0.   引言

【研究意义】常规水稻育种方法需要经过多代分离逐渐形成稳定的品种，而花药培养技术具有缩短育种年限，快速稳定育种材料等优点，利用花培技术作为育种辅助手段在创制原始材料、选育新品种、提纯不育系等方面成效显著^[1-2]。籼稻和粳稻是水稻的两个亚种，亲缘关系较远，它们在株型、品质和抗逆等方面具有丰富的多样性，通过挖掘两个亚种之间的杂种优势，有助于在抗逆和品质方面进一步提高，同时也是水稻功能基因挖掘的重要基因资源。通过花药培养技术能够快速获得稳定的籼粳育种中间材料，也是构建籼粳交DH遗传群体的有效方法^[3-5]。【前人研究进展】一般来说粳稻花药更容易诱导，籼稻材料较难形成愈伤组织，绿苗率低，而籼粳交材料花药培养难度介于二者之间^[6-7]。前人的研究发现，供体品种的基因型是花药培养最关键因素，目前认为单核靠边期取样配合低温处理是水稻花培最常规有效的处理方式^{[6, 8]}。同时，培养基类型是目前花药培养效率重要的变化因素^[9-10]。施利利等^[11]以津稻291/ IRBB60籼粳正反交材料作为研究材料，发现SK3培养基具有最高的愈伤诱导率。吴丹等^[7]以5份不同籼粳成分的水稻为试验材料，分别以不同基本培养基(改良M8、SK3、合5、NB)、碳源(蔗糖和麦芽糖)、激素(单一激素、复合激素)为变量，设计16种诱导培养基进行花药培养，发现不同培养基的诱导率和成苗率存在显著差异，以M8为基本培养基，添加蔗糖为碳源，复合激素能获得较高成苗率。何涛等^[12]利用21个不同基因型的水稻材料对不同培养条件的花药培养力进行比较，发现基因型对花药培养力影响最大，但是3种培养基在各种基因材料诱导率方面各不相同，没有发现一种较为通用的培养基配方。【本研究切入点】云引是具有广谱稻瘟病抗性的粳稻品种，田间注射接菌和室内离体接菌结果表明其对大多数稻瘟病具有抗性^[13]，是一个优良的花培供体亲本。然而，相同的水稻材料，在不同培养基成分构成的条件下，如培养基、碳源、植物生长调节剂配比，花药的诱导率和成苗率等都存在显著差异^[6-7]。此外，前人的研究往往将愈伤诱导和分化成苗的条件单独进行考虑，缺乏对不同愈伤诱导条件下绿苗成苗率进行研究。【拟解决的关键问题】为了提高云引籼粳杂交后代花药培养效率，本研究拟通过优化培养基成分以及分化愈伤大小等因素，增加花药培养绿苗率以及花培力，为稻瘟病抗性品种云引的挖掘和利用奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料创制

选用本实验室保存的稻瘟病抗性粳稻品种云引作为母本，与常规籼稻品种粤晶丝苗进行杂交，在田间种植F₁代植株，取F₁幼穗进行后续试验。

1.2   花药培养流程

当水稻处于孕穗期、叶枕距为5～15 cm时（此时期一般为花粉分化的单核靠边期），剪取穗部，用75%酒精进行表面消毒，并用湿滤纸包裹，置于7℃低温处理10 d；在超净台中将叶鞘剥开，将幼穗取出剪成5 cm长度，置于250 mL三角瓶中，用75%酒精消毒1 min，用无菌水冲洗1遍，用2%次氯酸钠消毒10 min，期间轻轻震荡数次，随后用无菌水将残余的次氯酸钠冲洗干净；用尖头镊子剥开花药，将花药接种于90 mm培养皿中，每个培养皿接种花药100枚，放置于27℃暗培养20～50 d，待愈伤组织长出后，转移到分化培养基上，分化15～30 d，统计绿苗数量。

1.3   培养基配方

诱导培养基：采用常用的NB培养基^[14]或M8培养基^[15]作为基础培养基，选择麦芽糖或蔗糖作为碳源（质量浓度50 g·L⁻¹），选用复合植物生长调节剂含不同质量浓度2,4-D（0.5～2.0 mg·L⁻¹）、1.0 mg·L⁻¹ KT以及1.0 mg·L⁻¹ NAA，添加3.0 g·L⁻¹植物凝胶，pH=5.85。诱导培养基详见表1。

表  1  培养基成分

Table  1.  Components in culture media

培养基编号 NO. of media	基础培养基 Basic media	碳源 Carbon source	2,4-D质量浓度 Concentration of 2,4-D/（mg·L−1）
NS05	NB	蔗糖	0.5
NS10	NB	蔗糖	1.0
NS20	NB	蔗糖	2.0
MS05	M8	蔗糖	0.5
MS10	M8	蔗糖	1.0
MS20	M8	蔗糖	2.0
NM05	NB	麦芽糖	0.5
NM10	NB	麦芽糖	1.0
NM20	NB	麦芽糖	2.0
MM05	M8	麦芽糖	0.5
MM10	M8	麦芽糖	1.0
MM20	M8	麦芽糖	2.0

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分化培养基由MS基础培养基的大量元素和微量元素，添加M8有机成分、20 g·L⁻¹蔗糖和20 g·L⁻¹山梨醇、3 mg·L⁻¹ KT和0.5 mg·L⁻¹ NAA、8.8 g·L⁻¹琼脂，pH=5.9。

1.4   数据分析与体系确定

根据花药培养力选择适合于云引籼粳交材料最适合培养基和培养条件，其中出愈率=愈伤数/花药数×100%，绿苗率=绿苗数/愈伤数×100%，得苗率=（绿苗数+白化苗数）/愈伤组织数×100%，花药培养力=出愈率×绿苗率×100%。

2.   结果与分析

2.1   基础培养基对培养力的影响

基础培养基的成分不同，对于愈伤组织的出愈率影响较大，进而影响花药培养力。从表2可以看出，M8培养基无论在出愈率还是在绿苗率上都显著高于NB培养基，其中NB的最高花药培养力仅为0.52%，而M8的最高花药培养力接近2%，花药培养效率相差近4倍，因此后续选择M8作为云引籼粳交的基础培养基。

表  2  不同培养基组合的花培力的比较

Table  2.  Anther cultivation performances on media of varied formulations

培养基 Media	基础培养基 Basic media	出愈率 Rate of callus formation/%	绿苗率 Rate of green seedling/%	花药培养力 Anther culture ability/%
NS05	NB	2.32 e	N/A	N/A
NS10	NB	5.88 dc	8.64 d	0.51 d
NS20	NB	7.34 bc	7.32 d	0.52 d
MS05	M8	6.75 bc	19.6 b	1.32 b
MS10	M8	13.32 a	14.2 c	1.89 a
MS20	M8	16.75 a	11.5 c	1.92 a
NM05	NB	1.35 f	N/A	N/A
NM10	NB	1.32 f	N/A	N/A
NM20	NB	3.28 e	N/A	N/A
MM05	M8	3.75 e	24.3 a	0.90 c
MM10	M8	6.36 c	21.3 ab	1.34 b
MM20	M8	8.23 b	17.5 b	1.40 b
注：①同列数据后含不同字母者在5%水平上差异显著，表3同。②N/A表示样本过少而不被采用。 Note: ① Figures marked with same letter on a same column are not significantly different at 5% level. Same for Table 3. ② N/A indicates sample size is too low to be useful.

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2.2   不同碳源对培养力的影响

比较了麦芽糖和蔗糖作为碳源对花药培养力的影响（表2）。在M8基础培养基条件下，麦芽糖的绿苗率比蔗糖高，但是蔗糖具有较高的出愈率。综合来看，以蔗糖为碳源具有较高的花培力。此外，本研究同时比较了出愈早期（28 d）和出愈后期（42 d）的愈伤数（表3），结果表明以蔗糖为碳源在出愈早期就能产生较多的愈伤组织，而以麦芽糖为碳源出愈早期的平均出愈率仅相当于出愈后期的50%，因此以蔗糖作为碳源较为合适。

表  3  不同诱导时间的出愈率比较

Table  3.  Callus induction rates by varied induction time

培养基编号 NO. of media	28 d出愈率 Rate of callus formation in 28 d/%	42 d出愈率 Rate of callus formation in 42 d/%	28 d出愈率/ 42 d出愈率 Ration of callus formation (28 d versus 42 d) /%
MS05	2.52 cd	4.25 d	59.29
MS10	7.25 b	9.35 b	77.54
MS20	11.32 a	14.50 a	78.07
MM05	1.45 d	3.25 d	44.62
MM10	3.22 c	5.35 cd	60.19
MM20	3.35 c	7.35 bc	45.58

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2.3   不同2,4-D质量浓度对于绿苗率的影响

在M8基础培养基条件下，随着2,4-D质量浓度增高，出愈率显著上升，而绿苗率下降（表2、3）。以M8+蔗糖为例，添加2 mg·L⁻¹的2,4-D能够获得更高的出愈率，但是绿苗率低于添加1 mg·L⁻¹ 2,4-D的组合，因此二者花药培养力相当，相似的情况也出现在M8+麦芽糖体系中（表2）。而在M8+麦芽糖体系中，添加0.5 mg·L⁻¹的2,4-D虽然具有较低的早期出愈率，但1.0 mg·L⁻¹与2.0 mg·L⁻¹的2,4-D基本无差异。因此在花培时，应该综合考虑出愈率和绿苗率，来选择合适的2,4-D质量浓度水平。

2.4   不同愈伤组织大小的绿苗率

为了探讨不同愈伤组织大小对于绿苗率的影响。选取在MM20培养基上，出愈伤组织时间为35～42 d的愈伤组织，待愈伤组织长至0.1、0.2、0.4、0.8 cm时，转移至分化培养基，分化30 d后统计绿苗率（表4），其中0.1 cm大小的愈伤组织，分化得苗率最低，仅为23.2%，而绿苗率约为4.1%，表明愈伤组织过小成苗率显著下降，大部分愈伤组织褐化死亡；0.2 cm大小的愈伤组织，得苗率为63.2%，但是绿苗率高达18.3%；0.4 cm的愈伤组织，得苗率高达85.5%，但是大部分为白化苗，其绿苗率下降为13.3%；0.8 cm的愈伤组织，得苗率为83.6%，但其绿苗率仅为5.35%。因此，当愈伤长至0.2 cm时进行分化是最佳时机，愈伤组织在培养基上生长时间不宜过长，否则分化力显著下降。

表  4  不同愈伤组织大小进行分化成苗得苗率的比较

Table  4.  Seedling yields after differentiation using calluses of different sizes (单位/%)

组别 Groups	愈伤组织大小 Callus Size
	0.1 cm	0.2 cm	0.4 cm	0.8 cm
全部 Total seedlings	23.2	63.2	85.5	83.6
绿苗 Green seedlings	4.1	18.3	13.3	5.35

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3.   讨论与结论

综合上述的试验结果，云引籼粳交材料的花药培养条件为：M8基础培养基，添加50 g·L⁻¹蔗糖作为碳源和1～2 mg·L⁻¹ 2,4-D，当花药愈伤组织长至0.2 cm时转移至分化培养基分化，建立了较为稳定的云引籼粳材料花培体系。

水稻组织培养受基因型影响较大，无论是胚诱导还是花药诱导，粳稻培养力都比籼稻高。而培养条件对于花药培养力影响较大。从本研究来看，对花药培养力的影响，基础培养基成分＞碳源＞2,4-D 质量浓度，而绿苗率随植物生长调节剂浓度增加而降低。

同时，愈伤组织分化大小也会影响绿苗率以及得苗率。虽然水稻花药培养技术已较为成熟，但是选择合适的培养基能够显著提高花药培养力，特别是能够提高绿苗率。粳稻出愈率普遍较高，本课题组在前期对其他粳稻品种进行花药诱导时发现，绿苗分化率并不显著高于籼稻品种。前人的研究也发现，籼粳成分高低与绿苗分化率无显著相关性^{[7, 12]}。因此如何提高绿苗率是花药培养优化的重要方向，应当特别注意：虽然高质量浓度的2,4-D能够提高出愈率，且在高质量浓度2,4-D条件下愈伤组织生长虽然不受影响，但是绿苗率显著下降。今后或许可以通过分步培养，即前期高质量浓度2,4-D诱导，后期转至低质量浓度2,4-D生长的培养方法来提高绿苗率，进而提高花药培养的效率。