Genetic Diversity of Tieguanyin and Huangdan Half-sib Tea Cultivars Determined by Using ISSR Markers
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摘要: 铁观音和黄棪是乌龙茶茶树育种的骨干亲本，以这2份品种及其为亲本选育出的新种质及不同地域种质的铁观音茶树为研究材料，采用ISSR分子标记技术，利用筛选出的9个多态性较好、扩增条带较清晰的ISSR引物，分别对24份茶树品种（系）进行扩增，分析其遗传多样性和亲缘关系。结果表明：9个ISSR引物共扩增出73条稳定的谱带，其中47条具有多态性，多态性比率为64.4%，平均每个引物扩增出5.2条谱带；遗传相似性分析显示24份供试种质的遗传相似系数0.544~0.889，平均为0.727，表明供试种质的遗传基础较窄，亲缘关系较近。Abstract: Two tea cultivars, Tieguanyin and huangdan, are the core parents used in oolong tea breeding. Many premium oolong tea cultivars have been bred from them. Using ISSR molecular markers, 9 primers with high polymorphism and clearly distinguishable ISSR amplified bands were selected for the amplification of 24 tea varieties (or lines) as well as the determination of the genetic diversity and relationship among the cultivars. A total of 73 bands was generated with 15 ISSR primers. Of which, 47 were polymorphic at a rate of 64.4%, averaging 5.2 bands amplified per primer. An analysis on the genetic similarity of the 24 tea cultivars yielded coefficients ranging from 0.644 to 0.889, with an average of 0.727. It suggested that the genetic bases of the germplasms were limited, and their genetic relationships close. The results would provide valuable information for tea breeding in the future.
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0. 引言
【研究意义】水稻是重要的粮食作物之一，我国一半以上的人口以稻米为主粮，水稻育种生产与国家粮食安全密切相关[1]。恢复系在水稻杂交育种中发挥着重要作用，恢复力强、配合力高、丰产稳产性好、抗性强、品质优、株叶形态好的恢复系在生产上有重要的应用价值[2]。杂交后代的产量和米质与恢复系直接相关，杂交稻要获得高产，其亲本要有优良的农艺性状[3]。恢复系的优良性状在选育超高产杂交水稻方面起关键作用。因此，研究分析恢复系的相关性状对其育种应用及解析杂交后代的遗传方面均有重要意义。【前人研究进展】水稻粒型是决定千粒重进而影响水稻产量的重要性状[4]，同时，粒形与稻米的外观品质、加工品质和蒸煮品质也紧密相关[5-8]。研究表明，粒形受加性效应影响较大，且恢复系影响大于不育系，其中粒长的恢复系亲本方差贡献率较大[9]。已克隆的水稻粒形相关基因有GL7、GS3、GW8、SGL、GIF1等，其中水稻GL7编码的蛋白与拟南芥中LONGIFOLIA蛋白同源，调控细胞的纵向伸长[10]；GS3编码包含4个结构域的跨膜蛋白，负向调控籽粒的大小和重量[11]；GW8编码包含SBP结构域的转录因子，正调控细胞增殖，同时控制谷粒大小、粒型和稻米品质[12]；SGL编码的蛋白是驱动蛋白13亚家族的成员，正调节细胞纵向伸长，调控籽粒长度[13]；GIF1编码的蛋白是一种细胞壁转化酵素，在水稻籽粒发育时，控制着蔗糖运输卸载和灌浆，影响籽粒的充实度[14]。另外，稻米品质受环境的影响，但主要受遗传控制。杂交后代的整精米率与恢复系的整精米率呈显著正相关 [15]；并且恢复系对F1代的垩白度和直链淀粉含量的影响也大于不育系[16，17]。水稻中控制米质的相关基因有Wx、Chalk5、ALK、OsSSI、OsBEIIb等，其中Wx编码颗粒淀粉合成酶，是控制直链淀粉合成的主效基因；Wx的第一内含子剪切效率与第一内含子+1的碱基直接相关，当其第一内含子+1位碱基为G时（即为等位基因Wxa），能够正常剪接，产生较多的Wx成熟mRNA进而翻译成Wx蛋白并使稻米中直链淀粉含量较高；而当第一内含子+1位碱基为T时（即为等位基因Wxb），无法正常剪接，产生保留第一内含子的mRNA前体，Wx蛋白翻译受阻，稻米中直链淀粉含量较低[18]。Chalk5编码液泡膜质子转运焦磷酸酶，具无机焦磷酸水解活性和质子转运活性，影响水稻籽粒垩白的形成和精米率等品质性状[19]；ALK 基因编码可溶性淀粉合酶Ⅱ，主要控制稻米的糊化温度[20]；OsSSI编码淀粉合成酶Ⅰ，影响水稻籽粒中支链淀粉的结构，从而影响稻米的糊化温度[21]；OsBEIIb编码淀粉分支酶IIb，其表达水平的改变影响淀粉的结构，从而影响垩白等[22]。【本研究切入点】恢复系福恢676是在产量和品质相结合上取得突破性进展的强优势恢复系，由籼粳交中间材料 8L124与优良恢复系明恢 63杂交，再与优良恢复系蜀恢 527复交后育成[23]。现已利用福恢676配组育成了18个通过省级或国家品种审定的杂交稻品种，且福恢676配制的杂交水稻品种具有产量高、米质优、抗性好等特点。但目前关于具体分析恢复系福恢676粒形和米质及相关基因表达等方面的研究还尚未有报道。【拟解决的关键问题】本研究以恢复系福恢676、亲本明恢63和蜀恢527以及其他两个生产上常用的恢复系明恢86和福恢673为材料，分析比较其粒形及米质，确定Wx基因第一内含子+1 位碱基类型，并获得控制粒形和米质相关基因的表达模式，为恢复系福恢676的应用推广提供理论参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
福恢676、明恢63、蜀恢527、明恢86、福恢673种子由福建省农业科学院农业农村部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室保存。2021年分别种植于福州、泉州和三明水稻试验基地，收获成熟种子并自然晒干，备用。
rTaq DNA聚合酶、Acc I限制性内切酶购自TaKaRa公司；总RNA提取试剂Trizol购自全式金生物技术有限公司；cDNA链反转试剂盒（东洋纺反转录试剂盒）购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；荧光定量试剂Rox Reference DyeII购自罗氏（Roche）公司。
1.2 试验方法
1.2.1 稻谷长、宽、厚的测量
随机取适量各恢复系的种子，采用游标卡尺测量稻谷的长、宽、厚，每个材料3次重复（50粒·次−1），并测定千粒重。
1.2.2 PCR扩增及酶切分析
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取水稻植株基因组DNA。以DNA为模板进行PCR扩增，所用上游引物Wx-F：5'-CTTTGTCTATCTCAAGACAC-3'，下游引物Wx-R：5'-TTTCCAGCCCAACACCTTAC-3'[24]；PCR反应体系：rTaq Buffer 1 µL，dNTP （2.5 mmol · L−1）0.8 µL，上游引物和下游引物（10 μmol · L−1）各 0.4 µL，DNA模板0.5 µL，rTaq 0.1 µL，ddH2O补足至10 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min后，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃延伸7 min。以广恢128为对照，反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并送测序，进行序列分析。取上述PCR产物，进一步采用Acc I进行酶切分析，反应体系为：PCR产物3 µL，10× M buffer 1 µL，Acc I 0.5 µL，ddH2O补足至10 µL，37 ℃ 酶切4 h；再取5 μL 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 米质测定
收获的成熟种子，室温放置3个月。每个材料称取200 g，采用《中华人民共和国农业农村部标准米质测定方法》（NY/T 2334—2013），对样品的糙米率、精米率、整精米率、垩白率、垩白度、透明度、碱消值、直链淀粉含量、胶稠度进行测定，每个材料3次重复。
1.2.4 荧光定量PCR
在水稻扬花期，剪去已经开花和还未开花的颖花，留下当天开花的颖花，并在灌浆4 d、7 d和11 d时取样，去除颖壳，液氮速冻，保存于−80 ℃备用。采用Trizol法提取水稻种子总RNA；按照东洋纺反转录试剂盒的操作说明书，反转录合成cDNA一链，并稀释20倍。进行SYBR Green I荧光定量PCR（qRT-PCR），以水稻肌动蛋白基因Actin150为内参基因，反应体系：Rox Reference DyeⅡ 10 µL，上下游引物（10 µmol· L−1）各 0.6 µL，cDNA 2 µL，ddH2O补足至20 µL。采用Thermo实时荧光定量PCR仪（QuantStudioTM 7 Flex System），每个反应设4次重复，反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 40个循环；反应结束后进行熔解曲线分析，熔解曲线根据标准程序进行。所用引物详见表1。
表 1 qRT-PCR引物Table 1. Primers for qRT-PCR基因名称Gene names 引物序列（5′-3′）Primer sequence（5′-3′） GL7 F: AAGGACTTCAGGGCTCTCAGGATAC R: GCTGGAAGTGTCTGGAACTGGTGTT GS3 F: GGGTGAAATAAATTCAATCGAAGGG R: GCACAAACAGCGAAACTTCTTCAAG GW8 F: AGGAGTTTGATGAGGCCAAG R: GCGTGTAGTATGGGCTCTCC SGL F: CTCTTCTATGGAACCTGACAG R: CTGAGAAGCTGAAGCAGATG GIF1 F: TTGGTAGTAGGGTCGCTTGGGC R: CCAGTCCGGAGCTCAGAGTCGA Chalk5 F: GCCGTCACCTTCCTCTCCCTCC R: CGTAAGCATTGCTCGTGAAGTACTCG ALK F: CCTATTCCTGCGGTAGAAGA R: CCGAATCGTCATCCTGGT OsSSI F: GTGAGCAGGAGTCTGAGAT R: TGACCACGAAGAGCAAGA OsBEIIb F: CGGTTTCAGCAGGTTCAGA R: CTCCAGATGACTCAATCTCAACTT Actin150 F: AGTGTCTGGATTGGAGGAT R: TCTTGGCTTAGCATTCTTG 1.3 数据分析
采用单因素方差分析或t检验对获得的数据进行统计分析，P≤0.05为差异显著；采用 SPSS 软件及Microsoft Excel 2019进行统计分析及作图。
2. 结果与分析
2.1 稻谷粒形及千粒重分析
对福恢676、亲本明恢63和蜀恢527，以及籼型恢复系明恢86和福恢673的谷粒粒形进行测量和分析。结果（图1、表2）显示，福恢676的谷粒长大多为10~11 mm，种植于3个地区的福恢676的谷粒长均介于亲本明恢63与蜀恢527之间，并且福恢676的谷粒长均大于其他两个恢复系明恢86和福恢673。福恢676的谷粒宽和谷粒厚分别为2.70 mm和2.00 mm左右，但种植于不同地区福恢676的谷粒宽和谷粒厚与其他恢复系相比没有明显的统一趋势。种植于福州和泉州的福恢676的长宽比为3.90和3.92，种植于三明的为3.72，种植于3个地区的福恢676的长宽比均明显小于蜀恢527但明显大于明恢63、明恢86和福恢673。福恢676的千粒重为27～31 g，种植于福州和三明的福恢676的千粒重均大于亲本明恢63、明恢86和福恢673，但均小于亲本蜀恢527。
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图 1 不同恢复系稻谷粒形（福州）Figure 1. Shapes of rice grains of different restorer lines (Fuzhou)表 2 稻谷粒形和千粒重分析Table 2. Grain shape and 1000-grain weight of rice restorers种植地区Growing areas 恢复系Restorer lines 谷粒长Grain length/mm 谷粒宽Grain width/mm 长宽比Length-width ratio 谷粒厚Grain thickness/mm 千粒重1000-grain weight/g 福州 Fuzhou 福恢676 Fuhui676 10.57±0.33 2.72±0.10 3.90±0.18 2.09±0.07 27.66±0.47 明恢63 Minghui63 9.98±0.27* 2.72±0.09 3.67±0.15* 1.99±0.05* 26.82±0.17* 蜀恢527 Shuhui527 11.28±0.34* 2.73±0.11 4.14±0.19* 2.08±0.06 29.40±0.13* 明恢86 Minghui86 9.91±0.24* 2.75±0.09 3.60±0.11* 1.94±0.10* 26.60±0.20* 福恢673 Fuhui673 10.15±0.36* 2.74±0.08 3.70±0.13* 2.00±0.07* 26.42±0.26* 泉州 Quanzhou 福恢676 Fuhui676 10.80±0.40 2.76±0.07 3.92±0.15 2.04±0.09 30.31±0.02 明恢63 Minghui63 10.51±0.25* 2.79±0.07 3.77±0.10* 2.00±0.07 30.17±0.13 蜀恢527 Shuhui527 11.54±0.39* 2.79±0.09 4.14±0.15* 2.00±0.09 31.82±0.01* 明恢86 Minghui86 9.98±0.28* 2.78±0.10 3.60±0.14* 2.06±0.07 29.44±0.38* 福恢673 Fuhui673 10.31±0.42* 2.74±0.11 3.77±0.22* 2.08±0.06 30.35±0.29 三明 Sanming 福恢676 Fuhui676 10.36±0.46 2.79±0.09 3.72±0.21 2.07±0.05 29.13±0.17 明恢63 Minghui63 9.84±0.33* 2.80±0.09 3.52±0.18* 1.99±0.08* 28.52±0.14* 蜀恢527 Shuhui527 10.85±0.32* 2.79±0.09 3.90±0.19* 2.01±0.08* 30.87±0.20* 明恢86 Minghui86 9.44±0.29* 2.85±0.12 3.32±0.19* 1.94±0.08* 27.88±0.48* 福恢673 Fuhui673 9.99±0.40* 2.86±0.10* 3.49±0.16* 1.97±0.11* 26.89±0.38* *表示差异达显著水平（P≤ 0.05），没有标注*表示没有显著差异。下表同。*indicate significant differences at P≤0.05. Same for below. 2.2 Wx第一内含子+1位碱基类型分析
以福恢676、明恢63、蜀恢527、明恢86、福恢673植株的基因组DNA为模板，用引物Wx-F/Wx-R进行PCR扩增，电泳检测显示样品中均扩增出大小为253 bp的目的条带（图2A）。进一步采用限制性内切酶Acc I 对 PCR 产物进行酶切，电泳结果显示对照广恢128的Wx片段被切成约126 bp的片段，即其Wx基因第一内含子+1位碱基为G；而5个恢复系中扩增出的Wx片段均没有被切动，仍为 253 bp（图2B），即Wx基因第一内含子+1位碱基为T而不是G[25]。进一步的测序分析也表明，5个恢复系中Wx基因第一内含子+1位碱基均为T（图3），即Wx基因型为Wxb。
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图 2 Wx基因片段的PCR扩增及限制性酶切分析A为PCR扩增，B为限制性酶切分析；M为Marker 2000，1为对照广恢128，2为明恢86，3为明恢63，4为福恢676，5为福恢673，6为蜀恢527。Figure 2. PCR amplification and restriction enzyme analysis of Wx gene fragmentA: PCR amplification; B: restriction enzyme analysis; M: Marker 2000 bp; 1: Guanghui128 as control; 2: Minghui86; 3: Minghui63; 4: Fuhui676; 5: Fuhui673; 6: Shuhui527.![]()
图 3 Wx基因片段的序列比对分析方框内为碱基差异位置。Figure 3. Sequence alignment on Wx gene fragmentPosition of base difference is showed in box.2.3 米质分析
表3中的米质分析结果显示，福恢676及其他4个恢复系的糙米率都大于81%，均达到一级米标准；福恢676的精米率为69%~74%。福恢676的整精米率只有种植于泉州的高于55%，达到一级米标准，但种植于3个地区的福恢676的整精米率均高于亲本明恢63与蜀恢527以及明恢86、福恢673，除了种植于福州的明恢86，其他的差异均达到显著水平。长、宽及长宽比方面，福恢676与其他恢复系相比较的情况与稻谷粒形分析情况类似。种植于泉州和三明的福恢676的垩白度均值分别为3.60%和3.67%，达到三级米标准；福恢676的垩白率和垩白度均高于亲本明恢63与蜀恢527，但均低于恢复系明恢86和福恢673，且绝大部分差异都达到显著水平。种植于泉州和三明的福恢676的透明度为2，达到二级米标准。福恢676的碱消值为4.3~4.6，而直链淀粉含量均处于标准规定一级米13%~18%的范围内。另外，福恢676及其他4个恢复系的胶稠度均大于60 mm，达到一级米标准。
表 3 米质分析Table 3. Analysis of grain quality种植地区Growing Areas 恢复系Restorer lines 糙米率Brown rice rate/% 精米率Milled rice rate/% 整精米率Head rice rate/% 长Length/mm 宽Width/mm 长宽比Length to width 垩白率Chalkiness ratio/% 垩白度Chalkiness degree/% 透明度Transparency 碱消值Alkali value 直链淀粉含量Amylose content/% 胶稠度Gel consistency/mm 福州Fuzhou 福恢676 Fuhui676 81.40±0.13 69.60±0.28 44.10±0.59 6.39±0.11 2.23±0.09 2.88±0.02 28.13±0.97 6.23±0.87 3.00±0.00 4.53±0.12 14.20±0.33 91.97±0.29 明恢63 Minghui63 81.80±0.26 69.80±0.96 38.27±1.06* 6.39±0.19 2.30±0.02 2.80±0.04* 18.83±1.30* 3.70±0.50* 3.00±0.00 4.30±0.10 11.97±0.31* 90.97±1.16 蜀恢527 Shuhui527 81.87±0.64 69.30±0.79 35.10±0.56* 6.95±0.25* 2.30±0.06 3.12±0.07* 16.87±0.38* 3.23±0.15* 2.00±0.00 4.43±0.06 12.47±0.12* 86.00±0.80* 明恢86 Minghui86 82.13±0.15* 68.37±0.50* 43.10±0.79 6.19±0.12* 2.32±0.09 2.70±0.06* 35.97±1.22* 9.93±0.38* 2.00±0.00 6.83±0.12* 13.50±0.17* 83.00±0.60* 福恢673 Fuhui673 82.23±0.15* 68.10±0.44* 41.60±0.90* 6.23±0.13 2.29±0.02 2.74±0.01* 49.57±1.76* 10.10±0.26* 3.00±0.00 4.27±0.15 12.17±0.12* 95.00±0.30* 泉州Quanzhou 福恢676 Fuhui676 81.80±0.15 71.23±0.31 55.43±0.90 6.71±0.15 2.27±0.07 2.98±0.07 16.30±0.82 3.60±0.46 2.00±0.00 4.33±0.21 15.40±0.53 88.00±0.61 明恢63 Minghui63 82.80±0.15* 71.37±0.51 40.60±0.30* 6.83±0.10 2.38±0.05 2.90±0.04 14.13±0.76* 2.57±0.31* 3.00±0.00 4.37±0.21 13.00±0.20* 90.03±0.06* 蜀恢527 Shuhui527 81.8±0.17 70.77±0.23 42.67±0.21* 7.23±0.21* 2.27±0.06 3.21±0.04* 11.60±0.61* 1.83±0.31* 2.00±0.00 4.30±0.26 14.23±0.38* 86.00±0.75* 明恢86 Minghui86 82.60±0.15* 70.63±0.15* 36.80±0.17* 6.62±0.15 2.40±0.04* 2.79±0.07* 38.63±0.49* 9.07±0.70* 2.00±0.00 6.47±0.29* 15.16±0.55 78.00±0.72* 福恢673 Fuhui673 81.70±0.20 70.60±0.20* 42.33±0.47* 6.83±0.25 2.34±0.07 2.94±0.05 50.93±3.23* 10.23±0.83* 3.00±0.00 4.20±0.10 13.57±0.21* 93.03±0.21* 三明Sanming 福恢676 Fuhui676 82.70±0.10 73.37±0.21 51.80±0.70 6.63±0.10 2.28±0.05 2.92±0.06 17.9±1.42 3.67±0.31 2.00±0.00 4.43±0.15 16.67±0.32 92.00±0.50 明恢63 Minghui63 81.90±0.06* 71.63±0.15* 44.30±0.44* 6.75±0.19 2.41±0.08 2.81±0.07 9.20±0.56* 1.73±0.49* 2.00±0.00 4.83±0.06* 16.17±0.15 86.03±0.74* 蜀恢527 Shuhui527 81.90±0.35* 72.10±0.40* 34.10±0.44* 7.23±0.21* 2.36±0.05 3.14±0.09* 12.80±2.26* 2.83±0.55 3.00±0.00 4.43±0.32 15.83±0.06* 91.97±1.25 明恢86 Minghui86 83.20±0.26* 74.07±0.23* 38.67±1.26* 6.32±0.12* 2.39±0.10 2.65±0.05* 18.30±1.87 5.43±0.25* 2.00±0.00 6.83±0.21* 16.07±0.51 81.97±0.64* 福恢673 Fuhui673 82.40±0.10* 71.03±0.21* 49.20±0.61* 6.48±0.07* 2.34±0.08 2.79±0.02* 29.73±0.80* 6.53±0.55* 3.00±0.00 4.33±0.25 14.43±0.31* 92.00±0.40 2.4 粒型及米制相关基因表达分析
进一步采用qRT-PCR分析了福恢676、明恢63、蜀恢527、明恢86及福恢673的稻谷灌浆4 d、7 d和11 d时控制粒形及米质相关基因的表达模式（图4、图5）。
2.4.1 粒形控制相关基因的表达分析
GL7是控制粒长和粒宽的主效基因。在福恢676中，灌浆7 d时GL7的表达略低于灌浆4 d时的表达，但变化不明显，而灌浆11 d时表达明显下降。在明恢63和福恢673中，GL7的表达在3个时期内随着灌浆时期的延长逐渐降低。在蜀恢527和明恢86中，GL7在灌浆4 d时表达量最高，灌浆7 d时明显降低，而灌浆11 d时表达又有所提高，尤其是在蜀恢527中。在福恢676和其他4个恢复系中，GL7均在灌浆4 d时表达量最高。
GS3是控制水稻粒重和粒长的主效基因，同时也是控制水稻粒宽和籽粒充实度的微效基因，在调节籽粒和器官大小中发挥负调节子的功能。在福恢676中，GS3的表达在灌浆7 d时比4 d时稍微提高，而灌浆11 d时表达急剧降低；在亲本明恢63和蜀恢527中，灌浆4 d和7 d时GS3的表达没有明显变化，而灌浆11 d时表达明显下降；在明恢86和福恢673中，GS3的表达在灌浆7 d时比4 d时明显降低，但灌浆11 d时又明显回升且明显高于福恢676及亲本明恢63和蜀恢527。另外，灌浆7 d时，福恢676中GS3的表达量均明显高于其他4个恢复系中的表达量。
GW8是同时控制谷粒大小、粒型和稻米品质的基因。在福恢676和明恢63中， GW8的表达先降低后升高，在福恢676中灌浆11 d时表达量最高，而在明恢63中灌浆4 d时表达量较高。在蜀恢527中，灌浆4 d和7 d时GW8的表达没有明显变化，而在灌浆11 d有所提高。在明恢86和福恢673中，GW8的表达量在灌浆4 d时最高，灌浆7 d时急剧下降，灌浆11 d时又稍回升。
SGL调控水稻种子长度。在福恢676和蜀恢527中，SGL的表达先提高后降低，且在灌浆7 d时表达量较高，福恢676中灌浆11 d时SGL的表达急剧降低。在明恢63和明恢86中，SGL的表达逐渐提高，在灌浆11 d时表达量最高。在福恢673中，SGL的表达先降低后升高，且在灌浆11 d时表达量最高。灌浆11 d 时，福恢676中SGL的表达量明显低于其他4个恢复系中的表达量。
GIF1是控制籽粒充实度相关的基因。在福恢676和明恢63中，GIF1的表达先升高后降低，且在灌浆7 d时表达量最高。在蜀恢527、明恢86和福恢673中，灌浆4 d、7 d和11 d的 GIF1表达量逐渐降低，尤其是在福恢673中降低明显。
2.4.2 米质控制相关基因的表达分析
Chalk5是影响水稻籽粒垩白的形成和精米率等的基因。在福恢676和明恢63中，Chalk5的表达量在灌浆7 d时较4 d时升高，而在灌浆11 d时几乎不表达。在蜀恢527中，Chalk5的表达量逐渐降低，在灌浆11 d时表达量极低。明恢86和福恢673中，Chalk5的表达量逐渐降低，在福恢673中降低明显，但在灌浆11 d时仍有少量表达。
ALK控制稻米的糊化温度，并与垩白、直链淀粉含量等相关。ALK的表达模式在福恢676中与在其他4个恢复系中不同，在福恢676中ALK的表达先升高后降低，且在灌浆7 d时表达量最高。在明恢63、蜀恢527和明恢86中，ALK的表达逐渐上升，且在灌浆11 d时表达量较高。在福恢673中，灌浆7 d时ALK的表达稍低于4 d时的表达但变化不明显，而在灌浆11 d时表达量明显提高。灌浆11 d时，福恢676中ALK 的表达量明显低于其他4个恢复系中的表达量。
OsSSI影响水稻籽粒中支链淀粉的结构，从而影响稻米的糊化温度。OsSSI的表达模式在福恢676中与在其他4个恢复系中完全不同，在福恢676中OsSSI的表达先升高后降低，且在灌浆7 d时表达量最高；而在明恢63、蜀恢527、明恢86和福恢673中，OsSSI的表达逐渐上升，且在灌浆11 d时表达量最高。灌浆11 d时，福恢676中OsSSI的表达量明显低于其他4个恢复系中的表达量。
OsBEIIb影响水稻胚乳中淀粉的结构，并与垩白等性状相关。OsBEIIb的表达模式在福恢676中与在其他4个恢复系中也完全不同，在福恢676中OsBEIIb的表达先升高后降低，且在灌浆7 d时表达量最高；而在其他4个恢复系中，OsBEIIb的表达逐渐提高，且在灌浆11 d时表达量最高。灌浆11 d时，福恢676中OsBEIIb的表达量明显低于其他4个恢复系中的表达量。
3. 讨论
粒形是影响水稻产量和稻米品质的重要因素之一，已成为水稻高产优质分子设计育种的重要靶标性状[7, 26]。福恢676的亲本之一蜀恢527是重穗型籼稻恢复系[27]，长粒，长宽比大。本研究分析显示，福恢676的谷粒长和长宽比也均大于亲本明恢63及生产上常用的其他两个恢复系明恢86和福恢673；同时福恢676的千粒重也大于明恢63、明恢86和福恢673，极大可能是受到了蜀恢527的遗传因素影响。
如今，水稻育种在注重提高产量的同时也越来越重视稻米品质的提升。稻米品质包括加工品质、外观品质和蒸煮品质，加工品质主要包括糙米率、精米率、整精米率，外观品质主要包括粒形、透明度、垩白粒率、垩白度等，蒸煮品质主要括糊化温度、直链淀粉含量、胶稠度等。本研究结果表明福恢676及其余4个恢复系都具有较高的糙米率，均达81% 以上。值得特别注意的是，种植于3个不同地区的福恢676的整精米率均高于蜀恢527、明恢63、明恢86和福恢673；周勇等[15]研究表明提高恢复系整精米率是突破杂交水稻整精米率偏低的关键。福恢676具较高的整精米率，值得进一步研究分析和应用。福恢676的垩白度和垩白率均高于亲本明恢63和蜀恢527，某种程度上说明相关遗传调控方面较为复杂；同时，种植于泉州和三明的福恢676的垩白度和垩白率较种植于福州的低，相应的透明度也较低，说明这些指标在一定程度上受到了环境的影响。直链淀粉含量是优质米的重要标准，相关研究表明在非糯品种中Wx的基因型籼稻以Wxa 为主，粳稻基本为Wxb；本研究中籼型恢复系福恢676的Wx基因型与亲本蜀恢527和明恢63的一致，均为Wxb，是因为它们具有粳稻亲缘成分。种植于3个不同地区的福恢676的直链淀粉含量均处于标准规定一级米范围内（13%~18%），即与具有较低直链淀粉含量的基因型Wxb一致。
稻谷粒形及稻米品质均受相关基因的调控。相关研究表明GL7的表达量提高会促进细胞的延长[10]。本研究qRT-PCR分析表明GL7在福恢676和其他4个恢复系中均在灌浆4 d时表达量最高，说明GL7很可能在灌浆前期发挥较重要的作用。 GS3对籽粒大小和重量起负调控作用[11]，在灌浆11 d 时GS3在福恢676及其亲本明恢63、蜀恢527中表达水平较低，但在明恢86和福恢673中表达水平较高，尤其是在明恢86中表达水平最高；稻谷粒形分析显示与福恢676及其亲本明恢63、蜀恢527相比，3个种植地区的明恢86和福恢673的谷粒均较短，其中明恢86的谷粒最短，在千粒重方面，除种植于泉州的福恢673外，明恢86和福恢673的千粒重也均较低；因此，本研究中稻谷粒长与千粒重的表型分析结果与GS3的表达水平一致。GIF1控制灌浆并与籽粒的充实度有关[14]。本研究分析显示灌浆11 d时GIF1的表达量在5个恢复系中均明显降低，应该是由于11 d时已经是灌浆后期，因此基因表达也相应发生了变化。另外，福恢676的控制米质相关基因ALK、OsSSI、OsBEIIb的表达模式均与其他4个恢复系的完全不同，很可能是引起整精米率等有差异的原因。但关于相关基因如何调控影响福恢676的粒形和米质尤其是粒长和整精米率等方面有待进一步的分析和研究。
4. 结论
本研究分析表明恢复系福恢676的粒长较长，长宽比相对较大，整精米率较高，糙米率、胶稠度和直链淀粉含量达到一级米标准；Wx的基因型为Wxb，福恢676中控制粒形基因GL7、GS3和控制米质基因ALK 、 OsSSI、OsBEIIb的表达模式与其他恢复系中有明显不同，为福恢676应用于育种生产及解析其杂交后代的遗传基础方面提供理论依据。
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图 1 引物826对24份茶树DNA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果
注：M为Marker，1~24：表示1~24号供试样品。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of amplified products from 24 cultivars using primer 826
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图 2 基于Jaccard相似系数的24份茶树品种(系)的聚类
Figure 2. Dendrograms of 24 tea cultivars based on Jaccard similarity coefficient
表 1 供试品种(系)及其亲本来源和采样地点
Table 1 Locations and origins of tea cultivars used for experimentation
序号/编号 品种(系)名称 亲本/来源 采集地点 1 黄观音(茗科2号) 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 2 黄玫瑰 黄观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 3 铁观音 - 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 4 凤圆春 铁观音自然杂交后代 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 5 白芽奇兰 - 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 6 悦茗香 赤叶观音 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 7 金观音(茗科1号) 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 8 品系1 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 9 紫玫瑰 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 10 品系2 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 11 瑞香 黄棪自然杂交后代 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 12 金牡丹 铁观音×黄棪 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 13 铁观音1 - 安溪县虎邱镇湖西村 14 铁观音2 - 安溪县芦田镇福岭村 15 铁观音3 - 安溪县西坪镇松岩村 16 铁观音4 - 三明市大田县吴山镇 17 铁观音5 - 安溪茶叶科学研究所种质资源圃 18 铁观音6 - 安溪县虎邱镇茶树良种繁育基地 19 铁观音7 - 安溪县芦田镇芦田村 20 铁观音8 - 三明市大田县屏山乡 21 铁观音9 - 安溪县芦田镇招坑村 22 春兰 铁观音自然杂交后代 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 23 黄奇 黄棪×白芽奇兰 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 24 黄棪 - 福建省农业科学院茶叶研究所种质资源圃 
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表 2 9条ISSR引物的扩增多态性
Table 2 Amplification polymorphism of 9 ISSR primers
引物 退火温度/℃ 扩增条带数 多态性条带数 多态性百分率/% UBC-811 52.59 6 3 50.0 UBC-815 49.85 8 3 37.5 UBC-826 52.59 7 5 71.4 UBC-835 54.16 7 5 71.4 UBC-841 54.16 7 3 42.7 UBC-845 54.16 12 10 83.5 UBC-853 53.90 9 6 66.7 UBC-857 54.16 10 6 60.0 UBC-880 53.60 7 6 85.7 合计 - 73 47 - 平均 - 8.1 5.2 64.4
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表 3 24份茶树品种(系)的Jaccard遗传相似系数
Table 3 Jaccard genetic similarity coefficients of 24 tea cultivars
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 1.000 0.714 0.712 0.623 0.755 0.750 0.712 0.741 0.720 0.800 0.691 0.638 0.796 0.673 0.673 0.731 0.731 0.722 0.731 0.679 0.610 0.755 0.661 0.706 2 0.714 1.000 0.745 0.623 0.686 0.714 0.648 0.741 0.720 0.636 0.755 0.667 0.725 0.673 0.673 0.765 0.667 0.632 0.731 0.709 0.638 0.691 0.661 0.776 3 0.712 0.745 1.000 0.655 0.750 0.712 0.709 0.678 0.750 0.638 0.661 0.667 0.788 0.796 0.830 0.863 0.727 0.719 0.863 0.833 0.786 0.782 0.717 0.769 4 0.623 0.623 0.655 1.000 0.725 0.593 0.596 0.655 0.544 0.673 0.638 0.617 0.698 0.621 0.679 0.673 0.673 0.667 0.643 0.714 0.617 0.667 0.563 0.648 5 0.755 0.686 0.750 0.725 1.000 0.720 0.750 0.714 0.660 0.769 0.696 0.644 0.765 0.709 0.679 0.704 0.736 0.727 0.736 0.714 0.702 0.727 0.639 0.679 6 0.750 0.714 0.712 0.593 0.720 1.000 0.712 0.709 0.686 0.698 0.661 0.667 0.692 0.673 0.614 0.667 0.698 0.661 0.667 0.621 0.638 0.691 0.661 0.706 7 0.712 0.648 0.709 0.596 0.750 0.712 1.000 0.737 0.655 0.667 0.607 0.695 0.722 0.702 0.672 0.696 0.696 0.719 0.667 0.650 0.695 0.690 0.717 0.614 8 0.741 0.741 0.678 0.655 0.714 0.709 0.737 1.000 0.714 0.754 0.776 0.667 0.719 0.672 0.672 0.724 0.754 0.661 0.667 0.677 0.667 0.746 0.714 0.702 9 0.720 0.720 0.750 0.544 0.660 0.686 0.655 0.714 1.000 0.704 0.727 0.590 0.667 0.709 0.709 0.736 0.704 0.638 0.704 0.684 0.672 0.759 0.724 0.712 10 0.800 0.636 0.638 0.673 0.769 0.698 0.667 0.754 0.704 1.000 0.707 0.578 0.679 0.633 0.633 0.627 0.655 0.678 0.627 0.667 0.578 0.737 0.600 0.632 11 0.691 0.755 0.661 0.638 0.696 0.661 0.607 0.776 0.727 0.707 1.000 0.677 0.702 0.712 0.683 0.707 0.737 0.672 0.707 0.717 0.705 0.700 0.754 0.745 12 0.638 0.667 0.667 0.617 0.644 0.667 0.695 0.667 0.590 0.578 0.677 1.000 0.768 0.776 0.689 0.683 0.712 0.793 0.712 0.694 0.738 0.705 0.677 0.690 13 0.796 0.725 0.788 0.698 0.765 0.692 0.722 0.719 0.667 0.679 0.702 0.768 1.000 0.846 0.811 0.774 0.741 0.796 0.808 0.815 0.707 0.764 0.700 0.717 14 0.673 0.673 0.796 0.621 0.709 0.673 0.702 0.672 0.709 0.633 0.712 0.776 0.846 1.000 0.887 0.815 0.815 0.804 0.849 0.821 0.776 0.772 0.767 0.727 15 0.673 0.673 0.830 0.679 0.679 0.614 0.672 0.672 0.709 0.633 0.683 0.689 0.811 0.887 1.000 0.849 0.782 0.772 0.849 0.889 0.746 0.772 0.738 0.696 16 0.731 0.765 0.863 0.673 0.704 0.667 0.696 0.724 0.736 0.627 0.707 0.683 0.774 0.815 0.849 1.000 0.811 0.768 0.882 0.818 0.741 0.768 0.763 0.788 17 0.731 0.667 0.727 0.673 0.736 0.698 0.696 0.754 0.704 0.655 0.737 0.712 0.741 0.815 0.782 0.811 1.000 0.800 0.846 0.754 0.741 0.800 0.793 0.788 18 0.722 0.632 0.719 0.667 0.727 0.661 0.719 0.661 0.638 0.678 0.672 0.793 0.796 0.804 0.772 0.768 0.800 1.000 0.833 0.776 0.733 0.789 0.698 0.684 19 0.731 0.731 0.863 0.643 0.736 0.667 0.667 0.667 0.704 0.627 0.707 0.712 0.808 0.849 0.849 0.882 0.846 0.833 1.000 0.887 0.804 0.800 0.733 0.755 20 0.679 0.709 0.833 0.714 0.714 0.621 0.650 0.677 0.684 0.667 0.717 0.694 0.815 0.821 0.889 0.818 0.754 0.776 0.887 1.000 0.810 0.776 0.714 0.702 21 0.610 0.638 0.786 0.617 0.702 0.638 0.695 0.667 0.672 0.578 0.705 0.738 0.707 0.776 0.746 0.741 0.741 0.733 0.804 0.810 1.000 0.705 0.758 0.690 22 0.755 0.691 0.782 0.667 0.727 0.691 0.690 0.746 0.759 0.737 0.700 0.705 0.764 0.772 0.772 0.768 0.800 0.789 0.800 0.776 0.705 1.000 0.726 0.778 23 0.661 0.661 0.717 0.563 0.639 0.661 0.717 0.714 0.724 0.600 0.754 0.677 0.700 0.767 0.738 0.763 0.793 0.698 0.733 0.714 0.758 0.726 1.000 0.712 24 0.706 0.776 0.769 0.648 0.679 0.706 0.614 0.702 0.712 0.632 0.745 0.690 0.717 0.727 0.696 0.788 0.788 0.684 0.755 0.702 0.690 0.778 0.712 1.000
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[1] 叶乃兴.我国茶树育种的骨干亲本及其系谱分析[J].中国茶叶, 2008, 4:11-13. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CAYA200804010.htm [2] 杨美寅, 李文东, 董方平, 等.湿地松半同胞家系净光合速率日变异规律研究[J].中国农学通报, 2008, 24(8):171-176. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZNTB200808037.htm [3] 韩创举, 杨培华, 刘永红, 等.油松半胞系家系苗期生长性状遗传分析[J].西北农林科技大学学报:自然科学版, 2008, 36(5):124-134. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-XBNY200805022.htm [4] 莫亚文.刺槐优树半同胞子代测定研究[J].甘肃林业科技, 2007, 32(3):29-32. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GSLK200703007.htm [5] 孙明高, 赵玉涛, 宋绪忠, 等.银杏半同胞家系综合评价与苗期选择的研究[J].山东农业大学学报:自然科学版, 2001, 32(4):518-524. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SCHO200104023.htm [6] 余继忠.福鼎大白茶半同胞系和云南大叶茶半同胞系遗传多样性和亲缘关系研究[D].北京:中国农业科学院, 2010. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-82101-2010171383.htm [7] 余继忠, 杨亚军, 黄海涛, 等.利用ISSR标记分析福云(半)同胞系茶树品种(系)的遗传多样性和亲缘关系[J].基因组学与应用生物学, 2009, 28(2):281-288. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-GXNB200902017.htm [8] 陈志辉, 单睿阳, 林郑和, 等.利用SSR标记分析福建省选育福云半同胞系茶树品种遗传多样性[J].茶叶学报, 2015, 56(4):238-243. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CYKJ201504008.htm [9] 段云裳, 姜燕华, 王丽鸳, 等.我国茶树主要骨干亲本及其衍生品种(系)的SSR分析[J].植物遗传资源学报, 2011, 12(4):533-538. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZWYC201104009.htm [10] 王让剑, 杨军, 孔祥瑞, 等.福建15个茶树品种SSR遗传差异分析与指纹图谱建立[J].福建农业学报, 2014, 29(10):970-975. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FJNX201410008.htm [11] ZIETKIEWICZ E, RAFALSKI A, and LABUDA D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction, amplification, Genomics, 1994, 20(2):176-183. DOI: 10.1006/geno.1994.1151
[12] REDDY M P, SARLA N, SIDDIQ E A.Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding[J].Euphytica, 2002, 128(1):9-17. DOI: 10.1023/A:1020691618797
[13] 姚明哲, 黄海涛, 余继忠, 等. ISSR在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析[J].茶叶科学, 2005, 25(2):153-157. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CYKK200502013.htm [14] 林郑和, 陈荣冰, 陈常颂, 等.ISSR分子标记在茶树遗传关系分析中的初步应用[J].茶叶科学, 2007, 27(1):45-50. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CYKK200701007.htm [15] 唐玉海, 郭春芳, 张木清, 等.ISSR标记在茶树品种遗传多态性研究中的应用[J].福建农林大学学报:自然科学版, 2007, 36(1):51-55. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FJND200701011.htm [16] 黄建安, 黄意欢, 罗军武, 等.茶树基因组DNA的高效提取方法[J].湖南农业大学学报:自然科学版, 2003, 29(5):402-407. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-HNND200305011.htm [17] 詹梓金, 李宗恒, 徐飚, 等.保护铁观音原种保持优异品质--论铁观音品种提纯复壮[J].茶叶科学技术, 2006, (2):20. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CYKJ200602007.htm [18] 詹梓金, 林锻炼, 陈磊.安溪铁观音品种复壮内涵与防止退化对策[J].福建茶叶, 2009, (1):12-13. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FJCA200901007.htm [19] 景润春, 何予卿, 黄青阳, 等.水稻野败型细胞质雄性不育恢复基因的ISSR和SSLP标记分析[J].中国农业科学, 2000, 33(2):1-9. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZNYK200002001.htm [20] KAUNDUN S S, ZHYVOLOUP A, PARK Y G.Evaluation of the genetic diversity among elite tea (Camellia sinensis var.sinensis) accessions using RAPD markers[J].Euphytica, 2000, 115:7-16. DOI: 10.1023/A:1003939120048
[21] PARK Y G, SHIV S K.Genetic variation on wild tea populations in Korea[M]//Liang Y R, Liu Z S, Park Y G, et al.Proceedings of the International Symposium on Molecular Biology and TeaBreeding.Hangzhou:Zhejiang University, 2000:1-18.
[22] WACHIRA F N, WAUGH R, HACKETT C A, et al.Detection of genetic diversity in tea (Camellia sinensis) using RAPD markers[J].Genome, 1995, 38:201-210. DOI: 10.1139/g95-025
[23] MIRSHRA R K, SEN-MANDI S.Genetic diversity estimates for Darjeeling tea clones based on amplified fragment length polymorphism markers[J].J Tea Sci, 2004, 24(2):86-92. http://en.cnki.com.cn/Article_en/CJFDTOTAL-CYKK200402002.htm
[24] 刘本英, 孙雪梅, 李友勇, 等.基于EST-SSR标记的云南无性系茶树良种遗传多样性分析及指纹图谱构建[J].茶叶科学, 2012, 32(3):261-268. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CYKK201203012.htm [25] 杨亚军, 梁月荣.中国无性系茶树品种志[M].上海:上海科学技术出版社, 2014:111, 146. -
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1. 赵培栋，舒添，刘沛，张振乾，杨柳. 油菜未成熟种子含水量近红外快速测定方法. 作物研究. 2025(01): 81-87 . 
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