A Study of Antigenic Relativity on Muscovy Duck Parvovirus and Goose Parvovirus
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摘要: 应用微量交叉中和试验 (NT) 和胶乳凝集抑制试验 (LPAI) 比较番鸭细小病毒、鹅细小病毒和番鸭源鹅细小病毒之间的抗原相关性。结果显示:3种病毒与同源抗血清的中和效价和LPAI效价均明显高于异源血清;番鸭细小病毒与番鸭源鹅细小病毒、鹅细小病毒之间的R值均小于0.1;番鸭源鹅细小病毒与鹅细小病毒的R值大于0.25。结果表明番鸭细小病毒与鹅细小病毒 (番鸭源或鹅源) 的抗原相关性较低, 提示番鸭源鹅细小病毒与鹅细小病毒属于同一血清型的不同亚型。Abstract: Antigenic relationship of Muscovy duck parvovirus (MPV F strain) , Muscovy duck origin goose parvovirus (MDGPV PT strain) and Goose parvovirus (GPV GD strain) were determined by virus crossneutralization tests (NT) and latex agglutination inhibition test (LPAI) .The results showed that neutralization titer and LPAI titers of homologous antiserum were significantly higher than heterologous serum;R values of MPV compared with MDGPV and GPV were less than 0.1.R value between MDGPV and GPV was greater than 0.25.The results showed that MPV has low antigenic correlation with GPV and MDGPV, which indicated that antigenic variations are obviously existed between MPV and the other two, and showed that GPV and MDGPV belong to different subtypes of the same serotype.
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澳洲龙纹斑[1]Maccullochella peelii peelii，别名澳洲鳕鲈[2]、虫纹鳕鲈[3]、虫纹麦鳕鲈[4]、墨累河鳕鱼[5]等，中国称澳洲龙纹斑、虫纹石斑，属真鲈科、下麦鳕鲈属[6]的一种著名淡水鱼[7-8]。该鱼为澳大利亚的“国宝鱼”，同宝石鲈、黄金鲈、银鲈等淡水鱼被认作为澳洲鱼种。该鱼肉细、厚实、少刺，且繁殖力较强，既适合于养殖，亦可以作为观赏鱼，有广阔的市场前景，同时营养全面，包括17种氨基酸及EPA与DHA，目前已成为我国淡水养殖的优质鱼类之一[9-11]。
由于澳洲龙纹斑对于养殖条件要求严格，特别是幼鱼时期对养殖水质要求高，疾病控制水平要求严，因此在使用消毒药物的时候应参考相应淡水鱼疾病预防与治疗方法[12-13]，需特别注意。澳洲龙纹斑幼鱼对铜、锌、铅、镉等重金属离子及常用水体消毒药物的敏感性，尚未见系统研究，因此本试验研究多种重金属离子及消毒药物对澳洲龙纹斑幼鱼的毒性，用于指导澳洲龙纹斑的养殖生产。
1. 材料与试剂
1.1 试验动物
试验所用的澳洲龙纹斑幼鱼由邵武市某水产养殖有限公司提供，均为人工繁育的健康鱼种，平均体重为(5.3±0.5) g，体长为5.6~8.8 cm，其试验期间不投料。
1.2 试验药品
硫酸铜(CuSO4·5H2O)、硝酸铅[Pb(NO3)2]、氯化镉(CdCl2)由广东光华化学厂有限公司提供、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)由汕头市西陇化工有限公司生产，4种药品均为化学纯级别药品。食盐为高纯度食用盐。消毒剂见表 1。
表 1 试验用渔药种类Table 1. Aquaculture drugs tested名称 有效成分含量/% 生产商 常规使用量/(mg·L-1) 二氧化氯 12 福州联丰生物技术开发有限公司 0.20 聚维酮碘 10 福州联丰生物技术开发有限公司 0.75 甲醛 4.5 福州联丰生物技术开发有限公司 0.03 高锰酸钾 >99 衡阳市凯信化工试剂有限公司 0.50 1.3 试验条件
试验容器为10 L塑料小桶，试验时在每个小桶内装入5 L邵武市某水产公司养殖常用淡水，水质无污染。试验过程中无曝气，无喂料，不换水。试验期间水体温度维持在24~28℃, pH值6.5~7.5，溶氧量保持3 mg·L-1以上, 氨氮含量在0.1 mg·L-1以下。
1.4 试验方法
根据预试验结果设定药物质量浓度梯度。试验组每种药物每个梯度为一组, 每组各3桶作为平行试验，每桶随机放入10尾健康澳洲龙纹斑幼鱼。停止充气，不投饵，以排除饵料的影响, 同时设置对照组, 对照组条件同试验组。每天定时观察，挑出死亡幼鱼，每隔24记录澳洲龙纹斑幼鱼死亡情况。
1.5 数据分析
参考相关数据统计方法文献，选用概率单位法。运用SPSS 17.0版probit模块分析计算得出致死质量浓度(LC100)、半数致死质量浓度(LC50)；安全质量浓度(SC)的计算公式采用Turubell公式计算，SC=(48 h LC50×0.3)/(24 h LC50/48 h LC50)2。
2. 结果与分析
2.1 试验过程中澳洲龙纹斑幼鱼的行为反应
试验过程中，澳洲龙纹斑幼鱼在不同浓度的消毒药物的水体中，表现出不同的行为特征。低浓度氯化镉试验组幼鱼表现出狂躁不安，游于水面，口部张开呼吸，游泳速度缓慢，平衡性明显下降，反应逐渐迟钝，最后出现死亡。在其他试验组中，低浓度药物组试验幼鱼的表现出相似的状态，多沉在水底或者缓慢游动，呼吸均匀，死亡少，但头部两眼之间均有发红。相比于低浓度组，高浓度组的幼鱼出现不同的反应。在较高浓度的硫酸锌、硝酸铅、聚维酮碘、高锰酸钾、食盐试验组中，幼鱼放入水体即表现出狂游，四处乱窜，3~5 h后，游动迟缓，呼吸频率加快，向水面侧游。不到24 h基本死亡，幼鱼头部呈深红色，嘴部张开，鳃部、体色变白，背鳍、胸鳍张立。试验幼鱼在高浓度甲醛试验组中，3~5 h后表现出狂游，撞壁，呼吸加快，头部微红，24 h后部分幼鱼嘴部张开，游于水面，且逐渐出现死亡情况。在二氧化氯组中，同甲醛组，幼鱼出现四处乱窜，撞壁，约30 min后，活动迟缓，对外界刺激迟钝，部分幼鱼出现翻白，静卧在桶底。
2.2 半数致死浓度和安全浓度
2.2.1 硫酸铜对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
硫酸铜24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：1.260、0.865、0.744、0.601 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为3.286、3.069、2.349、2.366 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为0.122 3 mg·L-1(表 2)。
表 2 不同用量硫酸铜对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性试验Table 2. Acute toxicity of CuSO4 on juvenile Murray codCuSO4/(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0.00 10 0 0 0 0 0.30 10 0 1 1 2 0.60 10 1 2 2 4 1.00 10 2 4 7 8 1.50 10 5 8 9 9 1.75 10 8 10 10 10 2.00 10 10 10 10 10 LC50 1.260 0.865 0.744 0.601 LC100 3.286 3.069 2.349 2.366 SC 0.1223 2.2.2 硫酸锌对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
硫酸锌24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：2.554、2.316、2.192、2.106 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为12.475、10.402、10.463、8.334 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为0.571 3 mg·L-1(表 3)。
表 3 不同用量硫酸锌对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 3. Acute toxicity of ZnSO4 on juvenile Murray codZnSO4 /(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0.00 10 0 0 0 0 1.00 10 1 1 1 1 2.00 10 3 4 5 5 3.00 10 7 7 7 7 5.00 10 7 8 8 9 7.00 10 10 10 10 10 LC50 2.554 2.316 2.192 2.106 LC100 12.475 10.402 10.463 8.334 SC 0.5713 2.2.3 氯化镉对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
氯化镉24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：0.096、0.085、0.048、0.039 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为0.422、0.335、0.430、0.254 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为0.020 mg·L-1(表 4)。
表 4 不同用量氯化镉对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 4. Acute toxicity of CdCl2 on juvenile Murray codCdCl2/(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0.00 10 0 0 0 0 0.01 10 0 0 1 1 0.03 10 1 1 3 3 0.08 10 3 3 5 7 0.1 10 4 6 7 9 0.14 10 7 8 10 10 0.2 10 10 10 10 10 LC50 0.096 0.085 0.048 0.039 LC100 0.422 0.335 0.430 0.254 SC 0.0200 2.2.4 硝酸铅对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
硝酸铅24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：6.651、4.082、3.424、2.892 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为75.947、58.825、41.353、22.280 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为0.4612 mg·L-1(表 5)。
表 5 不同用量硝酸铅对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 5. Acute toxicity of Pb(NO3)2 on juvenile Murray codPb(NO3)2/(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0.00 10 0 0 0 0 0.80 10 0 1 1 1 1.40 10 1 2 2 2 2.50 10 2 3 4 4 4.40 10 4 5 6 7 7.80 10 5 7 7 8 13.60 10 6 8 9 10 24.00 10 10 10 10 10 LC50 6.651 4.082 3.424 2.892 LC100 75.947 58.825 41.353 22.280 SC 0.4612 2.2.5 二氧化氯对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
12%二氧化氯24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：23.194、20.816、18.459、18.184 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为47.731、52.560、38.589、38.788 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为5.030 mg·L-1(表 6)。
表 6 二氧化氯对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 6. Acute toxicity of ClO2 on juvenile Murray cod12% ClO2/(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0.00 10 0 0 0 0 11.50 10 0 1 1 1 13.50 10 1 2 2 2 15.50 10 1 2 3 4 18.00 10 2 3 4 4 21.00 10 3 5 6 6 25.00 10 5 6 8 8 30.00 10 9 9 10 10 LC50 23.194 20.816 18.459 18.184 LC100 47.731 52.560 38.589 38.788 SC 5.030 2.2.6 聚维酮碘对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
聚维酮碘24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：3.648、2.8692.215、2.215 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为20.467、17.538、14.414、14.414 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为0.532 4 mg·L-1(表 7)。
表 7 聚维酮碘对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 7. Acute toxicity of polyvinylpyrrolidone on juvenile Murray cod聚维酮碘/(mg·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0 10 0 0 0 0 0.75 10 0 1 1 1 1 10 1 1 2 2 1.55 10 1 2 4 4 2.8 10 3 3 5 5 3.7 10 5 6 7 7 4.9 10 7 9 9 9 LC50 3.648 2.869 2.215 2.215 LC100 20.467 17.538 14.414 14.414 SC 0.5324 2.2.7 高锰酸钾对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
高锰酸钾24、48、72、96 h的半数致死体积分数(LC50)分别为：3.482、3.384、3.120、2.812 mg·L-1，致死体积分数(LC100)分别为14.504、13.198、14.680、10.798 mg·L-1，安全体积分数(SC)为0.958 9 mg·L-1(表 8)。
表 8 高锰酸钾酸对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 8. Acute toxicity of KMnO4 on juvenile Murray cod高锰酸钾/(mL-1·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0 10 0 0 0 0 1.0 10 1 1 1 1 1.5 10 1 1 2 2 2.4 10 2 2 3 3 3.2 10 3 3 4 4 3.7 10 4 4 4 5 4.2 10 6 6 6 8 4.9 10 8 9 9 10 7.0 10 10 10 10 10 LC50 3.482 3.384 3.120 2.812 LC100 14.504 13.198 14.680 10.798 SC 0.9589 2.2.8 甲醛对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
甲醛24、48、72、96 h的半数致死体积分数(LC50)分别为：33.108、29.359、26.027、24.448 mg·L-1，致死体积分数(LC100)分别为511.061、359.298、294.057、215.171 mg·L-1，安全体积分数(SC)为6.960 mg·L-1(表 9)。
表 9 甲醛对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性Table 9. Acute toxicity of deltamethrin on juvenile Murray cod甲醛/(mL-1·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0 10 0 0 0 0 5 10 1 1 1 1 10 10 2 2 2 2 20 10 2 2 3 3 40 10 5 6 6 6 80 10 8 8 9 9 120 10 8 9 9 10 140 10 10 10 10 10 LC50 33.108 29.359 26.027 24.448 LC100 511.061 359.298 294.057 215.171 SC 6.960 2.2.9 盐度对龙纹斑幼鱼半数致死浓度和安全浓度
食盐24、48、72、96 h的半数致死质量浓度(LC50)分别为：11.633、8.940、7.607、8.271 mg·L-1，致死质量浓度(LC100)分别为67.507、45.540、25.060、33.497 mg·L-1，安全质量浓度(SC)为1.5840 mg·L-1(表 10)。
表 10 食盐对澳洲龙纹斑幼鱼的急性毒性试验Table 10. Acute toxicity of salt on juvenile Murray codNaCl/(g·L-1) 苗数/尾 累计死亡数/尾 24 h 48 h 72 h 96 h 0 10 0 0 0 0 3 10 1 1 1 1 6 10 1 2 2 2 9 10 4 6 6 6 15 10 5 6 10 7 20 10 7 9 10 10 25 10 10 10 10 10 LC50 11.633 8.940 7.297 8.271 LC100 67.507 45.540 21.218 33.497 SC 1.5840 2.3 急性毒性评价
澳洲龙纹斑幼鱼对9种消毒药物各个时间段的半致死浓度和安全浓度见表 11，试验结果表明9种消毒药物对澳洲龙纹斑的急性毒性的大小顺序为：氯化镉>硫酸铜>硫酸锌>聚维酮碘>高锰酸钾>硝酸铅>食盐>二氧化氯>甲醛。
澳洲龙纹斑幼鱼对甲醛、二氧化氯耐受程度相对其他消毒药物好，对硫酸锌、硝酸铅、聚维酮碘、高锰酸钾、食盐等有较好的耐受力，对氯化镉、硫酸铜的耐受最小，毒性比较强，在其人工养殖要注意尽量避免使用。
表 11 若干药物对澳洲龙纹斑幼鱼的半数致死浓度和安全浓度Table 11. LC50 and SC of disinfectants and metal ions on juvenile Murray cod药品名称 半数致死浓度LC50 安全浓度(SC) 24 h 48 h 72 h 96 h 硫酸铜/(mg·L-1) 1.260 0.865 0.744 0.601 0.122 硫酸锌/(mg·L-1) 2.554 2.316 2.192 2.106 0.571 氯化镉/(mg·L-1) 0.096 0.085 0.048 0.039 0.020 硝酸铅/(mg·L-1) 6.651 4.082 3.424 2.892 0.461 12%二氧化氯/(mg·L-1) 23.194 20.816 18.459 18.184 5.030 10%聚维酮碘/(mg·L-1) 3.648 2.869 2.215 2.215 0.532 >99%高锰酸钾/(mg·L-1) 3.482 3.384 3.120 2.812 0.959 45%甲醛/(mL·L-1) 33.108 29.359 26.027 24.448 6.960 食盐/(g·L-1) 11.633 8.940 7.607 8.271 1.584 3. 讨论
随着水产养殖行业的扩大和发展，水产药物种类繁多，人们使用水产药物越来越广泛，在疾病防治、水质改良等方面起着不可替代的重要作用[14]；养殖用水受到重金属化合物污染，也较为常见。
在20世纪50年代后期，水产养殖行业开始广泛使用硫酸铜, 硫酸铜具有杀虫、杀菌的优点, 同时也能够作为除藻药品, 常与硫酸亚铁以5:2混用。根据我国渔业水质标准规定：在养殖水体中的铜离子的质量浓度要小于0.010 mg·L-1[15]。硫酸铜在养殖中建议用量为0.5 mg·L-1，本试验得出的澳洲龙纹斑幼鱼使用硫酸铜安全质量浓度为0.060 1 mg·L-1，低于建议用量。由于硫酸铜对澳洲龙纹斑幼鱼高毒，建议在澳洲龙纹斑养殖过程中不作为消毒药物使用。
60%硫酸锌可作为水产用杀虫剂，用于灭杀或驱除水产养殖动物的固着类纤毛虫[16]。其作用机理是：硫酸锌在水中生成锌离子与虫体细胞的蛋白质结合成蛋白盐，使其沉淀；另外锌离子容易与虫体细胞酶容易与虫体细胞酶的巯基相结合，巯基为此酶的活性基团，当与锌离子结合后就失去作用。
氯化镉对澳洲龙纹斑毒性较高，有较多报道镉对鱼高毒，养殖过程应注意水体中的镉化合物污染，鱼类经Cd2+暴露后，肝和鳃组织会出现不同程度损伤[16]。
硝酸铅与氯化镉一样，不是水产消毒药物，在4种重金属化合物中其对鱼类的毒性相对较低。但养殖水体也存在铅污染的风险，铅对鱼体除了急性毒性外，还存在蓄积毒性，在澳洲龙纹斑养殖过程中也要注意。
水产养殖中，二氧化氯的使用方便、安全、有效，作为第四代水体消毒剂，具有较强的杀菌作用。其活化后的二氧化氯在氢离子的作用下产生具有强氧化作用的新生态氧，能迅速附着在微生物的细胞表面，渗入微生物的细胞膜，与微生物蛋白质中的氨基酸产生氧化分解反应，从而使氨基酸断裂，蛋白质失活而达到杀灭微生物的目的[18]。本试验显示12%二氧化氯的常规使用量明显低于安全浓度，在澳洲龙纹斑养殖过程，可用于鱼苗投放前和养殖过程中的水体消毒。二氧化氯除作为水体消毒剂，还广泛运用于生产生活当中，可作为除臭剂、空气清新净化剂等。
聚维酮碘能够氧化或碘化病原体的巯基化合物、肽、脂质、酶等，杀灭病原体[19]，对细菌、病毒、真菌、霉菌及孢子都有较强的杀灭作用。具有稳定性高、无刺激、完全水溶、毒性小、杀菌效果持久，染色易清洗的优点，同时不受水质肥瘦、酸碱度、硬度等环境因素的影响。10%聚维酮碘溶液推荐用量0.45~0.75 mL·m-3，与试验中的安全浓度接近。在澳洲龙纹斑使用过程中，由于存在咬尾、蹭伤等情况，鱼体伤口处常出现白色毛状菌丝，使用聚维酮碘与乙酰甲喹配合使用，能够有效杀灭细菌，也有收敛作用，促进伤口愈合结痂。其用量为0.5 mL·m-3，全池泼洒，视治疗效果确定使用天数，一般2~3 d即可达到治疗效果。另外，孔祥迪等观察聚维酮碘对棕点石斑鱼对棕点石斑鱼(♀)×鞍带石斑鱼(♂)受精卵孵化的影响的研究发现，聚维酮碘处理组中25、50、75 mg·L-1各处理与对照组无差异，100 mg·L-1处理出现显著差异[20]。
高锰酸钾是一种常用的强氧化消毒杀菌药物，为暗紫色结晶，具有金属光泽，在pH较低的环境中会缓慢分解成二氧化锰和氧。光对这种分解有催化作用，故要现配现用，避光保存。高锰酸钾对细菌、真菌及体外寄生虫和病毒等均有杀灭作用。由于高锰酸钾具有强氧化性，可造成组织的氧化损伤，KMnO4还原生成的二氧化锰与蛋白质结合形成的蛋白盐复合物具有刺激甚至腐蚀作用[21]，故在使用过程中要注意。高锰酸钾在淡水鱼类养殖中被广泛使用，主要作为水质处理剂，对池塘、水泥池等进行清池消毒杀菌。在澳洲龙纹斑的养殖过程中，将配好的高锰酸钾溶解完全，再泼到池壁、池底，其用量为3~5 g·m-3。
甲醛在淡水养殖过程中，泼洒其稀释液，通过烷基化反应使菌体蛋白变性，酶和核酸等的功能发生改变，从而达到杀菌作用。在澳洲龙纹斑养殖过程中，常用35~40 mg·L-1的甲醛来改善水质、杀菌、杀车轮虫、斜管虫等固着类纤毛虫，使用24 h，隔天需大量换水，保证安全。
食盐在水产养殖过程中，常作为消毒剂和杀菌剂、杀虫剂。其作用机理是：通过药浴法改变病原体或其附着生物的渗透压，是细胞内液体发生平衡失调而死亡或从鱼体脱落。主要用于防治细菌、真菌或寄生虫等疾病。生产上常用3%至4%的食盐水溶液浸洗鱼种15 min，进行消毒。
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