12.5 30 5.5 2 40 114 6 15 12.5 25 5.5 2 30 96 7 12.5 15 25 5.5 1 30 79 8 15 15 30 5.5 1 40 116 均值1 180.250 147.750 144.000 141.000 145.750 142.250 均值2 101.250 133.750 137.500 140.500 135.750 139.250 极差 79.000 14.000 6.500 0.500 10.000 3.000

表 3 正交试验结果分析 Tab.3 Results and analysis of orthogonal test

优化前后抑菌效果对比，见图 10。优化前抑菌直径平均值为11.61 mm，为氨苄青霉素(30 μg)的87%；优化后抑菌直径平均值为15.71 mm，为氨苄青霉素(30 μg)的113%。

图 10(Fig. 10)

图 10 抑菌活性 注：A为优化后，B为优化前。 Fig. 10 Antibacterial activity

美丽短芽胞杆菌Brevibacillus formosus FJAT-10011的生长、产酶及抑菌曲线见图 11，6~14 h为对数期，对数期末期开始分泌抑菌物质和蛋白酶，20 h后达到酶活力和抑菌效果的最高水平，且16 h内维持稳定。因此可以通过延长对数期和稳定期来获得高产量的蛋白酶和抑菌物质，例如对数期末期补充新鲜培养基，采用两段式温度发酵等。

图 11(Fig. 11)

图 11 发酵曲线 Fig. 11 Fermentation curve

不同温度对FJAT-10011的抑菌活性影响显著(P＜0.05)，低于25℃会抑制菌株生长，进而影响抑菌物质的分泌，而25～40℃时抑菌活性随温度升高而升高。解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens SWB16对球孢白僵菌Beauveria bassiana的拮抗温度为30℃^[19]，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis C3对黑曲霉孢子萌发抑菌温度为37℃^[20]，说明FJAT-10011可以用于较高温度的抑菌。钙、镁、钾与锰和亚铁离子对FJAT-10011的抑菌活性影响显著(P＜0.05)，其中锰和亚铁离子会抑制抑菌物质的产生，这与安文静^[21]研究锰离子和亚铁离子刺激侧孢短芽胞杆菌产生抑菌物质的结论不一致，说明不同金属离子对不同菌株抑菌物质的产生作用不同。

微生物蛋白酶为底物诱导型，在培养基中添加有机氮源作为底物能有效促进蛋白酶的产生^[22]。添加干酪素和豆粉这类迟效氮源虽能提高FJAT-10011蛋白酶活力但没有抑菌活性，可以通过郝晓娟等^[16]的研究解释这一现象，豆饼粉不利于短短芽胞杆菌抑菌物质的产生。不同pH对FJAT-10011的蛋白酶活性影响显著(P＜0.05)，偏酸性的初始环境明显比偏碱性更有利于蛋白酶的产生，发酵上清液收获时的pH偏碱性，这很有利于FJAT-10011在胃中的存活，从而增加作为饲料添加剂的潜能。

有关美丽短芽胞杆菌B. formosus的研究少且内容不深入，该菌株能抑制沙门氏菌Salmonella typhi.和蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus^[23]，分泌耐热几丁质酶^[24]，但是没有针对蛋白酶和抑制大肠杆菌的发酵优化研究。所以本研究能够为美丽短芽胞杆菌B. formosus的基础研究提供理论支持。发酵优化后的最终蛋白酶活力比初始酶活力高141倍，具备进一步研究开发的潜能。