Effects of Vectors on Transient Expression of GFP in CHO Cells
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摘要:目的 ExpiCHO细胞瞬时表达能够快速有效地生产重组蛋白，为筛选有效的重组蛋白节省了大量的时间，细胞系的选择、表达载体的选择、转染试剂的选择等是制约ExpiCHO细胞瞬时表达蛋白的重要因素，本研究旨在筛选出在CHO细胞中瞬时表达量较高的载体。方法 以GFP基因作为目的基因，用不同的真核表达载体构建GFP重组质粒，瞬时转染ExpiCHO-S细胞。转染后4 d观察不同载体表达GFP的荧光数量和强度；转染后8 d对细胞进行裂解，收获裂解上清，用SDS-PAGE对不同载体的表达量进行鉴定。同时用His Trap FF亲和层析柱对裂解上清中的GFP蛋白进行纯化，通过Western Blot比较不同载体GFP蛋白的表达量。结果 pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP载体表达的荧光数量最多，pCIneo-GFP载体表达的荧光强度最强，pCMVHA载体表达的荧光数量最少，荧光强度最弱。SDS-PAGE和Western Blot结果均表明pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCIneo-GFP重组质粒的蛋白表达量高于pCHO-GFP、pCMVHA-GFP重组质粒的蛋白表达量。结论 筛选出表达量较高的真核表达载体pCDNA3.1、pCDNA3.4、pCIneo，为后续重组蛋白的瞬时表达载体选择提供依据。Abstract:Objective Appropriate cell line, expression vector, and transfection reagent were selected to enhance the transient expression of GFP recombinant protein for quick and efficient production of the proteins in CHO cells.Methods Targeting GFP, various eukaryotic vectors were employed to carry the gene protein for transfection into ExpiCHO-S cells. Four days after transfection, number and intensity of expression fluorescence on the recombinant plasmids by different vectors were recorded. Four more days later, the cells were lysed, and the lysate supernatant harvested to verify the gene expressions by SDS-PAGE. Meanwhile, GFP recombinant plasmids in the supernatant were purified on a His Trap FF affinity chromatography column to quantify the protein expressions by western blot.Results The recombinant plasmids, pCDNA3.1-GFP and pCDNA3.4-GFP had the expression fluorescence the greatest in number, pCIneo-GFP the highest on intensity, while pCMVHA the fewest in number and the lowest on intensity. SDS-PAGE and western blot showed the expressions of the first 3 recombinant plasmids were higher than those of pCHO-GFP or pCMVHA-GFP.Conclusion The GFP recombinant plasmids constructed with the eukaryotic vectors, pCDNA3.1, pCDNA3.4, and pCIneo, exhibited the greatest expressions and were considered the choice vectors for future studies requiring transient expression.
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Keywords:
- GFP /
- CHO cells /
- eukaryotic expression vector
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0. 引言
【研究意义】中国仓鼠卵巢（Chinese hamsters Ovary, CHO）细胞由于表达的目的蛋白具有正确的翻译后修饰，与天然产物的生物学特性十分相近[1]，常用作研究重组蛋白质的首选宿主细胞[2]。CHO瞬时表达系统中目的基因以质粒DNA的形式存在于细胞中[3]，具有时间短、高通量、操作简单、可放大等优势，能够在短时间内获得不同的候选重组蛋白，为药物开发或疫苗研究节省大量时间和成本[4]。许多因素会影响CHO系统的表达水平，例如表达载体和宿主细胞的选择，DNA质量和转染方法以及培养工艺优化等[5]，蛋白表达量的高低主要取决于基因的转录和翻译水平，转录调控主要依赖于顺式作用元件和反式作用因子，分别由表达载体和宿主细胞提供，表达载体的结构及相关元件组成是影响外源基因转录的重要因素。因此，表达载体的选择对ExpiCHO表达系统表达外源蛋白至关重要[6]。【前人研究进展】基本的真核表达组件包括启动子元件、增强子元件、加poly（A）信号以及用于复制和选择的元件。不同的真核表达载体由不同的启动子进行驱动，启动子在整合和转录信号加工过程中发挥关键作用[7]。高效的启动子是CHO细胞表达重组蛋白质所必需的[8]。研究表明，CHO细胞常用的启动子有病毒启动子、异源启动子、内源性和诱导性启动子等[9]，如常用的人巨细胞病毒启动子（Cytomegalovirus promoter, CMV启动子）是公认的最强真核启动子，猿猴病毒40（Simian virus 40, SV40）启动子具有组织/细胞的选择特异性[10-13]。【本研究切入点】表达载体的选择成为制约CHO细胞瞬时生产蛋白的重要因素之一，筛选出表达量较高的载体，能为筛选有效的重组蛋白节省大量的时间。目前已有研究单独CMV和SV40启动子，但未研究表达载体同时含有CMV和SV40启动子的表达量。本研究使用的载体均含有CMV和SV40启动子，通过对比蛋白表达量可筛选出合适的表达载体。【拟解决的关键问题】本研究以常用的标记蛋白GFP作为目的基因，通过构建不同载体的GFP重组表达质粒，瞬时转染ExpiCHO-S细胞，通过荧光强度及细胞裂解产物的SDS-PAGE鉴定，筛选出表达量较高的表达载体，为重组蛋白瞬时表达载体的选择提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 菌种、质粒及细胞
TOP10感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；真核表达载体pCHO1.0、pCDNA3.1、pCDNA3.4、pCIneo、pCMVHA、pAcGFP由国家兽用药品工程技术研究中心保存，ExpiCHO-S细胞由国家兽用药品工程技术研究中心保存。
1.2 主要试剂
快速质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Endo-free Plasmid Midi Kit、Gel Extraction Kit均购自OMEGA公司；T4 DNA连接酶、Nhe I、Xba I、Xho I、Hind III、Eco RI、AvrⅡ和Bstz 17I限制性内切酶、ExpiCHOTM Expression Medium、ExpiFectamineTM CHO试剂、OptiPROTM SFM、ExpiCHOTM增强剂、ExpiCHOTM辅料、细胞裂解液、GFP单克隆抗体、HRP标记羊抗鼠的抗体均购自Thermo公司；His Trap FF亲和层析柱购自GE公司。
1.3 GFP片段的扩增
根据 GenBank 中登录的 GFP基因全长序列（LN515608.1），利用DNAStar5.0针对不同载体设计扩增GFP基因的引物，如表1所示。以pAcGFP质粒为模板扩增GFP片段，片段大小约为735 bp。PCR反应程序：95 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。
表 1 不同载体的酶切位点及引物序列Table 1. Digestion sites and primer sequences on different vectors载体名
Vectors上游引物序列
Sequence of upstream primers下游引物序列
Sequence of downstream primers上游酶切位点
Upstream restriction site下游酶切位点
Downstream cleavage sitepCDNA3.1 CTAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATC CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Nhe I Xho I pCDNA3.4 CTAGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCAT GGGAAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Xba I Hind III pCMVHA CCGGAATTCGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCA CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Eco RI Xho I pCIneo CTAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATC CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Nhe I Xho I pCHO1.0 CCGCCTAGGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACC CGGGTATACTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Avr II Bstz 17I 注：斜体碱基为酶切位点。
Note: The italic bases are restriction sites.1.4 GFP重组质粒的构建
将GFP片段和表达载体分别用对应的限制性内切酶双酶切，根据目的片段和载体大小（表2），回收相应的目的基因片段和载体片段，T4 DNA连接酶于22 ℃连接1 h，连接产物转化TOP10感受态细胞，对应抗性LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送金唯智生物科技有限公司测序。将测序正确质粒的菌液扩大培养后用Endo-free Plasmid Midi Kit提取质粒，测定浓度，以备转染使用。
表 2 不同载体片段大小Table 2. Fragment sizes of different vectors载体名称 Vectors 载体大小 Vectors size/bp pCDNA3.1 5 333 pCDNA3.4 6 010 pCMVHA 3 782 pCIneo 5 747 pCHO 12 988 1.5 ExpiCHO-S细胞表达GFP蛋白
取出冻存的ExpiCHO-S细胞，37 ℃水浴复苏后培养，当密度达到每毫升4×106～6×106个活细胞时进行细胞传代，细胞至少传两代后进行转染。转染前细胞计数，用ExpiCHOTM Expression Medium将细胞稀释至每毫升6×106个活细胞，转染所用体积为25 mL。
按照ExpiFectamineTM CHO转染试剂的操作步骤进行转染，简要操作如下：将20 μg重组质粒加入1 mL OptiPROTM SFM中进行稀释，取80 μL ExpiFectamineTM CHO试剂加入1 mL OptiPROTM SFM中进行稀释，将稀释的ExpiFectamineTM CHO试剂加入稀释的重组质粒中，混匀后室温孵育5 min，然后将溶液慢慢转移至稀释好的细胞中，添加过程中轻轻晃动培养瓶，置于37 ℃ 8% CO2 120 r·min−1轨道摇床培养。转染后18～22 h加入150 μL ExpiCHOTM增强剂和6 mL ExpiCHOTM辅料。
转染后4 d，无菌打开培养瓶盖子，移液枪吸取200 μL细胞培养物，混匀后取50 μL进行计数。根据计数结果在细胞计数板中加入相同数量的细胞，在荧光显微镜下观察含荧光的细胞数量及荧光强弱，使用ImageJ软件计数相同区域的荧光细胞数目。
1.6 GFP蛋白的纯化
当培养至第7 d，细胞活率降为80%左右时，将细胞培养物全部转移至50 mL离心管中，4 ℃ 5 000 r·min−1离心20 min，收获细胞培养物沉淀。取等体积的沉淀，加入相同体积的裂解液，冰上孵育20 min，4 ℃ 5 000 r·min−1离心20 min，收获裂解上清，裂解上清进行SDS-PAGE。裂解上清中加入9倍体积的 BufferA进行稀释，0.45 μm滤器过滤，按照His Trap FF亲和层析柱使用说明书进行纯化，纯化后蛋白洗脱体积均为每管1 mL，使用GFP单抗对相同体积的纯化产物进行Western Blot分析。将pCMVHA-GFP重组质粒表达后纯化到的蛋白作为对照，使用ImageJ软件分析其他4个纯化后的GFP蛋白与对照的灰度比值。
2. 结果与分析
2.1 GFP重组质粒的构建
将扩增出的GFP片段和表达载体分别用对应的内切酶进行双酶切，回收GFP片段与载体进行连接，转化后提取质粒进行酶切鉴定，结果重组质粒均可切出约735 bp的片段及大小分别为12 988、5 333、6 010、5 747、3 782 bp的载体片段（图1），与预期结果符合，测序结果进一步表明GFP基因序列全部正确，未发生突变或移码，表明不同载体的GFP重组质粒构建成功。
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图 1 不同载体构建GFP重组质粒双酶切结果注：M1：DNA Marker；1：pCHO-GFP重组质粒酶切；2：pCDNA3.1-GFP重组质粒酶切；3：pCDNA3.4-GFP重组质粒酶切；4：pCIneo-GFP重组质粒酶切；5：pCMVHA-GFP重组质粒酶切；M2：DNA Marker。Figure 1. Restriction map of GFP recombinant plasmids carried by different vectorsNote: M1: DNA marker; 1: digestion site for pCHO-GFP recombinant plasmid; 2: digestion site for pCDNA3.1-GFP recombinant plasmid; 3: digestion site for pCDNA3.4-GFP recombinant plasmid; 4: digestion site for pCIneo-GFP recombinant plasmid; 5: digestion site for pCMVHA-GFP recombinant plasmid; M2: DNA marker.2.2 GFP蛋白的表达
用Endo-free Plasmid Midi Kit提取5种重组质粒，转染ExpiCHO-S细胞，转染后4 d收取细胞培养物，在荧光显微镜下均可观察到特异的绿色荧光，如图2所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP载体表达的荧光数量最多，pCIneo-GFP载体表达的荧光强度最强，pCMVHA载体表达的荧光数量最少，荧光强度最弱。使用ImageJ软件计数相同区域的荧光细胞数目，结果如表3所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP载体表达的荧光细胞数量较多，pCMVHA载体表达的荧光细胞数量最少。表明这5种表达载体都能够在CHO细胞中正常表达GFP蛋白，但是表达量有差异。
表 3 不同载体表达GFP蛋白的荧光细胞数Table 3. Number of fluorescent cells expressing GFP by different vectorsGFP蛋白表达载体
GFP protein
expression vector荧光细胞数量
The number of
fluorescent cellspCDNA3.1 168 pCDNA3.4 110 pCIneo 47 pCHO 151 pCMVHA 58 2.3 GFP蛋白的SDS-PAGE及Western blot鉴定
细胞活率降至80%左右时收获细胞培养物，离心后将细胞沉淀进行裂解，细胞裂解上清进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。与ExpiCHO细胞裂解上清相比，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCINeo-GFP重组质粒表达的细胞裂解上清在约30 kD处均出现清晰的特异条带，但pCHO-GFP、pCMVHA-GFP重组质粒表达的细胞裂解上清特异条带不明显。SDS-PAGE与荧光结果基本一致，表明pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP、pCIneo-GFP重组质粒的蛋白表达量高于pCHO-GFP、pCMVHA-GFP重组质粒的蛋白表达量。
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图 3 SDS-PAGE分析转染后4 d GFP蛋白的表达注：M：Protein Marker；1：ExpiCHO细胞裂解上清；2：pCDNA3.1-GFP细胞裂解上清；3：pCDNA3.4-GFP细胞裂解上清；4：pCIneo-GFP细胞裂解上清；5：pCHO-GFP细胞裂解上清；6：pCMVHA-GFP细胞裂解上清。Figure 3. SDS-PAGE on GFP expression 4 d after transfectionNote: M: Protein marker; 1: ExpiCHO cell lysate supernatant; 2: cell lysate supernatant (pCDNA3.1-GFP); 3: cell lysate supernatant (pCDNA3.4-GFP); 4: cell lysate supernatant (pCIneo-GFP); 5: cell lysate supernatant (pCHO-GFP); 6: cell lysate supernatant (pCMVHA-GFP).收获的细胞裂解上清利用His Trap FF亲和层析柱纯化后，GFP单抗对相同体积的纯化产物进行Western Blot分析，如图4所示，ExpiCHO细胞裂解上清无特异条带出现，其他5个表达载体在约30 kD处均有特异条带出现。将pCMVHA-GFP重组质粒表达后纯化到的蛋白作为对照，使用ImageJ软件分析其他4个纯化后的GFP蛋白，结果如表4所示，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP重组质粒表达纯化后的蛋白灰度比值较高，4个纯化后的GFP蛋白灰度比值均大于1。表明纯化获得不同载体表达的GFP蛋白，pCDNA3.1-GFP、pCDNA3.4-GFP重组质粒的蛋白表达量较高，pCMVHA-GFP重组质粒的蛋白表达量最低。
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图 4 Western Blot分析纯化后的GFP蛋白注：1：ExpiCHO细胞裂解上清；2：GFP蛋白（pCMVHA）纯化后；3：GFP蛋白（pCHO）纯化后；4：GFP蛋白（pCIneo）纯化后；5：GFP蛋白（pCDNA3.4）纯化后；6：GFP蛋白（pCDNA3.1）纯化后；M：Protein Marker。Figure 4. Western blot on purified GFP proteinNote: 1: ExpiCHO cell lysate supernatant; 2: purified GFP protein (pCMVHA); 3: purified GFP protein (pCHO); 4: purified GFP protein (pCIneo); 5: purified GFP protein (pCDNA3.4); 6: purified GFP protein (pCDNA3.1); M: Protein marker.表 4 不同载体表达GFP蛋白的灰度比值Table 4. Gray ratio of vectors expressing GFPGFP蛋白表达载体
GFP protein expression vector灰度比值
Gray ratiopCMVHA 1.00 pCHO 1.36 pCIneo 2.13 pCDNA3.4 2.68 pCDNA3.1 3.19 3. 讨论
哺乳动物细胞是表达外源蛋白的最佳宿主细胞，其具有稳定遗传、接近于天然的正确翻译后修饰功能、分泌到细胞外以利于纯化等优点[14]。CHO细胞已成为抗体类药物生产的首选哺乳动物细胞[15]，寻求高效稳定的CHO细胞表达载体是重组蛋白稳定高水平表达的重要步骤。
本研究选择GFP标签蛋白为目的蛋白，构建了5种不同的真核表达质粒，瞬时转染CHO细胞后鉴定表明pCDNA3.4、pCDNA3.1、pCIneo载体的表达量处于较高水平，而pCHO和pCMVHA载体的表达量处于较低水平。pcDNA3.4是组成型高量表达载体，相比pCDNA3.1载体，使用了全长的人巨细胞即刻早期增强子/启动子，并且在多克隆位点后插入了一个土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（Woodchuck posttranscriptional regulatory element, WPRE），能够增强目的基因的转录水平，研究结果中pCDNA3.4载体的表达量略高于pCDNA3.1载体，也间接证明了改造后的pCDNA3.4载体可以提高目的基因表达量。pCIneo载体使用和pCDNA3.4载体相同的人巨细胞即刻早期增强子/启动子，同时在多克隆位点前面加入了提高mRNA稳定性的嵌合内含子序列，表达水平略低于pCDNA3.4。pCHO载体为Thermo公司开发的用于稳转细胞株构建的载体，在本研究中用于瞬时表达未体现出优势。pCMVHA同样使用了人巨细胞即刻早期增强子/启动子，在多克隆位点的5′端含有HA标签，便于使用抗HA的抗体进行目的蛋白检测和分离纯化，在本研究中GFP蛋白的表达上也未体现出优势。推测载体的启动子/增强子序列在蛋白表达量中也存在影响。
对于不同理化特性的目的蛋白，影响其表达量的因素很多，但是表达载体的选择具有一定程度的通用性，本研究为用CHO细胞进行其他蛋白的瞬时表达载体选择提供了参考，可以在一定程度上节省载体筛选时间。
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图 1 不同载体构建GFP重组质粒双酶切结果
注：M1：DNA Marker；1：pCHO-GFP重组质粒酶切；2：pCDNA3.1-GFP重组质粒酶切；3：pCDNA3.4-GFP重组质粒酶切；4：pCIneo-GFP重组质粒酶切；5：pCMVHA-GFP重组质粒酶切；M2：DNA Marker。
Figure 1. Restriction map of GFP recombinant plasmids carried by different vectors
Note: M1: DNA marker; 1: digestion site for pCHO-GFP recombinant plasmid; 2: digestion site for pCDNA3.1-GFP recombinant plasmid; 3: digestion site for pCDNA3.4-GFP recombinant plasmid; 4: digestion site for pCIneo-GFP recombinant plasmid; 5: digestion site for pCMVHA-GFP recombinant plasmid; M2: DNA marker.
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图 3 SDS-PAGE分析转染后4 d GFP蛋白的表达
注：M：Protein Marker；1：ExpiCHO细胞裂解上清；2：pCDNA3.1-GFP细胞裂解上清；3：pCDNA3.4-GFP细胞裂解上清；4：pCIneo-GFP细胞裂解上清；5：pCHO-GFP细胞裂解上清；6：pCMVHA-GFP细胞裂解上清。
Figure 3. SDS-PAGE on GFP expression 4 d after transfection
Note: M: Protein marker; 1: ExpiCHO cell lysate supernatant; 2: cell lysate supernatant (pCDNA3.1-GFP); 3: cell lysate supernatant (pCDNA3.4-GFP); 4: cell lysate supernatant (pCIneo-GFP); 5: cell lysate supernatant (pCHO-GFP); 6: cell lysate supernatant (pCMVHA-GFP).
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图 4 Western Blot分析纯化后的GFP蛋白
注：1：ExpiCHO细胞裂解上清；2：GFP蛋白（pCMVHA）纯化后；3：GFP蛋白（pCHO）纯化后；4：GFP蛋白（pCIneo）纯化后；5：GFP蛋白（pCDNA3.4）纯化后；6：GFP蛋白（pCDNA3.1）纯化后；M：Protein Marker。
Figure 4. Western blot on purified GFP protein
Note: 1: ExpiCHO cell lysate supernatant; 2: purified GFP protein (pCMVHA); 3: purified GFP protein (pCHO); 4: purified GFP protein (pCIneo); 5: purified GFP protein (pCDNA3.4); 6: purified GFP protein (pCDNA3.1); M: Protein marker.
表 1 不同载体的酶切位点及引物序列
Table 1 Digestion sites and primer sequences on different vectors
载体名
Vectors上游引物序列
Sequence of upstream primers下游引物序列
Sequence of downstream primers上游酶切位点
Upstream restriction site下游酶切位点
Downstream cleavage sitepCDNA3.1 CTAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATC CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Nhe I Xho I pCDNA3.4 CTAGTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCAT GGGAAGCTTTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Xba I Hind III pCMVHA CCGGAATTCGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCA CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Eco RI Xho I pCIneo CTAGCTAGCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACCGGCATC CGGCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Nhe I Xho I pCHO1.0 CCGCCTAGGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCCGAGCTGTTCACC CGGGTATACTTAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCATC Avr II Bstz 17I 注：斜体碱基为酶切位点。
Note: The italic bases are restriction sites.
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表 2 不同载体片段大小
Table 2 Fragment sizes of different vectors
载体名称 Vectors 载体大小 Vectors size/bp pCDNA3.1 5 333 pCDNA3.4 6 010 pCMVHA 3 782 pCIneo 5 747 pCHO 12 988
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表 3 不同载体表达GFP蛋白的荧光细胞数
Table 3 Number of fluorescent cells expressing GFP by different vectors
GFP蛋白表达载体
GFP protein
expression vector荧光细胞数量
The number of
fluorescent cellspCDNA3.1 168 pCDNA3.4 110 pCIneo 47 pCHO 151 pCMVHA 58
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表 4 不同载体表达GFP蛋白的灰度比值
Table 4 Gray ratio of vectors expressing GFP
GFP蛋白表达载体
GFP protein expression vector灰度比值
Gray ratiopCMVHA 1.00 pCHO 1.36 pCIneo 2.13 pCDNA3.4 2.68 pCDNA3.1 3.19
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[1] 郭景亮. 中国仓鼠卵巢细胞表达外源蛋白研究进展 [J]. 生物技术世界, 2016(4):321. GUO J L. Research progress of foreign protein expression in Chinese hamster ovary cells [J]. Biotech World, 2016(4): 321.(in Chinese)
[2] 温家明, 聂艳峰, 梁翰章, 等. MG-132提高TNFR-Fc融合蛋白在CHO细胞中表达的研究 [J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(9):1−6. WEN J M, NIE Y F, LIANG H Z, et al. MG-132 improve the production of TNFR-Fc fusion protein in CHO cells [J]. China Biotechnology, 2015, 35(9): 1−6.(in Chinese)
[3] 韩阳, 蔡洁行, 张朗, 等. 重组蛋白的CHO细胞瞬时表达体系的研究进展 [J]. 药物生物技术, 2017, 24(3):243−248. HAN Y, CAI J H, ZHANG L, et al. Development of CHO system used for transiently expressing recombinant proteins [J]. Pharmaceutical Biotechnology, 2017, 24(3): 243−248.(in Chinese)
[4] 孙静静, 李桂林, 周雷鸣, 等. 哺乳动物细胞瞬时转染技术研究进展 [J]. 中国医药生物技术, 2019, 14(3):253−257. DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2019.03.010 SUN J J, LI G L, ZHOU L M, et al. Advances in transient transfection technology of mammalian cells [J]. Chinese Medicinal Biotechnology, 2019, 14(3): 253−257.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2019.03.010
[5] 刘国奇, 王海涛. 外源蛋白在中国仓鼠卵巢细胞中高效表达的策略 [J]. 生物化学与生物物理进展, 2000, 27(5):496−500. DOI: 10.3321/j.issn:1000-3282.2000.05.011 G Q, WANG H T. Optimized strategies to hyperexpress recombinant protein in Chinese hamster ovary cells [J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2000, 27(5): 496−500.(in Chinese) DOI: 10.3321/j.issn:1000-3282.2000.05.011
[6] 申烨华, 耿信笃. CHO细胞表达系统研究新进展 [J]. 生物工程进展, 2000, 20(4):23−25, 22. DOI: 10.3969/j.issn.1671-8135.2000.04.005 SHEN Y H, GENG X D. The recent progress in the upstream studies on the culture with CHO cell [J]. Progress in Biotechnology, 2000, 20(4): 23−25, 22.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1671-8135.2000.04.005
[7] OLIVEIRA C, DOMINGUES L. Guidelines to reach high-quality purified recombinant proteins [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2018, 102(1): 81−92. DOI: 10.1007/s00253-017-8623-8
[8] HEINTZMAN N D, REN B. The gateway to transcription: Identifying, characterizing and understanding promoters in the eukaryotic genome [J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2007, 64(4): 386−400. DOI: 10.1007/s00018-006-6295-0
[9] JAIN N K, BARKOWSKI-CLARK S, ALTMAN R, et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293 [J]. Protein Expression and Purification, 2017, 134: 38−46. DOI: 10.1016/j.pep.2017.03.018
[10] KAUFMAN R J, WASLEY L C, SPILIOTES A J, et al. Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells [J]. Molecular and Cellular Biology, 1985, 5(7): 1750−1759. DOI: 10.1128/MCB.5.7.1750
[11] 王稳, 王天云. CHO细胞表达系统启动子 [J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2019, 35(11):1175−1182. WANG W, WANG T Y. Promoters used in the CHO cell expression system [J]. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2019, 35(11): 1175−1182.(in Chinese)
[12] WANG D Y, DAI W, WU J, et al. Improving transcriptional activity of human Cytomegalovirus major immediate-early promoter by mutating NF-κB binding sites [J]. Protein Expression and Purification, 2018, 142: 16−24. DOI: 10.1016/j.pep.2017.09.008
[13] HO S C L, MARIATI, YEO J H M, et al. Impact of using different promoters and matrix attachment regions on recombinant protein expression level and stability in stably transfected CHO cells [J]. Molecular Biotechnology, 2015, 57(2): 138−144. DOI: 10.1007/s12033-014-9809-2
[14] DOVERSKOG M, LJUNGGREN J, ÖHMAN L, et al. Physiology of cultured animal cells [J]. Journal of Biotechnology, 1997, 59(1/2): 103−115.
[15] RODRIGUEZ J, SPEARMAN M, HUZEL N, et al. Enhanced production of monomeric interferon-β by CHO cells through the control of culture conditions [J]. Biotechnology Progress, 2008, 21(1): 22−30. DOI: 10.1021/bp049807b
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