刺参Apostichopus japonicus隶属于棘皮动物门Echinodermata、海 参 纲Holothuroidea、楯 手 目Aspidochirota、刺参科Stichopodidae，集中分布于河北、山东、辽宁等沿海省份，作为我国特种海洋经济动物的重要一员^[1]，它的营养价值丰富，同人参、燕窝等同属世界八大珍品之一。除了营养丰富之外，刺参还是一种名贵的药材，具有防止动脉硬化、增强机体免疫能力、抗凝血以及抗肿瘤等重要的医学作用^[2]。

山东是我国北方重要的刺参产地之一，其核心在威海和烟台，也是北方最重点和发展最快的刺参市场，随着我国市场需求的增长和天然资源的减少，刺参人工养殖规模迅速扩大，这积极促进了我国水产养殖业的迅猛发展，据统计，截至2012年4月，山东省海参养殖面积已达53.33万hm²，年产量7.1万t，占全国海参产量的一半，且每年以20%的增长速度发展，将成为山东省第一大海水养殖产业^[3]。

刺参种质是刺参产业健康发展的根本，而目前养殖用参苗大多是没有经过选育的苗种，因此不同程度地出现生长缓慢、个体差异大、病害频发、成活率低等问题^[4]，严重影响并制约了刺参养殖产业健康持续发展。基于目前，我国的刺参良种选育技术研究尚处于起步阶段，尤其在分子标记辅助育种技术领域起步较晚，这在一定程度上制约了刺参良种选育的进程^[5]。而杂交育种技术在水产业的应用较为成熟，早于2005年就已顺利开展了刺参中国与韩国种群杂交育苗技术的研究，并成功通过了专家组鉴定^[6]，同时，在贝类^{[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13]}、鱼类^{[14, 15, 16, 17]}、虾蟹类^[18]都有一系列学者进行了相关的杂交育种研究，为刺参的良种培育提供了重要的参考，基于杂交优势的成功应用，通过杂交育种方式，改进刺参种质，提高其养殖产量效益，研究新品种刺参后代在生长发育上的性状表现，具有十分重要的意义。本研究通过对不同地理群体的刺参进行杂交育种，探讨其不同组合的杂交效果，观察各组合后代生长状态，通过计算杂交亲本间的遗传距离，比较各组合杂交遗传距离与杂交后代生长性状的相关性并总结分析，旨在培育出优良刺参种质，获得杂交育种生长性状的遗传相关性，以期为我国刺参种质改良和杂交育种研究奠定基础。

不同地理群体刺参具有不同的遗传多样性，通过运用ISSR标记分析大连、威海、长岛、胶南群体刺参的遗传多样性，利用MEGA4.0软件计算了4个群体之间的遗传距离，结果表明群体间遗传距离在0.285 3~0.423 8。供试长岛群体刺参取自人工养殖，于3月21日入池，此时水温为4.2℃，共121头，个体平均313 g，将其置于自然水温暂养，适时换水除污，至种参状态稳定前不投饵，稳定后适量投饵；3月23日入池胶南群体刺参102头，平均个体293 g，威海群体刺参88头，平均个体在289 g，置于自然水温暂养；3月24日79头大连群体刺参入池暂养，平均个体302 g，自然水温，适时换水，稳定后适量投饵。经一段时间的暂养，获得状态稳定性状良好的种参，选择合适个体进行杂交试验。

种参适应后，经3~4 d的入池暂养，大量换水，期间拣出胶南群体腐皮个体1头，大连群体刺参拣出4个，其他群体未见腐皮个体，种参总体状态较稳定，待其适应新环境后，倒池清除粪便，并用KMnO₄消毒，加注新水，自然水温，并投喂少量新鲜海泥。观察种参摄氏情况良好，池底饵料残留较少，粪便成形，状态较好，适量增加海泥投喂量，换水2/3。

水温升至5℃，摄氏情况较小，饵料为海泥、菜物、酵母、螺旋藻及配合投喂，摄氏较好，正常换水。4月12日水温升至9℃时，进行倒池清底，用KMnO₄消毒。继续升温，摄氏较好，适量增加饵料投喂，继续升温，11℃时，夜晚观察种参状态。4月20日，种参池内温度维持在12℃，正常换水投饵，每个群体随机选取2头种参解剖，比较其个体性腺发育，结果各组种参一致性较好，适量增加海泥及配合饵料投喂量。5月5日倒池，水温升至16℃，恒温培育，正常换水，饵料根据摄氏情况及时调整，至5月20日升到17℃，进一步升温促熟，恒温培育，到6月7日进行种参解剖，发现卵子发育已非常好，换水1/2，水温维持18℃，恒温待产，之后上午换水1/3，下午换水1/2，并减少饵料投喂，待水体中发现少量卵子，个别个体排放，则少量换水，停止投喂饵料。

6月13日下午发现部分种参昂头揺尾，在池底或池壁爬动，此时种参培育完全，性腺成熟，准备晚间采卵。

采卵方式采用升温刺激法，待水温升到20.5℃，将种参转移到盛有20.5℃海水的水槽中，水泥池内则加满水，水温维持20.5℃，注意观察，及时将雄性个体拣出。长岛群体刺参用C表示，大连群体刺参用D表示，威海群体刺参用W表示，胶南群体刺参用J表示，对4种不同地理群体刺参进行杂交育种试验，当发现雌性个体开始排放时，将每个群体的雌性平均分成4份，共16个组合，每组合3尾，设置平行试验，每个杂交组合雌性亲本在前(如C×D则表示雌性C与雄性D个体杂交)，具体杂交搭配组合见表1。

表1(Tab. 1)

表1 杂交亲本组合Tab. 1 The hybrid combinations 长岛群体 威海群体 大连群体 胶南群体 1.C×C 5. W×W 9. D×D 13. J×J 2. C×D 6. W×C 10. D×C 14. J×C 3. C×W 7. W×D 11. D×W 15. J×W 4. C×J 8. W×J 12. D×J 16. J×D

表1 杂交亲本组合 Tab. 1 The hybrid combinations

总共挑选长岛群体雄性个体53头，大连群体雄性个体32头，威海群体雄性个体37头，胶南群体雄性个体49头，用于受精、试验。

将备好的种参阴干1 h后流水刺激15 min，然后将雌雄亲参置于水桶内，待其开始排放精卵，迅速将雌雄亲体移出，分别放入备用水桶内，使其分别排放精卵并收集，待获得足够精卵后，进行人工授精，在显微镜下观察，精子密度控制在每个卵子周围一个视野面5个精子时即可，防止过多，产卵箱受精卵密度控制在300个·mL^-1，产卵完毕后及时将受精卵移至水泥池内进行孵化。观察统计卵子大小及群体间差异，计算各群体受精率并分析各组合差异性。

在16组合中，每一组合设置3个平行试验组合,统计其平均受精率。通过对这16个试验组合进行观察并及时记录，发现卵子直径在150~165 μm，而各群体之间并无差异，各平行组合表现一致，经计算发现，自交组合受精率高于杂交组合，但通过SPSS软件分析发现，各组合受精率还没达到极显著水平，均在89%以上(表2)。

表2(Tab. 2)

表2 各组合平均受精率大小Tab. 2 Average fertilization rate of different crossbreeding combinations (单位/%) 组 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 受精率 91 90 91 89 92 89 90 91 91 92 90 89 91 90 89 89

表2 各组合平均受精率大小 Tab. 2 Average fertilization rate of different crossbreeding combinations

在进行受精21 min开始释放第一极体，39 min时释放第二极体，之后进入卵裂期，经均等分裂，分裂球呈辐射状排列，在50 min时开始第1次分裂，形式为纵裂，170 μm大小，55 min时进行第2次分裂，纵裂为170 μm大小，在75 min时，开始了第3次分裂，形式为横裂，大小为170 μm，之后，受精进入多细胞期，期间发育过程见图1。

图1(Fig.1)

图1 胚胎发育细胞期过程 Fig.1 The cell stage of embryonic development

当在受精4.25 h时，进入囊胚期，大小为200 μm左右，此时观察到自交组合与杂交组合没有差异，发育较一致。在12.5 h时脱膜旋转囊胚200 μm大小，15.75 h时进入原肠初期255 μm，在18 h时原肠期大小270 μm，之后采用虹吸法选优，200目筛绢过滤。25 h左右进入初耳幼体，大小达到410 μm，5.5 d进入中耳幼体，大小为520 μm，7 d 16 h发育为大耳幼体，达到了880 μm，至此日均增长为50 μm左右，开始投喂少量的单胞藻(金藻、角毛藻)，待樽形幼体出现后，安放波纹板附着基，在稚参附着后，再投喂少量过滤过的海泥和鼠尾藻。囊胚期开始至幼参附着发育情况见图2。

图2(Fig.2)

图2 幼体形成过程 Fig.2 Developing process of the larval formation

稚参培育期间，每天换水1次，每次1/2，水温控制在22℃，每隔5 d倒池1次，7月20日，稚参体长达到3~5 mm左右，波纹板上有较多的附着物，严重影响稚参的摄食和生长，进行换板处理，将稚参小心敲下，重新投放干净的波纹板并适当增加饵料投喂量，之后正常换水、倒池。

观察各试验组合受精情况，记录受精率大小，比较不同组合的受精率差异，具体如下。

图3(Fig.3)

图3 不同组合受精率 Fig.3 The fertilization rates of different crossbreeding combinations

根据遗传分析得到的刺参群体遗传距离，将12组合(除却4个自交组合)划归6个遗传组合，A(8，16)、B( 4，14)、C(3，6)、D(2，10)、E( 7，11)、F(12，16)，其他组合分属自交组合，各组合划分及亲本遗传距离如表3所示。

表3(Tab. 3)

表3 各组合划分及遗传距离Tab. 3 The hybrid combinations and the genetic distance (单位/%) 杂交组合 大连 长岛 威海 胶南 大连 - - - - 长岛 D 36 - - - 威海 E 39 C 35 - - 胶南 F 42 B 31 A 29 -

表3 各组合划分及遗传距离 Tab. 3 The hybrid combinations and the genetic distance

适时测量各个组合的体长并记录30、60、80、105日后的刺参生长数据，统计30日的各组合体长差异性，总结其平均生长状况差异性，整理和比较不同时期各组合的生长，具体如表4所示。

表4(Tab. 4)

表4 30 d后各组合平均体长值Tab. 4 The average length of combinations after 30 days (单位/%) 组合 平均体长 组合 平均体长 1 3.76±0.41 ab 9 3.83±0.41 ab 2 3.81±0.52 ab 10 3.79±0.51 ab 3 3.68±0.51 ab 11 3.72±0.48 ab 4 3.85±0.41 ab 12 4.05±0.32 c 5 3.63±0.43 a 13 3.75±0.36 ab 6 3.81±0.46 ab 14 3.98±0.28 b 7 3.71±0.36 ab 15 3.80±0.49 ab 8 3.91±0.32 ab 16 4.11±0.43 c 注：同列数据后字母不同表示差异显著(P＜0.05)。

表4 30 d后各组合平均体长值 Tab. 4 The average length of combinations after 30 days

将杂交刺参后代体长值表征作为衡量生长性状的标准属性，总结各组合不同时期的平均体长值，通过SPSS软件进行数据分析，比较各时期不同组合间的体长值差异。结果显示，各杂交组合较自交组合均有较高的体长值，根据图4可以看出，不同杂交组合有不同的体长大小，且表现出了不同的杂种优势。

图4(Fig.4)

图4 不同时期各组合生长情况 Fig.4 The growth situation of hybrid combinations at different periods

比较30日时的各组合生长速度，发现组合F与其他组合之间表现出显著性差异。因此通过进一步整理不同时期各组合遗传距离，概括分析了不同距离下的杂交刺参生长优势：30日时，各组合生长情况为：F>B>A>C=D>E；60日时，各组合生长情况为：B>F=A>D>C>E；80日时，各组合生长情况为：D>C>E>B>F>A；105日时，各组合生长情况为：F>E>B>A>D>C。

由此可见，80日时较为特殊，遗传距离在0.35左右的C、D杂交组合生长较快，在0.3左右及0.4以上时，生长较慢；而在30、60、105日时，杂交组合遗传距离在0.35左右，生长均较慢，而遗传距离在0.3左右及0.4以上的B、F杂交组合，生长速度较快。

在不同地理群体刺参的杂交育种试验中，发现各组合受精率均在89%以上，虽然较低于各自交组合，但经SPSS软件分析，其差异性未达到极显著水平，杂交组合能够得到正常的杂交后代并呈现出一定的杂交生长优势，而试验中大连群体与胶南群体的杂交组合(即F组合)跟其他杂交群体组合在30日时，生长表现上有显著的差异性，而大连群体与威海群体的杂交组合(即E组合)也与其他组合表现出了明显的差异性，但组合E与组合F没有显著的生长差异性，其受精率虽然较低，在90%左右，但生长速度快，表现的生长杂交优势最为明显，而杂交结果也与江曙光^[19]的研究结果相一致。这证明了大连群体刺参是比较理想的杂交亲本，杂交后代杂交优势性状明显，证明了不同地理群体刺参的杂交是可行的，杂交育种效果良好，表现出重要的杂交生长优势。

杂交育种是改良种质的有效途径，是目前水产业广为应用的改善养殖品种，提高优势性状的重要手段之一。虽然杂交过程中，由于远源亲和力不同，受精作用受到影响，部分杂交体配子不亲和，受精率普遍较低，但种内杂交方式优势明显，由于亲缘关系相对较近，杂交配子亲和力较为理想，与自交过程的受精率没有显著性的差异，生长优势明显，本试验杂交组合受精及生长状况也进一步验证了杂交育种的可行性。因此，种内杂交，尤其不同地理群体间的杂交育种方式，对于改变我国目前渔业养殖品种恶化等现状，维护水产养殖业的健康持续发展具有不可忽视的重要作用。

试验表明，杂交亲本遗传距离在0.285 3~0.423 8范围内，总体表现出两端大、中间小的杂交生长趋势，但总体差异性并不显著；30日时与其他组合有显著差异性的F组与遗传距离在0.3左右的A、B组合有相近的体长值，其杂交后代体长性状持续领先，而遗传距离靠近F组合的E组合，杂交生长优势虽然开始最低，但随着时间的延长，却表现出逐渐增大的生长速度趋势；同时，可以看到，随着时间的延长，各杂交组合的体长值趋于平衡，杂交优势逐渐稳定，遗传距离与生长相关性并没有表现出极显著的差异性。

通过本次杂交育种试验，不难看出，杂交组合相对自交组合，虽然受精率方面较自交组合低，但差异性并不显著，且表现出了良好的生长杂交优势特征；同时，不同杂交组合，杂交优势也略有不同，不同遗传距离刺参的生长情况也各有不同，总体表现出了遗传距离与生长性状两端大、中间小的特性。本试验群体间的遗传生长规律，对于刺参杂交育种的种质改良工作提供了一定的参考，其具体杂交遗传机理等方面的研究，尚有待进一步的研究。