Isolation and Molecular Identification of Ammonia-nitrogen Degrading Bacterium,JN-2
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摘要: 研究降解污水中氨氮污染物的微生物资源和分子系统特征。从大型养殖场的活性污泥中分离到1株能降解氨氮的菌株JN-2。利用筛选培养基分离得到氨氮降解菌,对菌株进行生理生化试验和16SrDNA基因测序,并构建系统发育树。结果表明JN-2菌株在28℃和pH 7条件下,24h内可以将初始质量浓度为200mg·L-1的NH4+-N降解75.6%。对构建的菌株系统发育树进行分析,发现菌株JN-2与苍白杆菌属的同源性达100%,因此推断JN-2菌属于苍白杆菌,菌株的16SrDNA序列在GenBank的登录号为JX535021。游离菌株对养殖污水的氨氮处理效率为30.1%,固定化小球对养殖污水的氨氮处理效率为62.8%。Abstract: This paper reports the resources and molecular phylogeny of the microbes that degrade ammonia-nitrogen pollutants in sewer.An efficient strain,JN-2,was isolated from the sludge in a large livestock farm.A screening medium was used to isolate the strain.Its biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence were determined to construct the phylogenetic tree.The results indicated that JN-2′s NH+4-N degrading efficiency per 24 h at 28℃ and pH 7 was 75.6% of its initial concentration of 200 mg·L-1.The accession number of its 16S rDNA gene sequence in GeneBank was JX535021.The phylogenetic tree showed that JN-2 had an 100% homology to Ochrobactrum sp..The NH+4-N reduction on sewer by the free-state JN-2 was 30.1%,and by the immobilized strain,62.8%.
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石斛兰Dendrobium，是兰科石斛属多年生草本植物。其花姿优雅，花色鲜艳，花期长，观赏价值极高，与卡特兰、蝴蝶兰、万代兰并列为观赏兰花的“四大天王”[1]。石斛兰不仅是重要的切花和盆栽园艺品种，部分石斛兰品种同时也是珍贵的中药材[2]，其中金钗石斛、铁皮石斛、马鞭石斛及其近似种还被收录在《中国药典》中。在中药及观赏花卉产业，对品种准确的鉴定显得尤为必要，这是保证药用石斛安全性和观赏石斛新品种选育的重要前提[3]。但是由于石斛兰的产地不同，用途广泛，存在着同名异物和同物异名的现象，仅仅依靠形态学鉴定是不够的，因此需要借助更为准确稳定的方法对不同品种石斛兰进行有效的鉴定。
随着分子生物学技术的发展，分子标记技术因其方法相对简便、多态性高且不受生长环境影响等众多优点，成为目前种质资源鉴定的高效技术手段之一[4]。序列相关扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记是一种通过独特的引物设计对开放阅读框(Open readings frames, ORFs)进行扩增的新型分子标记，吸收了RFLP、RAPD、SSR和AFLP等分子标记的优点，具有操作过程简单、扩增条带清晰、结果稳定、重复性高等特点[5]，目前已广泛应用于国兰[6]、杂交兰[7]、甘薯[8]、红花属[9]、花椒[10]、芸薹属[11]等多种植物种质鉴定、重要性状标记、遗传多样性及遗传图谱构建等研究中。在石斛属植物中也有SRAP分子标记被利用的研究报道，如铁皮石斛及其相似种的鉴定分析[12]、经辐射后的石斛兰组培苗的检测分析[13]、不同来源地铁皮石斛的遗传变异和保护研究[14]，但有关该标记应用于石斛兰种质资源多样性的研究还相对较少。本研究利用SRAP分子标记对包括药用石斛和观赏石斛在内的48份品种资源进行分析，以期从分子水平确定石斛兰种质资源亲缘关系，为石斛兰品种鉴定、品种保护及后期的杂交育种提供理论依据，从而推动石斛资源更深层的开发利用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试的48份石斛兰品种(表 1)来源于福建省农业科学院作物研究所兰花种质资源圃。
表 1 供试材料Table 1. Materials tested编号 品种名 1 鼓槌石斛 2 流苏石斛 3 铁皮石斛 4 铜皮石斛 5 金钗石斛 6 秋石斛D46 7 晶帽石斛 8 蜂腰石斛 9 玫瑰石斛 10 球花石斛 11 长苏石斛 12 秋石斛D2015129 13 肿节石斛 14 黄喉石斛 15 黄橙石斛 16 曲轴石斛 17 檀香石斛 18 血喉石斛 19 麝香石斛 20 本斯石斛 21 叉唇石斛 22 红蜻蜓石斛 23 金果石斛 24 红灯笼石斛 25 黄贝壳石斛 26 秋石斛D2015117 27 密花石斛 28 扭瓣石斛 29 剑叶石斛 30 亮叶石斛 31 报春石斛 32 董黑毛石斛 33 澳洲石斛 34 兜唇石斛 35 重唇石斛 36 秋石斛D2015123 37 霍山石斛 38 秋石斛-三亚阳光 39 秋石斛-水晶 40 秋石斛-出水芙蓉 41 秋石斛-画眉 42 秋石斛-樱桃红 43 秋石斛-红粉佳人 44 秋石斛D2015114 45 秋石斛D2015121 46 秋石斛-TretesMoon 47 秋石斛D2015127 48 秋石斛D2015128 1.2 试验方法
1.2.1 石斛兰叶片DNA的提取
选取各份供试材料的新鲜叶片约0.5 g，采用改良CTAB法[15]进行总DNA的提取，提取完成后，利用分光光度计法检测其浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，产物于-20℃条件下保存备用。
1.2.2 石斛兰SRAP-PCR扩增
参考Budak等[16]的引物，由10条正向引物和10条反向引物，随机组成100对引物组合。PCR反应体系的总体积为25 μL，其中含有100 ng·μL-1的模板DNA 1.0 μL，10 μmol·L-1 的上、下游引物各1.0 μL，含Mg2+的Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·L-1的dNTPs 2.0 μL，5 U·μL-1的Taq 聚合酶0.25 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR扩增程序参照钟淮钦等[7]的研究，采用变温复性反应程序。程序结束后，利用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，观察电泳图谱并拍照保存。
1.3 数据分析
根据电泳图谱，利用人工方法进行DNA条带数的统计，在相同迁移位置上有扩增条带的标记为1，无条带的则记为0，并构建原始数据矩阵。应用NTSYS- pc2.10e软件进行聚类分析，获得聚类图；利用EXCEL软件计算引物的多态性比率和多态性信息含量(PIC)。
2. 结果与分析
2.1 石斛兰SRAP标记引物的筛选
将提取获得的48份石斛兰品种DNA稀释至相同浓度备用，并随机选择其中的2份样本进行100对SRAP引物的初步筛选，筛选出32对能扩增出明显条带的引物。而后，利用48份石斛兰品种DNA样本进行SRAP引物的进一步筛选，以明确初步筛选引物对其他石斛兰品种的可用性。结果发现，在32对初筛选引物中有14对引物的扩增条带清晰且多态性丰富。图 1为引物组合Me1+Em8的扩增结果。
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图 1 引物Me1+Em8在48个石斛兰品种中的扩增Figure 1. Amplified Me1+Em8 primers of 48 Dendrobium cultivars2.2 SRAP标记的多态性分析
对筛选出来的14对SRAP引物在48份石斛兰种质资源中的扩增结果进行分析发现(表 2)，在所有供试材料中共获得159个条带，平均每对引物扩增11.4个条带；获得多态性条带数为155个，引物组合Me1+Em8扩增的多态性条带数最多，为15个，紧随其后的是引物组合Me1+Em2的14个多态性条带和引物组合Me3+Em4的13个多态性条带，而引物组合Me3+Em6仅扩增到7个多态性条带，平均每对引物扩增到11.1个多态性条带。各引物的多态性比率分布为90.00%~100.00%，除了引物组合Me4+Em2、Me7+Em2、Me10+Em2及Me10+Em8外，其他引物组合的多态性比率均为100.00%。对14对SRAP引物的多态性信息含量分析结果显示，其分布范围为0.718~0.903，每对引物平均多态性信息含量为0.828，引物组合Me6+Em10的多态性信息含量最高，而引物组合Me4+Em2的多态性信息含量最低(表 2)。以上结果表明石斛兰SRAP的多态性信息含量较为丰富。
表 2 石斛兰SRAP标记多态性分析Table 2. Information on SRAP markers in Dendrobium引物名 引物序列 总条带 多态性条带 多态性比率/% 多态性信息含量 Me1+Em2 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 14 14 100.00 0.900 Me1+Em3 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′；5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′ 9 9 100.00 0.829 Me1+Em8 5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′；5′-GACTGCGTACGAATTCTG-3′ 15 15 100.00 0.884 Me2+Em1 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′；5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′ 9 9 100.00 0.840 Me2+Em10 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTAG-3′ 12 12 100.00 0.880 Me3+Em4 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′ 13 13 100.00 0.900 Me3+Em6 5′-TGAGTCCAAACCGGAAT-3′；5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′ 7 7 100.00 0.779 Me4+Em2 5′-TGAGTCCAAACCGGACC-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 13 12 92.31 0.718 Me6+Em6 5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′；5′-GACTGCGTACGAATTGCA-3′ 11 11 100.00 0.868 Me6+Em10 5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTAG-3′ 12 12 100.00 0.903 Me7+Em2 5′-TGAGTCCAAACCGGTCC-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 10 9 90.00 0.730 Me8+Em5 5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′；5′-GACTGCGTACGAATTAAC-3′ 11 11 100.00 0.839 Me10+Em2 5′-TGGGGACAACCCGGCTT-3′；5′-GACTGCGTACGAATTTGC-3′ 12 11 91.67 0.798 Me10+Em8 5′-TGGGGACAACCCGGCTT-3′；5′-GACTGCGTACGAATTCTG-3′ 11 10 90.91 0.724 2.3 48份石斛兰品种资源的聚类分析
以EXCEL中记录的0, 1型数据为基础，利用NTSYS- pc2.10e软件，构建48份石斛兰品种资源的聚类图(图 2)。结果显示，48份石斛兰品种间的遗传距离为0.15~0.97，其中，秋石斛D2015127品种和秋石斛D2015128品种的亲缘关系最近。
在遗传距离为0.83处，48个石斛兰品种分为7大聚类群：第Ⅰ类包括13个品种，有鼓槌石斛、流苏石斛、铁皮石斛、细茎石斛、金钗石斛、霍山石斛、晶帽石斛、肿节石斛、黄喉石斛、蜂腰石斛、玫瑰石斛、球花石斛及血喉石斛，这些品种中包括了几种较为常见的药用石斛；第Ⅱ类包括3个品种，有红蜻蜓石斛、金果石斛和红灯笼石斛；第Ⅲ类有4个品种，为檀香石斛、麝香石斛、叉唇石斛、本斯石斛；第Ⅳ类含4个品种，其中有黄橙石斛、曲轴石斛、澳洲石斛、董黑毛石斛；第Ⅴ类有15个品种，秋石斛D46、长苏石斛、秋石斛D2015129、秋石斛D2015123、秋石斛-三亚阳光、秋石斛-水晶、秋石斛-出水芙蓉、秋石斛-画眉、秋石斛-樱桃红、秋石斛-红粉佳人、秋石斛D2015121、秋石斛D2015114、秋石斛-TretesMoon、秋石斛D2015127、秋石斛D2015128、黄贝壳石斛、秋石斛D2015117及亮叶石斛；第Ⅵ类为报春石斛、兜唇石斛和重唇石斛；第Ⅶ类为密花石斛、扭瓣石斛和剑叶石斛。
3. 讨论与结论
遗传多样性是生物多样性的核心内容，是生命进化和物种分化的基础，为研究物种的遗传基础、品种鉴定、亲本优选等提供理论依据。石斛兰除了具有观赏价值外，部分品种还兼具高药用价值和经济价值，了解该种质资源的遗传多样性，不仅能够缓解目前交易市场中商品石斛品种混乱的现象，还能推动石斛资源更深层的开发利用和保护，具有现实的指导意义。
分子标记由于能够直接反映基因组DNA间的差异，且不受环境的限制，具有多态性高、共显性等特点，从而在石斛属植物中得到广泛应用。徐蕾等[17]利用SSR标记对36份来自不同产地的铁皮石斛进行遗传多样性分析，结果表明SSR标记的多态位点百分率为97.19%，中国铁皮石斛品种具有较高的遗传多样性。宋爽等[18]利用ISSR和AFLP两种分子标记对51个药用石斛材料进行遗传多样性研究，其中ISSR标记的多态条带比率高达100%，AFLP标记的多态性比率达99.52%，二者均能有效地将研究材料分开，均适用于石斛植物的遗传多样性研究。张杨等[19]的研究表明RAPD分子标记的多态性比率为93.81%，且该技术能够较好地从分子水平方面反映金钗石斛、铁皮石斛和齿瓣石斛这3种石斛属植物的遗传背景和亲缘关系。周丽等[20]采用SRAP标记分析了包括黔西南州野生铁皮石斛在内的23种相关种类石斛的遗传多样性，结果显示多态性位点占比97.32%，且聚类分析结果与植物学形态分类结果统一。樊洪泓等[21]将SRAP技术应用于药用石斛的遗传多样性及亲缘关系的研究中，证明了其有效性。本研究利用SRAP分子标记对48份石斛兰品种资源的遗传多样性进行分析，结果显示，筛选得到的14对引物共扩增出159个条带，其中多态性条带为155个，多态性比率为97.5%，平均每对引物扩增到11.1个多态性条带，平均引物多态性信息含量为0.828。由此可见，在石斛兰的遗传多样性研究中，SRAP标记具有较为丰富的多态性信息含量。此外，聚类分析结果显示，48份石斛兰品种间的遗传距离变化范围在0.15~0.97，说明供试的石斛兰品种间具有十分丰富的遗传多样性，也表明利用SRAP标记进行石斛兰种质资源遗传多样性的分析是完全可行的。
本研究结果还表明，SRAP标记能够较好地将供试的48份石斛资源区分开。48份样品聚类分析结果显示，晶帽石斛与肿节石斛的亲缘关系较近，铜皮石斛与金钗石斛的亲缘关系较近，报春石斛与兜唇石斛的亲缘关系较近，这与《中国植物志》中的分类结果相吻合。在遗传距离为0.83处，48个石斛兰品种可以分为7大聚类群。在第Ⅰ聚类群中，相较于铁皮石斛，霍山石斛与金钗石斛和铜皮石斛的亲缘关系更近，这一结论与樊洪泓等[21]的研究结果一致；第Ⅴ聚类群中包含了供试材料中的大部分秋石斛品种，秋石斛是花期在秋天的热带洋兰的统称，大部分品种是以蝴蝶石斛为亲本育成的杂交品种，与其他石斛的遗传距离较远，说明SRAP的分类结果与种质资源的遗传背景有一定的相关性。第Ⅲ聚类群中，檀香石斛和麝香石斛均有紫红色花和浓郁香气；第Ⅳ聚类群中的黄橙石斛、曲轴石斛和董黑毛石斛的花瓣分别为金黄色、橘黄色和淡黄色，为黄色系；第Ⅵ聚类群中报春石斛、兜唇石斛和重唇石斛的花瓣分别为淡玫瑰色、淡紫红色以及淡粉红色，为红色系；说明SRAP的分类结果与种质资源的花色、花香等特性相关。上述结果说明SRAP可以较准确地从分子水平反映出48份石斛兰种质资源的遗传差异，表明将SRAP标记应用于石斛兰种质遗传多样性分析效果良好。
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