丝瓜Luffacylindrica原产东印度，主要分布于热带、亚热带的亚洲各地，有普通丝瓜Luffa cylindrica Roem和有棱丝瓜Luffa acutangula Roxb 2个栽培种，在我国南北均有栽培，是我国主要的瓜类蔬菜^[1]。丝瓜营养丰富，且具有很好的医疗保健功能，随着人们对饮食营养保健的日益重视，丝瓜作为一种药食兼用的高温季节市场供应的蔬菜和保健蔬菜，其需求量不断增大，栽培面积日益扩大，蕴含着巨大的市场前景，但丝瓜果肉及汤汁出现褐变，大大降低了果蔬的贮藏加工性能，严重影响丝瓜产品的商品价值，造成巨大经济损失，因此成为丝瓜育种和采后的研究热点。

酚类物质是植物体内重要的次生代谢产物，主要存在于细胞液泡内^[2-3]，是苹果^[4]、梨^[5]、荔枝^[6]、莲藕^[7]等果蔬酶促褐变的底物，导致品质下降，降低园艺产品经济效益^[8-9]。本试验采用超声波辅助提取和福林-酚比色法研究丝瓜总酚的提取和测定方法，为今后丝瓜酶促褐变机理研究及丝瓜新品种选育奠定理论基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   试验丝瓜品种

本试验供试丝瓜品种(系)‘黑12'由福建省农业科学院作物研究所蔬菜中心提供。用双蒸水进行清洗，晾干，快速削皮后分装于保鲜袋中，液氮速冻后置于-80℃冰箱中储存备用。

1.1.2   试验试剂

福林-酚购自美国Signa公司；甲醇(CH₃OH)、丙酮(CH₃COCH₃)、乙醇(C₂H₆O)、碳酸钠(Na₂CO₃)、没食子酸(C₇H₆0₅)等为国产分析纯(广通贸易化学试剂有限公司)。

没食子酸溶液配制：称取 0.11 g没食子酸，用双蒸水溶解定容至1 000.0 mL，得到浓度为 100 μg·mL^-1的没食子酸标准溶液。

1.1.3   试验仪器

DK-8D电热恒温水槽(上海-恒科学仪器有限公司)、BILON-96超声波细胞粉碎机(成都比郎实验设备有限公司)、UV1000紫外可见分光光度计(天美科学仪器有限公司)、AR224CN电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司)、CR22N冷冻高速离心机(北京顺心万昌科技发展有限公司)。

1.2   试验方法

1.2.1   超声辅助提取丝瓜总酚工艺优化

(1) 不同提取剂的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，分别加入60%的乙醇、甲醇、丙酮，料液比1∶8，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(2) 不同乙醇浓度的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，分别加入50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，料液比1∶8，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min^-1 离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(3) 不同液料比的选择

精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比分别为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，冰浴下研磨至匀浆，于40℃、300 W下超声辅助提取20 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min^-1 离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(4) 不同超声时间的选择

精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至匀浆，超声时间分别为10、20、30、40、50、60 min，40℃、300 W下超声辅助提取，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min^-1 离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

(5) 不同超声温度的选择：精确称取丝瓜果肉样品3.000 g，加入80%乙醇，料液比1∶10，冰浴下研磨至匀浆，超声温度分别为25、40、60℃，300 W下超声辅助提取30 min，提取1次，提取液于4℃ 10 000 r·min^-1离心10 min，收集上清液定容至25 mL待测。

1.2.2   福林-酚比色法测定丝瓜总酚含量的优化

(1) 测量波长的选择：移取没食子酸溶液(100 μg·mL^-1)1 mL于25 mL试管中，加入5 mL的蒸馏水，再加入1 mL的福林-酚比色剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1的Na₂CO₃溶液2 mL，用双蒸水定容至25 mL，于室温下避光反应1 h后，在500～900 nm的波长范围内扫描。

(2) 试剂体积的选择：①Na₂CO₃体积的确定：移取没食子酸溶液7份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1 mL的福林-酚比色剂，混匀静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1的Na₂CO₃溶液各1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，用双蒸水定容至25 mL，在室温下避光反应1 h后，待反应液显色后于750 nm波长处测定OD值，确定最大OD值所对应的Na₂CO₃体积； ②福林-酚体积的确定：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，再分别加入0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1的Na₂CO₃溶液3 mL，加蒸馏水定容至25 mL，于室温下避光反应1 h后，待反应液显色后于750 nm波长处测定OD值，以确定福林-酚的体积。

(3) 测定时间的选择：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1.5 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液的3 mL，用双蒸馏水定容至25 mL，在室温下分别避光反应10、20、30、40、50、60、90、120 min后，于750 nm波长处测定OD值，确定最佳测定时间。

(4) 测定温度的选择：取没食子酸溶液5份各1 mL，加5 mL蒸馏水，加入1.5 mL福林-酚试剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1 Na₂CO₃溶液的3 mL，用双蒸馏水定容至25 mL，分别在10、20、30、40、50、60℃下避光反应1 h后，显色后于波长750 nm处测定吸光度值，确定适宜的反应温度。

(5) 标准曲线的绘制：移取0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 mL的没食子酸标准液于25 mL试管中，加入5 mL的蒸馏水，再加入1.5 mL的福林-酚比色剂，混匀后静置4～5 min，再加入0.5 mol·L^-1的Na₂CO₃溶液3 mL，加蒸馏水定容至25 mL，在室温下避光反应1 h后。显色后在750 nm波长处测定OD值，以吸光值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

以上试验方法均重复3次。

1.3   数据处理与分析

运用Excel 2003进行数据整理和作图。

2.   结果与分析

2.1   超声辅助提取丝瓜总酚工艺优化

2.1.1   不同提取剂对丝瓜总酚提取效果的影响

由图 1可知，提取剂不同，总酚的提取效果也不同。其中，乙醇的吸光值最高，丙酮次之，甲醇最小。提取液对总酚物质的显色反应较大，其吸光值也越大，说明丝瓜总酚提取效果越好；同时，考虑到甲醇和丙醇的毒性及价格均高于乙醇，因此，选择乙醇作为丝瓜果肉总酚的提取剂。

图  1  不同提取剂对总酚提取效果的影响

Figure  1.  Effect of solvents on polyphenol extraction from luffa

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.1.2   不同提取剂浓度对丝瓜总酚提取效果的影响

由图 2可知，随着乙醇浓度的增大，丝瓜提取液的吸光度在50%～80%的浓度范围内呈上升趋势，在80%时其吸光值最高；而后随着乙醇浓度升高，其吸光值呈现下降趋势，下降幅度明显。提取剂浓度为80%时吸光值最高，说明丝瓜总酚的提取效果较好，因此，选择80%的乙醇为丝瓜果肉总酚提取剂浓度。

图  2  不同乙醇浓度对总酚提取效果的影响

Figure  2.  Effect of ethanol concentration on polyphenol extraction from luffa

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.1.3   不同液料比对丝瓜总酚提取效果的影响

由图 3 可知，总酚提取液随着液料比的变化而变化。当料液比为1∶10时，丝瓜的总酚提取液基本上达到饱和，而后随着料液比的升高而下降。当吸光值越高，说明总酚提取越完全。当液料比为1∶12总酚提取量呈现下降趋势，表明液料比为1∶10时，丝瓜总酚提取效果较为充分。

图  3  液料比对总酚提取效果的影响

Figure  3.  Effect of sample to solvent ratio on polyphenol extraction from luffa

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.1.4   超声时间对丝瓜总酚提取效果的影响

由图 4所示，随着超声波时间的增加，总酚的吸光值呈现先上升后下降的趋势，在30 min中达到峰值，之后逐渐呈下降趋势。表明超声时间在30 min时，丝瓜总酚提取效果较好。

图  4  超声时间对丝瓜总酚提取效果的影响

Figure  4.  Effect of ultrasonic mixing time on polyphenol extraction from luffa

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.1.5   超声温度对丝瓜总酚提取效果的影响

由图 5所示，随着超声波温度的增加，总酚的吸光值升高，其吸光值在40℃时达到峰值，在60℃时吸光值下降。表明超声温度在40℃时，丝瓜总酚提取效果较好。

图  5  温度对丝瓜总酚提取效果的影响

Figure  5.  Effect of temperature on polyphenol extraction from luffa

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   福林-酚比色法测定丝瓜总酚含量的优化

2.2.1   最佳波长的确定

将没食子酸标准溶液置于波长500～900 nm范围内进行扫描，没食子酸标准溶液在波长750 nm达到最大值。吸光值越大，没食子酸溶液反应越完全，因此，选用750 nm作为本次丝瓜总酚含量测定的最适吸收波长。

2.2.2   最佳试剂体积的确定

由图 6可知，总酚物质的显色效果随着Na₂CO₃体积的增加越来越明显，Na₂CO₃体积为1～3 mL时，吸光度呈现上升趋势，其对总酚物质显色效果越来越好；当Na₂CO₃体积达到3 mL时，吸光度达到最大值，对总酚物质的显色效果最好；但 Na₂CO₃体积超过3 mL时，其OD值不再明显增加，基本保持稳定；说明Na₂CO₃体积不足会导致总酚物质显色不完全。当Na₂CO₃的最佳体积为3 mL时吸光度值最大，反应也最明显，因此，表明Na₂CO₃的最佳体积为3 mL。

图  6  Na₂CO₃体积对没食子酸标准溶液的影响

Figure  6.  Effect of volume of Na₂CO₃ solution on reaction with standard gallic acid solution

下载: 全尺寸图片 幻灯片

由图 7所示，随着福林-酚体积的增加，吸光值也相应增加，总酚物质的显色效果也越好。当福林-酚体积为1.5 mL时，吸光值达最大，反应最完全。当福林-酚体积过低(0.25 mL)或过高(2 mL)时，对显色反应均产生抑制作用，降低其吸光值。因此，确定最佳福林-酚体积为1.5 mL。

图  7  福林-酚体积对没食子酸标准溶液的影响

Figure  7.  Effect of amount of Folin-Ciocalteu reagent on reaction with standard gallic acid solution

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2.3   最佳反应时间的确定

由图 8可知，随着反应时间的增加，总酚物质的吸光值也相应增加，在前10 min吸光度值最小，反应效果不显著；在60 min时吸光值达到最大，反应最完全，显色反应明显；在60 min之后吸光值呈现下降趋势，变化幅度较小，显色反应不明显。因此，最佳反应时间为60 min。

图  8  显色时间对样品显色效果的影响

Figure  8.  Effect of time on reaction between gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2.4   最佳反应温度的确定

由图 9可知，总酚的显色反应受温度的影响。随着反应温度(10～60℃)的增加，其反应产物的吸光值呈增长趋势，其中在30℃时吸光值达到最大值，之后随着反应时间的延长，其吸光值呈下降的趋势。说明当超过一定温度时，总酚的稳定性较差，反应产物在高温下易被分解。因此，选择30℃作为本次丝瓜总酚测定的最佳温度。

图  9  不同温度对样品的显色反应

Figure  9.  Effect of temperature on reaction between gallic acid and Folin-Ciocalteu reagent

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2.5   标准曲线的建立

由图 10所示，将测定结果进行线性回归，结果得出吸光度与没食子酸标准溶液之间的关系方程式为Y=0.6279X+0.0273，R²=0.994 7，相关系数为0.994 7，说明在1～6 μg·mL^-1有较好的线性关系。

图  10  没食子酸标准曲线

Figure  10.  Standard curve of gallic acid solution

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论与结论

本试验以‘黑12'丝瓜品种(系)为试材，利用超声波提取方法^[10-11]，对丝瓜总酚提取的提取剂、乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度等影响因子进行优化，利用福林酚比色法^[12-13]，对丝瓜总酚测定的测量波长、试剂体积、测定时间、 测定温度等影响因子进行优化，获得了总酚提取和测定的反应体系：(1)提取优化结果：乙醇浓度为80%，液料比1∶10，超声波温度40℃，超声时间30 min；(2)测定优化结果：测定波长750 nm，反应时间60 min，反应温度30℃，0.5 mol·L^-1 Na₂CO₃体积3 mL，0.5 mol·L^-1福林-酚体积1.5 mL。总酚含量与吸光度呈良好的线性关系: Y=0.6279 X+ 0.0273(R²= 0.994 7)。本研究建立的丝瓜总酚提取和测定方法具有稳定性好、精密度高、操作简便、省时、不受蛋白质的干扰等优点，为丝瓜中总酚含量的研究提供技术支持，为后期抗褐变丝瓜品种选育研究提供了理论依据。

超声波辅助提取总酚效果好，具有回收率高、损耗小等优势，已在果蔬总酚中广泛应用^[14-20]。本试验以‘黑12'丝瓜果肉鲜果为试材，利用超声波辅助提取丝瓜总酚提取液，提取效果较好。由于总酚含有某些羟基类物质，可与蛋白质和多糖等物质结合，形成稳定的化合物，因此选择丙酮、甲醇、乙醇作为丝瓜总酚提取剂^[21]。通过上述有机溶剂提取总酚效果来看，乙醇效果最佳，所以选用乙醇作为总酚提取剂。何志勇^[22]通过对橄榄总酚的提取比较，因丙酮具有剧毒，故选择乙醇；同时乙醇提取工艺简单，成本低且提取率高，故选择乙醇作为提取溶剂。超声时间与温度是提取果蔬总酚过程中重要的影响因素，本试验得出丝瓜总酚最佳超声波时间与温度分别为30 min和40℃。若超声波时间过短或者温度过低，丝瓜总酚提取效果也低，时间过长或者温度过高，则会破坏丝瓜总酚物质。因此，超声提取丝瓜总酚温度和时间不宜过长。

目前，总酚含量的测定方法有多种，如纸层析、薄层层析、气液色谱、高效液相色谱、福林-酚法等多种方法。其中纸层析、薄层层析在分离效果、速度和准确定量方面存在缺陷; 气液色谱用于植物酚类物质的分离测定速度快、灵敏度高，但该法需要衍生化处理，前处理比较麻烦; 而高效液相色谱法比较昂贵,不适于大量的定量分析^[23]。福林-酚比色法反应原理为酚类化合物在碱性条件下可将钨钼酸还原，生成蓝色的化合物，颜色的深浅与酚含量呈正相关，结果精确稳定，且具有操作方便、所用试剂价格低廉、适用于批量检测等优点，在植物总酚含量测定中应用广泛。本试验利用福林-酚法进行丝瓜总酚含量的测定，探索出基层实验室简单、快速、准确测定丝瓜总酚的有效方法。在不同的研究文献^[24-25]中，比色条件选择差异较大，且不同的提取和测定条件下其测定结果也有所不同；测定最佳波长在650～760 nm，反应温度为20～60℃，反应时间在30～120 min等比色条件范围。本试验的结果与相关果蔬的总酚研究结果相同或者相近，但其反应体系的变化均在总酚反应的合适范围内。如黄树苹等^[26]通过福林-酚法测定丝瓜总酚的波长为770 nm，而本试验的最佳波长为750 nm。严娟等^[27]利用福林-酚法对桃总酚进行测定，测定波长为765 nm。张立新等^[28]研究认为，测定总酚的反应体系存在一定的差异，其原因可能与品种和产地有关，因为同一果蔬，若品种不同，或种植在不同地区，其化学成分也会存在较大的差异。