2015, Vol. 302. 厦门大学生命科学院, 福建 厦门 361005
, ZHU Hui-jun1, ZHU Yu-jing1, ZHANG Lian-bao2, CHEN Zheng1, ZHENG Mei-xia1, SHI Huai1 2. School of Life Science, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361005, China
发酵床养猪是20世纪80年代开始流行的一种新型环保型的养殖技术，该技术根据微生态理论，将有机垫料，如锯木屑、谷壳、秸秆、花生壳等农副产品按一定比例与微生物混合，进行高温发酵后填入到经过特殊设计的猪舍里[1, 2]。填入的垫料及垫料中的微生物加速吸收并发酵降解猪的排泄物，达到规模化养猪场管理方面无须人工清理即可达到对环境零排放的目的，并为提高猪生产性能和机体免疫力、大幅度减少疾病的健康养殖模式提供良好基础，实现了可持续发展的经济效益和环保效益[3, 4, 5]。除此之外，发酵床养猪技术的优势还表现在消纳大量作物秸秆、猪的用药量明显减少及各种资源的节约等方面[6, 7, 8]。
发酵床技术养猪的关键在于有益微生物以猪粪尿为基础营养维持自身的繁殖代谢，猪粪尿得以加速降解，进一步通过优势菌群效应遏制病原微生物的生长发育[9, 10, 11, 12, 13]。猪粪尿的物质降解速率决定于垫料中微生物的降解能力，在猪群集中的大型养猪场，快速有效的降解过程显得至关重要。实现对猪粪尿降解过程的监测，将会成为发酵床养猪技术优化的方向之一。
垫料物质组分的分析是猪粪降解、猪尿吸纳、垫料发酵程度、发酵床微生物群落的变化及微生物群落的稳定性等发酵床“健康状态”的主要表征，对垫料物质组分的鉴定是推动发酵床养猪科学化发展的重要基础。近些年来与发酵床养猪相关的研究呈逐步展开趋势，内容多涉及垫料组成对发酵效果的研究、菌剂及维护管理方面等，较少有关发酵垫料中的物质组分[14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]的报道。
本课题组首次尝试取极性从低到高的5组有机溶剂，通过梯度萃取的方式对发酵垫料物质组分进行提取，并通过气相色谱质谱联用仪实现物质组分的分析与鉴定。探讨不同溶剂层的物质分布及含量，鉴定垫料中主要的物质组分，确定不同物质组分提取方式，以期推动发酵床养猪的科学化管理。
1 材料与方法 1.1 试验材料样品为养猪微生物发酵床垫料，主要原料为椰糠和谷壳，发酵垫料呈黑色，发酵等级为四级(与空白垫料色差的△E为70.86)，采集时间为2015年1月26日，采集地点为福建福州渔溪微生物发酵床大栏养猪舍。
1.2 主要试剂和仪器精密鼓风干燥箱(施都凯仪器设备上海有限公司)；AL 104型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；KQ5200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Agilent 7890/ 5975C-GC/MSD(安捷伦公司)；所用溶剂均为色谱纯。
1.3 试验方法 1.3.1 发酵垫料物质提取通过对角线采样的方法采集发酵垫料，混合均匀后风干至恒重，取适量，采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醇等5组不同极性溶剂各200 mL并辅以超声对垫料组分进行固液萃取，提取过程如图 1所示。溶剂与垫料混合后，超声30 min，取滤液，重复3次，合并3次的滤液，旋转蒸干，测定物质的提取率(提取率=有机溶剂层提取物的质量/垫料质量)。
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图 1 发酵垫料物质梯度提取技术路线 Fig. 1 Gradient extraction of substances from fermentation bed |
GC-MS 分析，采用美国Agilent 7890/5975C-GC/MSD气象色谱质谱仪，色谱柱为DB-5MS，30 m×0.25 mm毛细管柱。GC-MS 条件：电离方式EI，电子能量70 eV，进样口温度 250℃，不分流进样，进样量1.0 μL；载气为高纯氦气，恒流，柱流速1.0 mL·min-1；四级杆温度150℃；离子源温度 250℃；接口温度280℃；扫描质量数范围30~ 500 amu，溶剂延迟8.0 min。GC-MS联用仪的柱温箱升温程序分别为：石油醚层起始温度40℃，以10℃·min-1升至300℃，保持5 min；氯仿层起始温度40℃，以10℃·min-1升至260℃，再以5℃·min-1升至300℃，保持4 min；乙酸乙酯层起始温度40℃，以10℃·min-1升至120℃，再以5℃·min-1升至200℃，接着以20℃·min-1升至300℃，维持1 min；丙酮层起始温度40℃，以10℃·min-1升至300℃，保持4 min；乙醇层起始温度40℃，以20℃·min-1升至240℃，再以5℃·min-1升至300℃，保持8 min。
1.3.3 定量和定性分析以EI为离子源，进行气质联用(GC-MS) 分析，所得到的质谱图利用NIST谱图库进行检索，同时根据相似度CAS号进行定性分析，定量分析结果根据总离子流色谱峰的峰面积，用直接面积归一化法来计算各组分的含量。
2 结果与分析 2.1 不同极性溶剂萃取总离子流图分析固液萃取是根据不同物质在溶剂中溶解度的差异，进行分离和富集。不同溶剂的极性、沸点及挥发性等不同，为提高各溶剂层物质的分离度，对GC/MS进行升温程序调整。升温程序：石油醚层起始温度40℃，以10℃·min-1升至300℃，保持5 min；氯仿层起始温度40℃，以10℃·min-1升至260℃，再以5℃·min-1升至300℃，保持4 min；乙酸乙酯层起始温度40℃，以10℃·min-1升至120℃，再以5℃·min-1升至200℃，接着以20℃·min-1升至300℃，维持1 min；丙酮层起始温度40℃，以10℃·min-1升至300℃，保持4 min；乙醇层起始温度40℃，以20℃·min-1升至240℃，再以5℃·min-1升至300℃，保持8 min。
不同升温条件、不同溶剂萃取物质的总离子流图如图 2～6所示，物质的分离度佳。其中图 2为石油醚对垫料物质的萃取结果，物质被检出的组分较少，在19.4 min左右有1个物质的高峰，主要物质的检出时间为24～28 min。图 3为氯仿对垫料物质的萃取结果，与石油醚层的萃取结果相比，氯仿层物质被检出的组分丰富，在19.4 min左右仍可观察到1个物质的高峰。检出的物质的保留时间集中在20～34 min，物质组分丰富，信噪比低，物质的分离度好。图 4为乙酸乙酯对垫料物质的萃取结果，物质被检出的丰度较氯仿层低，19.4 min左右的高峰消失，主要物质保留时间集中在10～18 min，在12.6 min左右出现1个物质的高峰。图 5为丙酮对垫料物质的萃取结果，物质被检出的丰度较高，物质的保留时间集中在16～28 min。在24.3 min左右出现物质的高峰。图 6为乙醇对垫料物质的萃取结果，物质被检出的丰度较低，物质的保留时间集中在10～16 min。
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图 2 石油醚萃取层物质鉴定 Fig. 2 TIC of compounds in petroleum ether extraction layer |
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图 3 氯仿萃取层物质鉴定 Fig. 3 TIC of compounds in chloroform extraction layer |
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图 4 乙酸乙酯萃取层物质鉴定 Fig. 4 TIC of compounds in ethyl acetate extraction layer |
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图 5 丙酮萃取层物质鉴定 Fig. 5 TIC of compounds in acetone extraction layer |
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图 6 乙醇萃取层物质鉴定 Fig. 6 TIC of compounds in ethanol extraction layer |
统计5组不同有机溶剂对垫料中物质的提取率、总组分数量、相对含量在1%以上的组分数量以及1%以上组分的相对总含量值，结果(表 1)显示，垫料中物质的提取率随溶剂极性的增加而明显增大。弱极性的石油醚层和氯仿层，其物质提取率均较低，分别为0.041%和0.079%，随着极性的增加，有机溶剂的提取效果明显增强，中等极性的乙酸乙酯层和丙酮层的物质提取率分别为0.371%和0.540%，而在极性较大的乙醇溶剂中物质提取率可以达到1.13%。
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表 1 5种溶剂层物质分类分析 Tab.1 Classification of compounds extracted by 5 solvents |
通过GC-MS分析及谱库检索对垫料中的物质组分进行分析与鉴定，与物质提取率的结果类似，随着提取的溶剂的极性增大，物质总组分呈逐步增加的趋势，石油醚提取的物质的总组分为65种，含量在1%以上的组分有8种。氯仿、乙酸乙酯提取的物质总组分分别为73种和74种，其中含量在1%以上的物质组分分别为16种和19种。丙酮提取的物质的组分最多，达到了83种，其中含量在1%以上的组分为24种。但乙醇提取的物质组分只有52种，含量在1%以上的组分有14种。这是由于GC-MS对弱极性物质的检出度高，但极性高的物质在乙醇中的溶解度更好，因此乙醇提取的物质被GC-MS检出的较少，此结果与乙醇提取垫料组分的总离子图的结果相一致(图 6)。统计含量在1%以上的物质在总组分中的含量，结果显示5种溶剂提取的含量在1%以上的物质均占到总含量64%以上，表明所鉴定出的1%以上的组分为发酵垫料中的主要成分。
2.3 不同极性溶剂萃取物质鉴定利用NIST谱图库对GC-MS检测出的物质进行检索，统计相对含量在1%以上的物质，结果如表 2所示。
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表 2 5种溶剂层化学成分 Tab.2 Chemical compositions of extracts by 5 solvents |
进一步根据物质的化学性质，将不同有机溶剂提取的垫料中物质的组分统计归纳，可将其分为烃类、酯类、醇类、醛类、酮类、羧酸类和其他(包括胺、酚和烯/醇氧化物等)等7类物质，以各溶剂层中每一类物质的相对含量对物质种类作图，结果如图 7所示。石油醚对低极性的酯类物质的萃取效果最佳[如邻苯二甲酸-环己基甲基丁酯；1,2-苯二甲酸-单(2-乙基己基)酯；草酸-环丁基十五烷基酯和亚硫酸-2-丙基十三烷基酯等]，相对含量占石油醚层物质的60%。烷烃类物质次之，含量在20%左右，以极性弱的长链烷烃为主，如：四十三烷、二十八烷和二十四烷等。氯仿层对长链烷基酯的萃取效果最佳，相对含量占氯仿层物质的27%左右，如亚硫酸-2-丙基十三烷基酯、草酸-环丁基十七烷基酯、1,2-苯二甲酸丁辛基酯、邻苯二甲酸3-(2-甲氧基乙基)辛基酯等。对饱和烃的萃取效果与石油醚的效果相当，但对于甲基化修饰的烷烃及不饱和烯烃的萃取效果要优于石油醚，如2-甲基二十三烷和2-丙烯基环己烷。乙酸乙酯层的萃取物中，鉴定出较多的烯烃类化合物为萘及其萘的衍生物，达到乙酸乙酯层物质的78%以上。丙酮萃取的物质组分丰富，从烃类到酯类、醇类、醛类等适合于全物质萃取的需求。乙醇萃取的物质以极性高的酯类物质为主，如1,2-苯二甲酸-2(2-甲基丙基)酯、邻苯二甲酸-6-乙基-3-辛基异丁酯、1,2-苯二甲酸丁酯-2-甲基丙基酯等，占乙醇萃取物的78%。
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图 7 5组溶剂层物质分类分布 Fig. 7 Classification and distribution of compounds extracted by 5 solvents |
综上所述，发酵垫料中的主要物质分布是酯类和烃类，以及少量的醇类、醛类、酮类和其他(包括胺、酚和烯/醇氧化物等)。观察各萃取层中的物质分布，石油醚、氯仿和丙酮萃取层均是酯类为主，烃类其次，乙酸乙酯萃取层鉴定出含量较多的烯烃类化合物萘及其萘的衍生物，乙醇萃取层主要物质仍是酯类物质(图 7)。
3 讨论与结论本研究工作采用极性从低到高的5种有机溶剂对发酵床养猪中垫料成分进行物质提取，物质的提取率，乙醇最高，达到了1.13%，丙酮>乙酸乙酯>氯仿>石油醚。利用气相色谱质谱联用(GC-MS)技术进一步对不同有机溶剂萃取的物质进行分离鉴定。通过观察各有机层物质鉴定的总离子流图，可以初步判断该溶剂层萃取物组分的丰富程度和相对含量。结果显示，石油醚层和乙醇层的信号峰较少，氯仿层、乙酸乙酯层、丙酮层的信号峰较多，对应所鉴定出的主要成分也相对较为丰富。
李卿等[23]利用氢氧化钠溶液浸提，甲基醚萃取发酵床养猪垫料中挥发性有机酸，利用气相色谱法测定挥发性有机酸，检测的物质较少，灵敏度较低。本研究采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮和乙醇等5种从低级性到高极性的有机溶剂对垫料中的物质组分进行梯度萃取，并通过高灵敏度的气相色谱质谱联用仪实现物质组分的分析与鉴定，检测限小，测定的物质丰度高，种类全，同类研究中未见报道。
利用NIST谱图库检索，同时根据相似度 CAS 号实现定性、定量分析。根据组分理化性质的不同将所鉴定的物质划分为7类：烃类、酯类、醇类、醛类、酮类、羧类和其他(包括胺、酚和烯/醇氧化物等)。不同极性的溶剂对物质组分的提取效率差别很大，其中石油醚和氯仿对低极性的酯类物质和长链烷烃的提取效果较好，但氯仿层提取的种类更多，对不饱和烃的提取效果要优于石油醚层；乙酸乙酯对烯烃类化合物(包括多环芳烃)有较好的提取效果；丙酮适合全物质提取，对垫料中低极性的烷烃组分到高极性酯组分的提取效果均较好；乙醇溶剂适合极性较高的酯类物质的提取，如苯二甲酸类酯。
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