0.   引言

【研究意义】多肉植物红心莲（Echeveria Perle von Nürnberg）又名紫珍珠，其根、茎、叶肥厚多汁，可储藏大量水分，是景天科（Crassulaceae）石莲花属(Echeveria)的重要商业化品种^[1]。近年来，在福建漳州多肉植物种植基地发现红心莲植株出现叶片黄化、红紫、脱落等病症，经调查发现其茎部有褐色病斑，维管束和髓部变色；严重时，茎基部腐烂缩缢，植株倒伏死亡，对多肉植物产业造成威胁。经对发病部位切片镜检发现该病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)引起的红心莲茎腐病。尖孢镰刀菌是重要的植物土传病原真菌，潜伏期长，侵染初期在植株外观上通常不显症，待表现症状后再采取防控措施，为时已晚^[2-3]。为有效防控尖孢镰刀菌引起的红心莲茎腐病为害，生产上迫切需要建立一种快速、准确检测红心莲等景天科多肉植物尖孢镰刀菌的方法。

【前人研究进展】环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种简便、快速、精确、经济的检测方法，其检测时间与常规PCR法相比大大缩短（通常1 h内）且特异性更高^[4-6]，此外LAMP法还可通过添加SYBR Green I、calcein、溴酚蓝等DNA染料，实现检测结果的直观可视化^[7]。目前该检测技术已成功应用于炭疽菌属Colletotrichum spp.、镰刀菌属Fusarium spp.、疫霉菌属Phytophthora spp.等植物病原真菌的快速检测^[8-10]。其中镰刀菌属LAMP检测涉及的寄主植物包括大豆、黄瓜、水稻、鹰嘴豆、玉米、小麦等^[10-15]。【本研究切入点】但未见LAMP应用于多肉植物镰刀菌属病原菌检测的相关报道。【拟解决的关键问题】为了获得特异性和灵敏度更高的适用于红心莲尖孢镰刀菌LAMP检测的特异性引物，选取在镰刀菌种的水平上信息丰富保守基因EF-1a（Elongation factor 1α）为靶点，对红心莲尖孢镰刀菌EF-1a基因和其他镰刀菌序列进行差异性分析，选取6个特定区域，设计了4条特异性的LAMP引物，建立一种LAMP可视化检测方法，以期在多肉植物红心莲茎腐病发生初期实现病原菌的快速准确检测，为该病害的早期防控提供依据。

1.   材料与方法

1.1   材料及DNA提取

供试菌株见表1，包括17株镰刀菌属病原菌（其中10株为尖孢镰刀菌）和10株其他菌属病原菌（其中3株寄主为多肉植物）。病原菌在装有100 mL马铃薯-葡萄糖肉汤（每升蒸馏水中含200 g马铃薯，20 g葡萄糖）的250 mL三角烧瓶中培养，在26 °C恒温摇床150 r·min⁻¹培养5～6 d；真空过滤收集各菌株菌丝，后冻干48 h，用DNA提取试剂盒（天根生物技术有限公司）提取各菌株基因组DNA，DNA浓度使用NanoDrop 2000C分光光度计测定（Thermo Fischer Scientific, USA），DNA作为LAMP检测的模板用无菌双蒸馏水按要求稀释。

表  1  用于LAMP试验的菌株

Table  1.  Fungal isolates tested by LAMP assay

菌株 Species	寄主 Host	菌株数量 Number of isolates	采集地 Locality	LAMP反应 LAMP reaction
Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌	Echeveria Perle Von Nürnberg 红心莲	5	福建 Fujian	+
Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌	Echeveria Perle Von Nürnberg 红心莲	3	云南 Yunnan	+
Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌	Cymbidium ensifolium 建兰	1	福建 Fujian	+
Fusarium oxysporum 尖孢镰刀菌	Citrullus lanatus 西瓜	1	福建 Fujian	+
Colletotrichum destructivum 毁灭炭疽菌	Echeveria Perle Von Nürnberg 红心莲	1	福建 Fujian	−
Corynespora cassiicola 山扁豆生棒孢	Sedum morganianum 玉珠帘	1	福建 Fujian	−
Alternaria alternata 链格孢菌	Echeveria spp. 石莲花属	1	福建 Fujian	−
Fusarium sporotrichioides 拟分枝孢镰刀菌	Pisum sativum 豌豆	1	福建 Fujian	−
Fusarium solani 腐皮镰刀菌	Solanum lycopersicum 番茄	1	福建 Fujian	−
Fusarium moniliforme 串珠镰刀菌	Oryza sativa 水稻	1	江苏 Jiangsu	−
Fusarium nivale 雪腐镰刀菌	Triticum aestivum 小麦	1	江苏 Jiangsu	−
Fusarium sambucinum 接骨木镰刀菌	Solanum tuberosum 马铃薯	1	黑龙江 Heilongjiang	−
Fusarium acuminatum 锐顶镰刀菌	Medicago sativa 苜蓿	1	甘肃 Gansu	−
Fusarium avenaceum 燕麦镰刀菌	Avena sativa 燕麦	1	甘肃 Gansu	−
Botryosphaeria rhodina 葡萄座腔菌	Psidium guajava 番石榴	1	福建 Fujian	−
Verticillium dahliae 大丽轮枝菌	Solanum melongena 茄子	1	福建 Fujian	−
Colletotrichum gloeosporioides 胶孢炭疽菌	Cymbidium ensifolium 建兰	1	福建 Fujian	−
Alternaria kikuchiana 梨黑斑病菌	Pyrus pyrifolia 梨	1	福建 Fujian	−
Alternaria alternata 链格孢菌	Cymbidium ensifolium 建兰	1	福建 Fujian	−
Phomopsis asparagi 茎枯病菌	Asparagus officinalis 芦笋	1	福建 Fujian	−
Magnaporche oryzae 稻瘟病菌	Oryza sativa 水稻	1	福建 Fujian	−
注：所有镰刀菌及其他真菌菌株均保存在福建省农业科学院； +表示LAMP反应阳性，− 表示LAMP反应阴性。 Note: All isolates of F. oxysporum and other fungi were collection of the Fujian Academy of Agricultural Science; positive (+) or negative (−) results were based on presence or absence of a LAMP product of expected size.

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1.2   引物设计及合成

比对红心莲尖孢镰刀菌和GenBank中的其他7株镰刀菌属病原菌的EF-1a基因序列，利用在线LAMP引物设计软件Primer software Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan）设计一套红心莲尖孢镰刀菌特异性LAMP引物组，包括1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成（图1）；利用软件primer 5设计1对PCR引物。LAMP及PCR引物序列见表2，由上海生工生物技术有限公司合成。

图  1  红心莲尖孢镰刀菌LAMP引物设计

Figure  1.  Design of LAMP primers for F. oxysporum in Echeveria

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表  2  红心莲尖孢镰刀菌LAMP及PCR检测引物

Table  2.  LAMP and PCR primers of F. oxysporum in Echeveria

引物 Primer	序列 Sequence（5′−3′）
F3	CACAACCTCAATGAGTGCGT
B3	GCATGAGCGACAACATACCA
FIP（F1c+F2）	ACCCTTACCGAGCTCAGCGG-CGTCACGTGTCAAGCAGT
BIP（B1c+B2）	TGACAAGCTCAAGGCCGAGC-AGGAGTCTCGAACTTCCAGA
PCR	F-CTCTTGGTTCTGGCATCG
	R-GTTCAGCGGGTATTCCTA

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1.3   LAMP反应体系优化

参考李华伟等^[7]的方法建立红心莲茎腐病菌LAMP（25 μL）反应体系。LAMP反应温度及时间优化：将底物、引物、红心莲尖孢镰刀菌样本DNA依次加入PCR管混匀，无菌双蒸水补至25 μL，分成2组；1组用于最佳温度梯度试验，反应设60、61、62、63、64、65、66 ℃等7个温度梯度，反应时间为60 min；另1组取前1组中最佳反应温度，后设30、45、60、75、90 min等5个时间梯度；2组试验反应最后分别于80 ℃加热10.0 min，最后在冰上终止反应；设3次重复。LAMP扩增结果的判定：反应前在PCR管盖内侧加入2 μL的1000×SYBR Green Ⅰ，反应后瞬时离心将1000×SYBR Green Ⅰ离心至管底与LAMP反应产物混匀，观察LAMP反应产物颜色判定扩增结果。LAMP检测结果可靠性验证：以红心莲尖孢镰刀菌DNA为阳性对照、无菌双蒸水为阴性对照，采用建立的红心莲尖孢镰刀菌LAMP（25 μL）反应体系及琼脂糖凝胶电泳法进行验证。

1.4   LAMP特异性检测及灵敏度验证

特异性验证：对27株供试菌株进行LAMP检测，通过观察LAMP产物颜色判定扩增结果；后从反应菌株中挑选1株从红心莲上分离的F. oxysporum，3株从多肉植物上分离的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola和Alternaria alternata，3株从其他寄主植物上分离的镰刀菌属菌株F. moniliforme、F. solani和F. sporotrichioides，共7株菌株进行琼脂糖凝胶电泳，以无菌双蒸水为阴性对照，通过判定电泳梯形条带的有无验证LAMP检测的特异性。试验设3次重复。

灵敏度验证：将红心莲尖孢镰刀菌样本DNA按10倍浓度梯度依次稀释为10 ng·μL⁻¹～1 fg·μL⁻¹ 8个不同浓度，同时进行LAMP检测和PCR检测，比对2种检测方法的灵敏度差异；试验设3次重复。

1.5   田间发病样品的LAMP检测

利用建立的LAMP检测方法对采自福建（10份样本）及云南（5份样本）自然感染的红心莲茎腐病发病样本进行检测，同时通过PCR方法和组织分离法进行检测验证。LAMP和PCR检测样本DNA参照Lan等^[12]的方法提取；组织分离法参照Yao等^[3]的方法进行，略加改动。

2.   结果与分析

2.1   LAMP检测方法建立

LAMP反应温度及时间优化结果显示，在7个温度梯度中，当反应温度62 ℃时，有梯形条带出现，但条带弱，随着反应温度提高，条带变亮，当反应温度达65 、66 ℃时，条带扩增效果较好且无明显差异（图2-a），确定最佳反应温度为65 ℃。在5个时间梯度中，反应时间45 min时，出现梯形条带，但条带弱，随着反应时间延长，条带变亮，在60、75、90 min时扩增效果好，但效果差异不明显（图2-b），为提高LAMP检测效率，确定最佳反应时间为60 min。依此建立红心莲尖孢镰刀菌LAMP（25 μL）最优反应体系：底物为20 mmol·L⁻¹Tris-HCl、10 mmol·L⁻¹（NH₄）₂SO₄、6.0 mmol·L⁻¹ MgSO₄、50 mmol·L⁻¹ KCl、0.8 mmol·L⁻¹甜菜碱、1.4 mmol·L⁻¹ dNTPs和8 U Bst DNA聚合酶，引物为0.2 μmol·L⁻¹外侧引物F3/B3和1.6 μmol·L⁻¹内侧引物FIP/BIP，1 μL样本DNA（50 ng），无菌双蒸水补足25 μL；LAMP反应温度及时间分别为65 ℃和60 min；后置于80 ℃加热10.0 min，最后在冰上终止反应。反应前在PCR管盖内侧加入2 μL的1000×SYBR Green Ⅰ，反应后瞬时离心，观察产物颜色，阳性呈绿色，阴性呈黄绿色。

图  2  LAMP反应最佳温度及时间筛选

Figure  2.  Optimal reaction temperature and time for LAMP assay

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LAMP检测结果可靠性验证表明，阳性对照呈绿色，对应的琼脂糖凝胶电泳扩增出梯形条带；阴性对照呈现黄绿色，琼脂糖凝胶电泳无梯形条带（图3）。表明建立的LAMP检测方法可行，能可靠检测到红心莲尖孢镰刀菌F. oxysporum。

图  3  LAMP检测红心莲尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum

注：a: LAMP产物凝胶电泳；b: LAMP产物颜色反应。1：Fusarium oxysporum, 2：CK阴性对照。

Figure  3.  Detection of F. oxysporum on Echeveria by LAMP assay

Note: a: agarose gel electrophoresis analysis of LAMP products; b: visual result of LAMP test. Lane 1: F. oxysporum; Lane 2: CK, negative control.

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2.2   LAMP特异性检测及灵敏度验证

特异性检测结果显示，27株供试菌株（表1）中仅有尖孢镰刀菌菌株的LAMP反应管呈阳性反应，其他菌株LAMP反应管均呈阴性反应；进行琼脂糖凝胶电泳的7株菌株，仅红心莲尖孢镰刀菌产生电脉梯形条带，其他6株菌株和阴性对照均没有产生条带（图4）。说明本研究建立的LAMP检测方法具特异性，仅能检出红心莲尖孢镰刀菌F. oxysporum。

图  4  LAMP检测特异性验证

注：a: LAMP产物2.0%凝胶电泳特异性检测；M：marker DL2000, 1：Fusarium oxysporum, 2：Fusarium moniliforme, 3：Colletotrichum destructivum, 4：Corynespora cassiicola, 5：Alternaria alternate, 6: Fusarium sporotrichioides, 7：Fusarium solani, 8：CK阴性对照。 b: LAMP产物特异性颜色反应。1~8试管病原菌样品顺序同（a）.

Figure  4.  Specificity of LAMP assay

Note: a: specificity of LAMP for F. oxysporum and other pathogens determined by 2.0% agarose gel electrophoresis. Lane M: marker DL2000; Lane 1: F. oxysporum; Lane 2: F. moniliforme; Lane 3: Colletotrichum destructivum; Lane 4: Corynespora cassiicola; Lane 5: Alternaria alternate; Lane 6: F. sporotrichioides; Lane 7: F. solani; Lane 8: CK, negative control. b: specificity of LAMP for F. oxysporum determined by visual results. 1–8 codes for pathogens in test tubes as shown under Note a.

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灵敏度验证结果显示，当红心莲尖孢镰刀菌F. oxysporum样本DNA质量浓度为10 fg·μL⁻¹时，LAMP产物呈绿色（图5），发生阳性反应，对应的琼脂糖凝胶电泳扩增出梯形条带（图5）；而PCR检测在DNA质量浓度为100 fg·μL⁻¹时条带开始变弱，DNA质量浓度为10 fg·μL⁻¹时已观察不到条带（图5）。说明本研究建立的LAMP检测方法具更高的灵敏性，其灵敏度是PCR检测的10倍。

图  5  LAMP灵敏度检测验证

注: a: LAMP产物琼脂溏凝胶电泳，M：marker DL2000，泳道1~8：DNA质量浓度分别为10 ng·μL⁻¹、1 ng·μL⁻¹、100 pg·μL⁻¹、10 pg·μL⁻¹、1 pg·μL⁻¹、100 fg·μL⁻¹、10 fg·μL⁻¹、1 fg·μL⁻¹; b: LAMP产物灵敏度颜色反应，1~8 PCR管DNA浓度顺序同（a）；c：PCR产物琼脂糖凝胶电泳。

Figure  5.  Sensitivity of LAMP and PCR

Note: a: LAMP assay determined by 2.0% agarose gel electrophoresis. Lane M: marker DL 2 000 DNA; Lanes 1–8: amplified products of LAMP reaction using DNA at concentrations of 10 ng·μL⁻¹, 1 ng·μL⁻¹, 100 pg·μL⁻¹, 10 pg·μL⁻¹, 1 pg·μL⁻¹, 100 fg·μL⁻¹, 10 fg·μL⁻¹, 1 fg·μL⁻¹. b: visual results of LAMP reactions from diluted genomic DNA. Concentrations of 1–8 pathogens correspond to Note a. c: agarose gel electrophoresis analysis on PCR products.

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2.3   田间发病样品的LAMP检测

选取15份自然感染茎腐病菌红心莲茎腐病茎部组织样本，其中8份茎部有明显褐色病斑；5份症状不明显，茎部有零星褐色小点；2份无发病症状。经LAMP检测、PCR检测和组织分离法分别检测结果表明，田间红心莲茎腐病原菌-尖孢镰刀菌的检出率均为100%，3种方法的检测符合率100%，说明本研究建立的LAMP检测法可用于由尖孢镰刀菌引起红心莲茎腐病的田间快速检测。

3.   讨论与结论

LAMP检测技术是新兴的基因扩增技术，被广泛用于植物病原菌的快速检测，与PCR检测相比，其可在更短时间内简便地扩增到靶标病原菌^[16]。本研究根据红心莲尖孢镰刀菌的靶标基因序列EF-1α的6～8区域设计特异性LAMP引物组，通过LAMP体系优化，建立了红心莲尖孢镰刀菌LAMP快速检测方法，其对红心莲茎腐病发病样本的检测结果与PCR及组织分离法检测的结果一致，可用于由尖孢镰刀菌引起红心莲茎腐病的田间快速检测。

特异性是LAMP检测技术的一个重要指标，国内外学者在尖孢镰刀菌及相关种的LAMP检测中利用不同靶标基因序列设计特异性引物^{[12, 17-18]}，并根据这些特异性引物建立相应的LAMP检测体系。EF-1a基因序列信息丰富，有研究表明EF-1a基因在镰刀菌种间具有一定的保守性，与rDNA-ITS、RAPD、β-tubulin等基因相比更具特异性^[19]，此外Ghosh等^[14]报道了以EF-1a基因为靶标设计LAMP引物检测F. oxysporum f. sp. Ciceris，说明EF-1a基因序列适用于尖孢镰刀菌LAMP引物的设计。本研究选择红心莲尖孢镰刀菌EF-1α作为靶标基因序列设计LAMP特异性引物有效扩增到了所有的尖孢镰刀菌分离株，未能扩增所有其他菌株，包括一些密切相关的多肉植物上分离的Colletotrichum destructivum、Corynespora cassiicola、Alternaria alternata，以及F. sporotrichioides、F. moniliforme、F. sambucinum、F. solani、F. nivale、F. acuminatum和F. avenaceum等镰刀菌属真菌，表现出很高的特异性。

灵敏度是LAMP检测技术的另一个重要指标，众多研究表明LAMP检测灵敏度一般高于相应的PCR检测^{[4, 18, 20]}。本研究建立的LAMP方法DNA检测最小质量浓度为10 fg·μL⁻¹，而PCR检测为100 fg·μL⁻¹，LAMP法检测灵敏度提高了10倍；其灵敏度均高于以其他基因为靶点建立的LAMP方法^[17-18]。Ghosh等^[14]报道了以EF-1a基因为靶点设计LAMP引物检测F. oxysporum f. sp. ciceris，其灵敏度与本研究设计的特异性引物一致。但随着灵敏度的提高，易导致开盖形成气溶胶污染，造成假阳性；本研究以SYBR GreenⅠ作显色剂，反应前直接滴于PCR管盖内侧，降低了假阳性出现。

本研究建立的红心莲尖孢镰刀菌LAMP快速检测技术体系，不仅特异性强、灵敏度高，而且检测结果可视、假阳性低，在田间能快速检测出由尖孢镰刀菌引起的红心莲茎腐病，具有很好的应用推广前景。今后，可对各种尖孢镰刀菌专化型的靶标基因序列进行探究，建立更加特异、灵敏的尖孢镰刀菌专化型LAMP快速检测技术体系。