Fermentation Techniques of Producing Alcohol with Cassava Starch
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摘要: 以淀粉糖发酵生成的酒精值为指标,对木薯淀粉生产酒精的发酵条件进行研究,分析时间、温度、pH、氮源种类、硫酸铵用量和酵母用量等因素对木薯淀粉酒精发酵的影响。结果表明:反应时间在72~84h,温度在35~40℃,pH在4.5~5.0,硫酸铵用量1.0%~1.2%,酵母用量10%~15%时木薯淀粉的酒精发酵效果最好。通过正交试验设计确定了最佳发酵条件:时间84h、温度40℃、硫酸铵用量1.2%、酵母用量15%,发酵验证酒精值达11.16%(V/V),出酒率为52.19%。Abstract: The fermentation conditions for generating alcohol from cassava starch were studied in this experiment using alcohol concentration as index.The single factors used in fermentation were carried out on reaction time,temperature,pH,nitrogen source,additive dosage of ammonium sulfate and yeast.The results showed that with reacting time 72to 84h,temperature 35to 40℃,pH 4.5to 5.0,ammonium sulfate 1.0%to 1.2%and yeast 10% to 15%,the alcohol generating of cassava starch revealed the best efficiency.By orthogonal experiment,the optimum fermentation conditions were determined as adding 1.2%ammonium sulfate and 15%yeast,fermenting at 40℃for 84h;of which the alcohol concentration and the yield of liquor reached to 11.16%(V/V)and 52.19%,respectively.
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Keywords:
- cassava /
- starch /
- alcohol /
- optimization
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铁皮石斛Dendrobium officinale是兰科石斛属多年生附生草本植物，是重要的传统名贵药材，具有益胃生津、滋阴清热等功效[1]，主要分布于我国安徽、浙江、福建、广西、四川、云南等地[2]。福建省是铁皮石斛的原产地之一，野生资源丰富，目前已在纵跨境内的武夷山脉多处发现野生的铁皮石斛资源，泰宁位于武夷山脉中段的杉岭支脉东南侧，海拔落差大，境内大面积的丹霞地貌以丘陵及山地形式分布，蕴藏着丰富的野生铁皮石斛群落[3]。此前，本课题组通过对泰宁及其他来源地铁皮石斛的亲缘关系的ISSR分子标记分析发现泰宁野生铁皮石斛具有较丰富的多样性和较高的种群分化系数，且可能与其他来源地的铁皮石斛存在基因交流[3-5]。由于铁皮石斛可在种内和种间杂交[6]，细胞核染色体基因组易发生重组，增加了利用细胞核染色体DNA分子标记技术分析铁皮石斛多样性原因的复杂性，因此，寻找更合适的方式研究泰宁野生铁皮石斛多样性的程度与原因具有重要意义。
叶绿体DNA作为独立的遗传单位，进化过程中不经历重组，受到的选择压力小，能直接反映植物在长期进化过程中积累的遗传变异[7]，叶绿体DNA rps16序列为基因间区(intergenic spacer)或内含子(intron)非编码区，进化速率较快，已经用于桑树、桑属、枇杷、浮萍、肉苁蓉属、中国樱桃等系统进化、亲缘关系分析[8-13]，已有利用叶绿体DNA matK、rbcL、psbK-psbI、psbA-trnH序列用于铁皮石斛种间和种内变异研究[14-17]，但利用叶绿体DNA rps16序列分析福建泰宁野生铁皮石斛种内遗传距离及遗传多样性等还未见报道。
本研究利用叶绿体DNA rps16序列，对泰宁野生铁皮石斛进行多样性分析，旨在研究其遗传多样性及变异情况，揭示泰宁野生铁皮石斛群落内部以及与其他来源地铁皮石斛的遗传相似性和复杂性，为制定相应的保护策略及探讨泰宁野生铁皮石斛的起源和进化提供科学依据。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
收集包括38份福建泰宁野生铁皮石斛种质在内的铁皮石斛种质46份(表 1)，其中1～19号泰宁野生铁皮石斛种质由泰宁红石山生态农业科技有限公司提供(从158份泰宁野生铁皮石斛单株经ISSR亲缘关系分析划分的4个类群中选出[18])，20～38号泰宁野生铁皮石斛种质分别采集自泰宁杉城镇江家坊、杉城镇洋川、寨下大峡谷、朱口镇、梅口乡，39～46号栽培种铁皮石斛种质收集自云南文山、云南玉溪、福建连城、福建武夷山、江西龙虎山、广西容县、浙江天目山，所有材料均保存于三明市农业科学研究院药用植物研究所实验室及种质资源圃，所测定的rps16序列均已在GenBank注册(登录号见表 1)。
表 1 46份泰宁和不同地区铁皮石斛种质及来源Table 1. Orgins of 46 D. officinale isolates from Taining and other areas序号 编号 来源 类型 GenBank
登录号1 T1 福建泰宁 野生 KX354953 2 T2 福建泰宁 野生 KX354954 3 T4 福建泰宁 野生 KX354953 4 T42 福建泰宁 野生 KX354954 5 T45 福建泰宁 野生 KX354953 6 T54 福建泰宁 野生 KX354953 7 T64 福建泰宁 野生 KX354954 8 T65 福建泰宁 野生 KX354955 9 T73 福建泰宁 野生 KX354954 10 T108 福建泰宁 野生 KX354954 11 T109 福建泰宁 野生 KX354953 12 T117 福建泰宁 野生 KX354953 13 T136 福建泰宁 野生 KX354953 14 T144 福建泰宁 野生 KX354954 15 T151 福建泰宁 野生 KX354953 16 T153 福建泰宁 野生 KX354953 17 T156 福建泰宁 野生 KX354955 18 T164 福建泰宁 野生 KX354954 19 T199 福建泰宁 野生 KX354953 20 A1 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 21 A2 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 22 A3 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 23 A4 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 24 A5 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 25 A6 福建泰宁杉城镇江家坊 野生 KX354956 26 B1 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354957 27 B2 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354958 28 B3 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354958 29 B4 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354958 30 B5 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354958 31 B6 福建泰宁杉城镇洋川 野生 KX354958 32 C 福建泰宁寨下大峡谷 野生 KX354959 33 D1 福建泰宁朱口镇蛤蟆岩 野生 KX354960 34 D3 福建泰宁朱口镇蛤蟆岩 野生 KX354961 35 D4 福建泰宁朱口镇蛤蟆岩 野生 KX354961 36 D5 福建泰宁朱口镇蛤蟆岩 野生 KX354962 37 F1 福建泰宁梅口乡野趣源 野生 KX354963 38 F2 福建泰宁梅口乡野趣源 野生 KX354963 39 G 云南文山 栽培 KX354964 40 H 云南玉溪 栽培 KX354965 41 I 福建连城冠豸山 栽培 KX354966 42 M 福建武夷山 栽培 KX354967 43 N 江西龙虎山 栽培 KX354968 44 O 广西容县 栽培 KX354969 45 P1 浙江天目山 栽培 KX354970 46 P2 浙江天目山 栽培 KX354970 此外，从GenBank上下载包括4份铁皮石斛种质在内的29份石斛属植物叶绿体DNA rps16序列，与上述46份石斛种质一起，进行rps16序列分析，编号47～75(表 2)。
表 2 已在GenBank中登录的石斛属rps16序列Table 2. rps16 sequences of Dendrobium species listed at Genbank序号 编号 物种名称 拉丁名 GenBank
登录号47 DC1 铁皮石斛 D. catenatum KJ672783.1 48 DC2 铁皮石斛 D. catenatum KJ672782.1 49 DC3 铁皮石斛 D. catenatum KJ672781.1 50 DC4 铁皮石斛 D. catenatum KJ672780.1 51 西畴石斛 D. xichouense KJ672790.1 52 广东石斛 D. wilsonii KJ672789.1 53 黄石斛 D. tosaense KJ672788.1 54 黄石斛 D. tosaense KJ672787.1 55 滇桂石斛 D. scoriarum KJ672786.1 56 滇桂石斛 D. scoriarum KJ672785.1 57 滇桂石斛 D. scoriarum KJ672784.1 58 金钗石斛 D. nobile KJ672779.1 59 金钗石斛 D. nobile KJ672778.1 60 金钗石斛 D. nobile KJ672777.1 61 金钗石斛 D. nobile KJ672776.1 62 细茎石斛 D. moniliforme KJ672775.1 63 细茎石斛 D. moniliforme KJ672774.1 64 细茎石斛 D. moniliforme KJ672773.1 65 细茎石斛 D. moniliforme KJ672772.1 66 矩唇石斛 D. linawianum KJ672771.1 67 霍山石斛 D. huoshanense KJ672770.1 68 尖刀唇石斛 D. heterocarpum KJ672769.1 69 重唇石斛 D. hercoglossum KJ672768.1 70 疏花石斛 D. henryi KJ672767.1 71 河南石斛 D. henanense KJ672766.1 72 曲茎石斛 D. flexicaule KJ672765.1 73 曲茎石斛 D. flexicaule KJ672763.1 74 棒节石斛 D. findlayanum KJ672762.1 75 钩状石斛 D. aduncum KJ672761.1 1.2 主要试剂
Taq酶和Marker购自上海宝生物工程有限公司，引物购自上海生工生物工程技术服务公司，胶回收试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 基因组DNA的提取
采用改良CTAB法提取铁皮石斛叶片基因组总DNA[4]。
1.3.2 PCR扩增及序列测定
PCR引物序列依据Jing Luo等[19]所述，分别为rps16F(5′-GGT GTA GAT ATG ATC GAA AT-3′)和rps16R(5′-CCG ATA AAG AAT CAA ACT TA-3′)扩增反应在20 μL反应体系中进行[4]，包含ddH2O 9 μL，2×Taq MasterMix 9 μL，引物1 μL，模板DNA 1 μL。PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，51~62℃退火45 s，72℃延伸1 min，共40个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。
PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，割取目的条带，用GeneJET胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物送至深圳华大基因研究院测序(单链正向测序)。
1.4 数据分析
应用MEGA6.06软件，对测序序列进行比对，参考测序图，去除前端21 bp碱基和末端279 bp序列，保留599 bp进行序列特征分析，利用K-2P(Kimura 2-parameter)模型计算铁皮石斛种内遗传距离，通过1 000次重复的自展程序进行标准误的检测，采用邻接法NJ(Neighbor-Joining)构建基于K-2P距离的系统发育树。
2. 结果与分析
2.1 福建泰宁野生铁皮石斛叶绿体DNA rps16序列特征分析
通过对50份铁皮石斛(包括GenBank上已登录的4份铁皮石斛)rps16序列比对分析(表 3)，共得到20个多态性位点，其中38份泰宁野生铁皮石斛共得到5个多态性位点(分别在1、29、38、41、136 bp处)，多态性位点数占总数的25%，包括1、29 bp处单个碱基的缺失、41 bp处单个碱基的插入及38、136 bp处单个碱基的颠换。泰宁野生铁皮石斛共包含5种类型的rps16核苷酸序列，具有与T1相同核苷酸序列的包括T4、T45、T54、T109、T117、T136、T151、T153、T199、B2、B3、B4、B5、B6、C、D3、D4、F1、F2共20份种质；具有与T2相同核苷酸序列的包括T42、T64、T73、T108、T144、T164、B1共8份种质；具有与T65相同核苷酸序列的仅有T156和D1共3份种质；与A1相同核苷酸序列的有A2、A3、A4、A5、A6共6份种质；以及D5种质。与来自福建泰宁的T1型rps16核苷酸序列一致的铁皮石斛种质还包括H(云南玉溪)、I(连城冠豸山)、O(广西容县)、P1(浙江天目山)、P2(浙江天目山)、DC1和DC4；与来自福建泰宁的A1型rps16核苷酸序列一致的铁皮石斛种质还包括N(江西龙虎山)，泰宁野生铁皮石斛T2型、T65型、D5型的rps16核苷酸序列为参比铁皮石斛种质中的独有类型。
表 3 泰宁野生铁皮石斛叶绿体DNA rps16序列比对后的差异位点Table 3. Polymorphic sites in chloroplast DNA rps16 sequences of wild D. officinale collected from Taining种质 多态性位点 1 8 17 18 21 29 30 32 34 38 41 136 189 364 490 505 521 561 572 576 T1型 T A A - T A G T - T - T T G G A A A A G T2型 . . . - . - . . - . - . . . . . . . . . T65型 - . . - . . . . - . - . . . . . . . . . A1~A6 . . . - . . . . - . - C . . . . . . . . B1 . . . - . - . . - . - . . . . . . . . . B2~B6 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . C . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . D1 - . . - . . . . - . - . . . . . . . . . D3, D4 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . D5 . . . - . - . . - G A . . . . . . . . . F1, F2 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . G . . G T G . . C A . - . G . A G G G C T H . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . I . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . M . - . - . . . . - . - . . . . . . . . . N . . . - . . . . - . - C . . . . . . . . O . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . P1, P2 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . DC1 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . DC2 . . . - . . . . - . - . . T . . . . . . DC3 . . . - . . A . - . - . . . . . . . . . DC4 . . . - . . . . - . - . . . . . . . . . 注：圆点表示该位点核苷酸同T1铁皮石斛种质；-代表缺失。T1型表示与T1铁皮石斛种质具有相同的核苷酸序列的编号T开头的泰宁野生类型(包括T1、T4、T45、T54、T109、T117、T136、T151、T153、T199)下同，T2型(包括T2、T42、T64、T73、T108、T144、T164)，T65型(包括T65、T156) 2.2 福建泰宁野生铁皮石斛种内的遗传距离分析
应用MEGA6.06软件，基于K-2P距离模型计算铁皮石斛种内的遗传距离，结果(表 4)表明：来源于福建泰宁的38份野生铁皮石斛种内遗传距离变化范围为0～0.003 4，平均遗传距离为0.000 6，以来源于泰宁杉城镇江家坊的A1~A6号铁皮石斛与来源于泰宁朱口镇蛤蟆岩的D5号铁皮石斛间遗传距离为最大，遗传距离为0.003 4，而50份不同来源铁皮石斛种内遗传距离变化范围为0～0.018 9，平均遗传距离为0.001 3，种内最大遗传距离发生在来源于云南文山(G)的铁皮石斛与泰宁杉城镇江家坊(A1～A6)、泰宁朱口镇蛤蟆岩(D5)、江西龙虎山(N)、DC2号、DC3号铁皮石斛之间。
表 4 基于K-2P模型构建的铁皮石斛种内的遗传距离Table 4. K-2P genetic distance according to rps16 sequences of D. officinaleDC4 T1型 T2型 T65型 A1-6 B1 B2-6 C D1 D3-4 D5 F1-2 G H I M N O P1-2 DC1 DC2 DC3 T1型 T2型 0.0000 T65型 0.0000 0.0000 A1-6 0.0017 0.0017 0.0017 B1 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 B2-6 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 C 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 D1 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 D3-4 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 D5 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 F1-2 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 G 0.0171 0.0171 0.0171 0.0189 0.0171 0.0171 0.0171 0.0171 0.0171 0.0189 0.0171 H 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 I 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 M 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 0.0000 N 0.0017 0.0017 0.0017 0.0000 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0189 0.0017 0.0017 0.0017 O 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 P1-2 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 DC1 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 DC2 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0189 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0017 0.0017 DC3 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0189 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 0.0017 0.0017 0.0017 0.0034 DC4 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0171 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0000 0.0000 0.0000 0.0017 0.0017 2.3 基于叶绿体DNA rps16序列构建的石斛属植物系统进化树分析
叶绿体DNA rps16序列基于K-2P遗传距离构建的石斛属药用植物的NJ聚类分析(图 1)表明，不同石斛属药用植物首先分为2支，其中1支由尖刀唇石斛D.heterocarpum KJ672769.1、疏花石斛D.henryi KJ672767.1组成，表明二者之间遗传距离较小，亲缘关系较近(支持率78%)，并与其他石斛属药用植物间遗传距离较大，另外1支由单独聚为1支的钩状石斛D.aduncum KJ672761.1和其他石斛属药用植物组成。除DC2号D.catenatum KJ672782.1、DC3号D.catenatum KJ672781.1铁皮石斛外，其余铁皮石斛种质均位于进化树的末端。此外黄石斛D.tosaense KJ672788.1、黄石斛D.tosaense KJ672787.1与T1型、T2型、T65型铁皮石斛种质聚在1支，表明它们之间遗传距离较小，叶绿体DNA rps16序列差异较小，亲缘关系较近。
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图 1 叶绿体DNA rps16序列构建的75份石斛属药用植物的NJ聚类Figure 1. Phylogenetic tree of 75 Dendrobium species based on rps16 sequences using NJ method3. 讨论
叶绿体DNA作为独立的遗传单位，进化过程中不经历重组，受到的选择压力小，能直接反映植物在长期进化过程中积累的遗传变异[7]，而叶绿体基因组编码区与非编码区序列进化速率相差较大，适合不同分类阶元的系统发育研究[20]。铁皮石斛叶绿体DNA种间变异研究属较低分类阶元的系统发育研究，有文献表明，铁皮石斛叶绿体DNA matK基因在4个不同居群间遗传距离均较小，为0.001[16]、铁皮石斛叶绿体DNA rbcL基因序列在6地间遗传距离均为0[17]、叶绿体DNA psbK-psbI序列在4个铁皮石斛种内均无变异位点[14]、铁皮石斛叶绿体DNA psbA-trnH基因间隔区序列在6个不同居群间没有变异位点[15]，而本研究的结果表明，叶绿体DNA rps16序列在50份不同来源的铁皮石斛种内遗传距离最大达0.018 9，总共存在20个变异位点的差别，这与Luo等[19]研究结果，包括铁皮石斛在内的6种兰科植物叶绿体DNA序列中，rps16序列进化速率较快的结果相一致。本研究初步表明不同来源铁皮石斛叶绿体DNA rps16序列间遗传距离较大，变异位点较多，因此，叶绿体DNA rps16序列可作为研究铁皮石斛种内变异的DNA条形码序列之一。
中国植物志记载福建分布的石斛属植物有剑叶石斛D. acinaciforme、细茎石斛D. moniliforme、铁皮石斛和广东石斛D. wilsonii，石斛属药用植物种类较相邻的省份广东、江西、浙江更为丰富[2]。福建是野生铁皮石斛的原产地之一，本课题组在泰宁的杉城镇江家坊、杉城镇洋川、寨下大峡谷、朱口镇蛤蟆岩、梅口乡野趣源等多地发现野生铁皮石斛群落，且在叶型、叶色、茎色等性状上与现有栽培种呈现丰富的多样性[4]，通过ISSR标记进一步的分析表明泰宁野生铁皮石斛具有较丰富的多样性和较高的种群分化系数[3]。在本研究中，泰宁野生铁皮石斛不同群落中共产生5种类型的叶绿体DNA rps16核苷酸序列，呈现较为丰富的细胞质叶绿体基因组核苷酸序列的多样性，其中T2型、T65型、D5型这3种类型为参比铁皮石斛种质中的独有类型，表明泰宁铁皮石斛种群内产生新的叶绿体基因组核苷酸序列碱基突变类型，而碱基突变在形成生物个体多样性中起重要作用[21]，因此泰宁是福建及周边地区野生铁皮石斛的起源中心之一。
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