Effects of Exogenous Ca2+ on the Intracellular Calcium Distribution and Antioxidant Enzymes Activities of Eriobotryajaponica Seedlings and Leaves
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摘要: 为探索一定浓度外源Ca2+在缓解枇杷冻害中所起到的积极作用, 以盆栽枇杷苗为试材, 先采用不同浓度CaCl2溶液喷施叶片, 并用焦锑酸钙沉淀法检验处理效果, 后采用人工降温的方法进行低温处理, 并对-3℃1.5h处理条件下的枇杷叶组织抗寒生理的相关指标进行测定。结果表明:0.0550mmol·L-1浓度的CaCl2溶液, 均能不同程度地降低枇杷苗MDA含量和提高SOD、POD、CAT及APX活性。其中, 以10mmol·L-1CaCl2溶液处理的SOD活性最高, 高于对照26.70%, 且达到显著水平;以25mmol·L-1 CaCl2溶液处理的APX活性最高, 高于对照6.39%, 但未达到显著水平。结论:在低温来临之前果园喷水防寒时, 喷施适宜浓度的CaCl2溶液有利于提高枇杷苗的抗寒性, 从而可以在一定程度缓解低温伤害。Abstract: CaCl2solution of different concentrattion were sprayed on the leaves of potted Eriobotryajaponica seedlings, the effects were verified by the calcium pyroantimonate precipitation method.Then, the seedlings were artificially treated at-3℃for 1.5h, and the cold resistance-relating physiological indices of the leaf tissues were measured.The results showed that CaCl2solutions of 0.05-50mmol·L-1 could all managed to decrease the MDA contents and to increase the SOD, POD, CAT and APX activities.The SOD activity of the control group was significantly elevated by 26.70% by using 10mmol·L-1 CaCl2solution.Although the APX activity of the control was maximally increased by 6.392% via 25 mmol·L-1 CaCl2solution, the upgrowth was still not significant.Thus, spraying appropriate CaCl2solution besides water in orchards prior to cold-air outbreaks was conducive to augmenting the cold-resistance indices of Eriobotryajaponica seedlings, thereby minimizing the low-temperature damages.
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中国鲎Tachypleus tridentatus，俗称三刺鲎，隶属于节肢动物门Arthropoda，肢口纲Merostomata，剑尾目Xiphosura，鲎科Tachypleidae。鲎从4亿多年前问世至今仍保留其原始而古老的相貌，因此又有“活化石”之称。世界上95%的中国鲎资源分布在我国[1]。近年来，由于环境污染，海洋开发利用破坏栖息地以及过度捕捞等原因，导致鲎资源日益减少，数量锐减。因此，保护中国鲎资源已刻不容缓。由于鲎发育至性成熟一般需要13~15年的时间[2]，仅靠其自然繁殖已无法恢复种群资源，而人工育苗无疑是最有效、最迅速的办法[3]。因此对中国鲎人工育苗技术及其前期幼鲎的培育研究显得尤为重要。由于中国鲎幼鲎人工育苗养殖存在低孵化率、低存活率、生长发育耗时长等问题[4-6]，大部分研究只至1龄期或2龄期幼鲎[7-10]。仅见SEKIGUCHI K[5]、CHEN Y[4]、HU M[11]等将中国鲎从受精卵开始培育至14龄期、9龄期和3龄期，但都是在水温为28~30℃条件下培育的，至今为止未见在室温条件下将中国鲎从受精卵培育至2龄期以后的报道。异速生长是普遍存在的一种规律，为生物体部分与整体，或者部分与部分之间的差异提供了重要的对比信息[12]，反映了生物体的资源分配策略[13]。本研究是在室温条件下将中国鲎从人工授精开始一直培育至6龄期幼鲎，旨在通过对中国鲎早期幼鲎生长发育情况的研究及其异速生长方程的建立，为中国鲎的生物学研究提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
实验室室内培育的中国鲎幼鲎，培育时间2年。2014年8月通过人工授精获得受精卵，于养殖场室温培育孵化成1龄期幼鲎后转入实验室，室温、盐度30‰~35‰、pH值8.0~8.5、底部铺细沙培育。1龄期未投饵，进入2龄期后开始隔天投喂花蛤肉糜。
1.2 测定方法
幼鲎各生长指标采用带测量软件的数码显微镜、游标卡尺和千分之一天平测定。测定参数：湿重、头胸部长、头胸部宽、腹部长、腹部宽、剑尾长、全长, 具体方法参照SEKIGUCHI K[5]和CHEN Y[4]等。
1.3 数据处理
利用SPSS19.0软件将湿重、头胸部长、腹部长、剑尾长和全长分别与头胸部宽进行回归分析，获得异速生长曲线方程y=axb，其中a为常数，b为回归系数，x为头胸部宽，y为其他生长指标；同时对上述生长指标的lg值做回归分析，获得线性回归方程y=a+bx, 其中a为常数，b为回归系数，x为头胸部宽的lg值，y为其他生长指标的lg值。用另一批新测的1龄期、2龄期和6龄期幼鲎的测量值对回归方程进行校验。
2. 结果与分析
2.1 各龄期中国鲎幼鲎生长指标
2014-2016年，孵化出的1龄期幼鲎经过4次蜕壳，发育成5龄期幼鲎。每次蜕壳完后测定各龄期中国鲎的各项生长指标，见表 1。
表 1 1~5龄期中国鲎各项生长指标测定值(平均值±标准差)Table 1. Body size (mean±SD) of T. tridentatus from 1st to 5th instar age龄期 湿重
/g头胸部长
/mm头胸部宽
/mm腹部长
/mm腹部宽
/mm剑尾长
/mm全长
/mm1 0.023±0.002 3.41±0.19 6.13±0.23 3.21±0.17 4.98±0.25 - 6.61±0.25 2 0.038±0.003 4.53±0.26 8.02±0.31 3.17±0.15 6.53±0.27 2.56±0.29 10.27±0.47 3 0.096±0.011 5.37±0.57 10.62±0.62 4.61±0.41 8.51±0.51 6.90±0.71 16.86±1.19 4 0.222±0.029 7.58±0.61 15.44±0.65 5.93±0.70 12.65±0.62 12.16±0.94 25.51±1.78 5 0.476±0.038 9.43±1.59 19.98±0.77 7.76±1.35 15.20±0.95 17.51±1.09 34.98±1.71 注：“-”表示无测量值，因1龄期中国鲎无剑尾。 2.2 回归分析
以1~5龄期中国鲎的头胸部宽为自变量，湿重、头胸部长、腹部长、腹部宽、剑尾长和全长为因变量进行回归分析，获得幂函数曲线方程(表 2)及回归分析图(图 1~6)。以1~5龄期中国鲎的头胸部宽lg值为自变量，湿重、头胸部长、腹部长、腹部宽、剑尾长和全长lg值为因变量进行回归分析，获得线性方程(表 2)及回归分析图(图 1~6)。除腹部长与头胸部宽回归方程的决定系数R2值为0.875外，其他均大于0.900，显著性均小于0.01，说明获得的回归方程拟合度较高。
表 2 中国鲎1~5龄期异速生长方程Table 2. Allometric growth models for T. tridentatus from 1st to 5th instar age项目 幂函数曲线方程 线性方程* 决定系数R2 显著分析 湿重与头胸部宽 y=0.000205x2.567 y=-3.687+2.567x 0.986 ＜0.01 头胸部长与头胸部宽 y=0.759x0.838 y=-0.120+0.838x 0.932 ＜0.01 腹部长与头胸部宽 y=0.729x0.769 y=-0.137+0.769x 0.875 ＜0.01 腹部宽与头胸部宽 y=0.858x0.973 y=-0.067+0.973x 0.991 ＜0.01 剑尾长与头胸部宽 y=0.041x2.067 y=-1.385+2.067x 0.933 ＜0.01 全长与头胸部宽 y=0.547x1.407 y=-0.262+1.407x 0.982 ＜0.01 注：“*”为各生长指标测量值转换成对数(lg)值后的线性回归分析。 ![]()
图 1 1~5龄期中国鲎湿重与头胸部宽及其对数关系Figure 1. Correlation between wet body weight and prosomal width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions![]()
图 2 1~5龄期中国鲎头胸部长与头胸部宽及其对数关系Figure 2. Correlation between prosomal length and width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions![]()
图 3 1~5龄期中国鲎腹部长与头胸部宽及其对数关系Figure 3. Correlation between opisthosoma length and prosomal width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions![]()
图 4 1~5龄期中国鲎腹部宽与头胸部宽及其对数关系Figure 4. Correlation between opisthosoma width and prosomal width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions![]()
图 5 1~5龄期中国鲎剑尾长与头胸部宽及其对数关系Figure 5. Correlation between telson length and prosomal width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions![]()
图 6 1~5龄期中国鲎全长与头胸部宽及其对数关系Figure 6. Correlation between whole length and prosomal width from 1st to 5th instar age of T. tridentatus in arithmetic and logarithmic functions2.3 校验
从2015年8月实验室人工育苗培育的另一批1龄期和2龄期中国鲎测定值中随机各选取10组，对获得的回归方程进行校验，同时用2016年刚刚发育新获得的两只6龄期中国鲎测定值校验所获得的回归方程的外推测力。将头胸部宽的测定值代入回归方程获得湿重、头胸部长、腹部长、腹部宽、剑尾长和全长的预测区间(95%置信区间)，见表 3。测定值全部落入预测区间，表明所获得的回归方程拟合性好，对6龄期中国鲎的外推测力好。
表 3 1龄期、2龄期和6龄期中国鲎测量值及预测区间Table 3. Measured value and prediction interval of 1st, 2nd and 6th instar age of T. tridentatus龄期 头胸部宽测定值/mm 湿重/g 头胸部长/mm 腹部长/mm 腹部宽/mm 剑尾长/mm 全长/mm 测定值 预测区间 测定值 预测区间 测定值 预测区间 测定值 预测区间 测定值 预测区间 测定值 预测区间 1 5.71 0.023 0.014~0.024 3.72 2.78~3.97 3.04 2.23~3.53 4.90 4.13~5.29 - - 6.76 5.49~7.46 5.78 0.022 0.015~0.025 3.38 2.81~4.00 3.08 2.25~3.56 5.04 4.18~5.35 - - 6.44 5.58~7.59 5.80 0.019 0.015~0.025 3.31 2.82~4.02 2.79 2.25~3.57 4.86 4.19~5.37 - - 6.09 5.61~7.63 6.21 0.023 0.018~0.030 3.84 2.98~4.25 3.32 2.37~3.76 5.01 4.48~5.74 - - 7.15 6.17~8.39 5.63 0.022 0.014~0.023 3.37 2.75~3.92 3.13 2.20~3.49 4.82 4.07~5.22 - - 6.50 5.38~7.32 5.89 0.022 0.015~0.026 3.35 2.86~4.07 2.91 2.28~3.61 4.86 4.25~5.45 - - 6.27 5.73~7.79 5.54 0.022 0.013~0.022 3.77 2.72~3.87 2.90 2.17~3.45 4.70 4.01~5.13 - - 6.65 5.26~7.15 5.68 0.023 0.014~0.024 3.49 2.77~3.95 3.16 2.22~3.52 4.84 4.11~5.26 - - 6.62 5.45~7.41 5.58 0.021 0.013~0.023 3.35 2.73~3.89 2.95 2.19~3.47 4.65 4.04~5.17 - - 6.29 5.31~7.23 5.78 0.022 0.015~0.025 3.53 2.81~4.00 3.03 2.25~3.56 4.82 4.18~5.35 - - 6.57 5.58~7.59 2 7.97 0.044 0.033~0.056 4.45 3.66~5.21 3.38 2.87~4.54 6.72 5.71~7.31 2.88 2.03~4.26 10.67 8.76~11.89 8.62 0.045 0.041~0.068 4.69 3.91~5.55 3.31 3.04~4.81 6.75 6.16~7.88 2.91 2.39~5.01 10.94 9.77~13.27 8.43 0.050 0.038~0.064 4.71 3.84~5.45 3.58 2.99~4.73 7.12 6.03~7.72 3.15 2.28~4.78 11.42 9.47~12.86 7.64 0.040 0.030~0.050 4.63 3.54~5.03 3.88 2.78~4.40 6.26 5.48~7.01 2.27 1.85~3.90 10.59 8.25~11.21 7.91 0.035 0.033~0.055 4.32 3.64~5.18 3.13 2.85~4.51 6.34 5.67~7.25 2.32 1.99~4.19 9.75 8.66~11.77 8.15 0.042 0.035~0.059 4.54 3.73~5.31 3.41 2.92~4.62 6.55 5.84~7.47 2.41 2.12~4.46 10.36 9.03~12.27 8.40 0.046 0.038~0.064 4.87 3.83~5.44 3.32 2.98~4.72 6.54 6.01~7.69 2.93 2.26~4.75 11.09 9.42~12.80 8.30 0.044 0.037~0.062 4.72 3.79~5.39 3.46 2.96~4.68 7.02 5.94~7.60 2.92 2.21~4.63 11.10 9.27~12.59 6.94 0.032 0.023~0.039 4.11 3.27~4.65 3.15 2.58~4.09 6.02 4.99~6.39 2.34 1.51~3.19 9.63 7.21~9.80 7.63 0.038 0.030~0.050 4.46 3.54~5.03 3.36 2.77~4.39 6.36 5.47~7.00 2.68 1.85~3.89 10.54 8.24~11.19 6 26.40 1.055 0.713~1.198 13.60 9.87~14.31 10.02 7.17~11.63 20.00 19.20~22.42 24.40 23.51~51.14 47.50 46.22~63.83 23.50 0.769 0.529~0.887 11.20 8.95~12.96 9.91 6.55~10.61 19.52 17.15~20.02 22.80 18.59~40.26 43.60 39.30~54.20 注：预测区间为95%置信区间。“-”表示无数据，因1龄期中国鲎无剑尾。 3. 讨论
异速生长是指生物体个体大小与其他生物属性之间的非线性关系，为生物体部分与整体，或者部分与部分之间的差异提供了重要的对比信息，反映了生物体的资源分配策略，通常以幂函数(y=axb)表示[12-14]。在鲎的研究中，通常以头胸部宽作为幂函数中的自变量x，其他生长指标作为因变量y进行回归分析。回归分析中，决定系数R2直接反映因变量和自变量间的相关程度，也是选择回归方程的主要依据[12]。回归系数b反映了生物的异速生长率，当b＞1时，呈正生长，即y的增长率大于x的增长率；当b＜1时，呈负生长，即y的增长率小于x的增长率；当b=1时，呈等速生长，即y的增长率等于x的增长率[15-16]。
本研究湿重和头胸部宽异速生长关系中，b值为2.567，截距为-3.687，呈正生长，即湿重的增长速度大于头胸部宽的生长速度，这与其他研究结果一致。CHEN Y[4]对人工育苗养殖的1~9龄期的中国鲎幼鲎进行测定分析，获得湿重对头胸部宽的b值为2.898 6。LEE C N[17]对从野外获得中国鲎(头胸部宽21.2~95.0 mm，6~12龄期)进行室内饲养，蜕壳后测定头胸部宽和湿重，获得湿重对头胸部宽b值为2.968 2，截距为-4.07。刘伟茹[18]对采自广西北部湾的不同龄期中国鲎(6~9龄期、10~12龄期、13~15龄期、6~15龄期)体重同头胸部宽回归分析中b值分别为3.018 3、3.173 3、2.842 9、3.093 4。这些研究的b值均大于本研究值，这可能与中国鲎所处的龄期不同及生活环境不同有关，b值呈现出随着龄期的增大而增大的趋势。ZADEH[19]对人工育苗养殖圆尾鲎(1~6龄期)湿重同头胸部宽的b值为2.672 7，巨鲎(1~5龄期)湿重同头胸部宽的b值为2.484 5，这与本研究的中国鲎龄期接近，b值也较接近。
本研究腹部宽与头胸部宽的b值为0.973，约等于1，呈等速生长，这结果与CHEN Y[4]一致。头胸部长、腹部长与头胸部宽的b值为0.838、0.769，呈负生长，即头胸部长、腹部长增长速度小于头胸部宽，而CHEN Y[4]的研究结果则是头胸部长与头胸部宽等速生长，腹部长出现拐点，1~2龄期b值为0.016 5、2~9龄期为1.050 1，先慢速生长后等速生长。本研究中剑尾长与头胸部长呈正生长关系(b=2.067)，而CHEN Y[4]的结果为2~3龄期正生长，3~9龄期等速生长。之所以出现这些异同，笔者认为可能与养殖温度有关，本研究养殖温度为室温，温度变化较接近于海区变化，而CHEN Y[4]的养殖温度为28~30℃。
对于用于预测的生长模型，应该尽量使用获得的新数据对其进行校验[12, 20-21]。本研究将次年新获得的另一批1龄期和2龄期中国鲎以及新发育的6龄期中国鲎测定值用于回归方程的校验，测定值全部在预测区间内，表明方程具有很好的拟合性和外推测性。
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