随着生物酶制业的发展，酶法辅助提取已成为食用菌的提取的辅助技术，其操作条件温和、环境无污染、能耗小。灵芝Ganoderma lucidum属于高等真菌，其活性物质大多存在于子实体的细胞壁中，与几丁质形成的复合物是细胞壁内层的主要结构，同时也与细胞壁外的半纤维素等大分子形成了紧密的结合^[1]。研究表明利用酶法提取有助于细胞壁溶解，释放生物活性物质^[2-4]。

黄酮类化合物是一种存在于植物中的天然产物，属于天然多酚类结构，可以清除人体内超氧离子自由基，具有较强的抗氧化作用^[5-6]。黄酮类化合物广泛存在于植物的各部位，主要有三黄酮糖苷和苷元两大形式，其中包括黄酮、异黄酮、双黄酮、黄烷酮、黄酮醇、查尔酮等及其苷类，具有极广泛的生物活性特性^[7-9]。

国内外对灵芝的黄酮类化合物的研究还比较少^[10]，本研究对复合酶法提取灵芝黄酮的工艺条件进行优化同时对其抗氧化活性进行探讨，以期为提高黄酮得率和开发天然抗氧化剂奠定理论基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

椴木灵芝：购于古田县小木食用菌经营部。

1.2   仪器及试剂

1.2.1   化学试剂

芦丁、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、抗坏血酸、TCA等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶，购于江苏锐阳生物科技有限公司。1，1-二苯基-2-三肼 (DPPH)、三羟甲基氨基甲烷 (Tris碱)，购于Sigma公司。

1.2.2   主要仪器与设备

数显三用水浴锅HH-3A，金坛市精达仪器制造厂；低速离心机SC-3612，科大创新股份有限公司；循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ，郑州长城科技工贸有限公司；旋转蒸发仪R系列，上海申生科技有限公司；紫外可见分光光度计7200，上海精密科学仪器有限公司；FZ102型微型植物粉碎器，天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3   试验方法

1.3.1   复合酶提取

灵芝子实体烘干并粉碎，过20目筛后加入一定pH值的缓冲液 (醋酸-醋酸钠缓冲液pH值为4.0~5.5，磷酸盐缓冲液pH值为6.0~6.5) 在恒温下混匀酶解，然后灭酶，依次过滤、浓缩、离心 (4 500 r·min^-1，15 min)，取上清液加石油醚除杂，最后冻干再复溶、定容，测定含量。

1.3.2   芦丁标准曲线

根据文献[11]称取已恒重的芦丁0.100 g，加入适量蒸馏水溶解，转移到100 mL的容量瓶中，定容至刻度，摇匀，备用。准确移取标准溶液0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL于25 mL容量瓶中，分别加入0.05 g· mL^-1 NaNO₂溶液0.8 mL，摇匀，静置5 min；然后加入10 g·mL^-1 Al (NO₃)₃溶液0.8 mL，摇匀，静置5 min；再加入1 mol·L^-1 NaOH溶液10.00 mL；用体积分数是70%乙醇溶液定容至25.00 mL，摇匀，静置15 min。测量最大吸收波长为510 nm，以试剂空白为参比，用1 cm比色皿测定其吸光度。得到的回归方程为：A₅₁₀=0.5889x-0.0151，相关系数R²=0.9968。

1.3.3   灵芝黄酮含量测定

称取3.0 g灵芝粉末于锥形瓶中，进行上述各提法提取、抽滤、离心 (3 500 r·min^-1，6 min)，取上清液1 mL样品于25mL容量瓶中，NaNO₂-Al (NO₃)₃-NaOH比色法测定总黄酮，根据标准曲线回归方程，由吸光度求出提取液中的黄酮质量浓度，并按照下列公式计算各处理的黄酮得率。

式中：W为黄酮得率 (mg·g^-1)；C为黄酮质量浓度 (mg·mL^-1)；V为定容体积 (mL)；m为原料质量 (g)。

1.3.4   单因素试验

对灵芝黄酮提取试验进行复合酶提取的单因素试验设计。以中性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶3种酶的用量、pH值、温度和酶作用时间为考查因素，以黄酮的提取量为考查指标，进行单因素试验。试验重复3次。

1.3.5   响应面试验设计

为了进一步优化灵芝黄酮的提取工艺，根据单因素试验结果，在80 min、50℃、pH值为5.0的酶解条件下，利用Box-Benhnken试验设计原理，以纤维素酶、果胶酶和中性蛋白酶的用量为自变量，以黄酮得率为响应值进行三因素三水平的响应面试验。试验因素水平设计见表 1。

表  1  响应面试验设计

Table  1.  Response surface experimental design

因素	水平
	-1	0	1
X1纤维素酶/%	1.5	2	2.5
X2果胶酶/%	0.4	0.8	1.2
X3中性蛋白酶/%	1.5	2	2.5

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1.3.6   抗氧化试验

根据响应面法优化的条件提取灵芝的样液作为测定对象，以DPPH自由基清除率、羟自由基清除率和总还原力为指标比较灵芝总黄酮提取液及V_C的抗氧化能力。

(1) DPPH自由基清除率的测定：根据文献[12]进行测定。用无水乙醇将DPPH配制成0.04 mg·mL^-1溶液。在1 mL不同浓度的样品 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·mL^-1) 中加入2 mL DPPH, 混合均匀后室温避光反应30 min后，于517 nm处测吸光值。用Vc做阳性对照。DPPH清除率的计算公式如下：

式中：A样品为样品吸光值；A对照为用乙醇代替DPPH的吸光值；A空白为用乙醇代替样品的吸光值。

(2) 羟自由基清除率的测定：羟自由基清除率参照Huang等^[13]的方法进行。取1 mL不同浓度的样品 (0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg· mL^-1)，依次加入FeSO₄(9 mmol·L^-1，1 mL)、水杨酸-乙醇溶液 (9 mmol·L^-1，1 mL) 和H₂O₂(9 mmol·L^-1，1 mL)。在37℃水浴下反应30 min，在510 nm处测定吸光值。以V_C作为阳性对照。羟自由基清除率计算公式如下：

式中：A样品为样品吸光值；A对照为用蒸馏水代替H₂O₂的吸光值；A空白为用蒸馏水代替样品的吸光值。

(3) 总还原力的测定：总还原力的测定根据文献[14]进行。反应体系包含2.5 mL的磷酸缓冲液 (0.2 mol·L^-1pH 6.6) 和1 mL待测样品溶液。在试管中加入0.2 mol·L^-1pH 6.6的磷酸缓冲液2.5 mL和不同浓度的待测样品溶液1 mL，然后于50℃的水中反应20 min。取出后加入2.5 mL三氯乙酸 (10%，W/V) 终止反应。然后加入蒸馏水和三氯化铁溶液 (0.1%，W/V), 混合静置10 min，于700 nm处测定吸光值。

2.   结果与分析

2.1   复合酶提取对灵芝黄酮的单因素试验

2.1.1   酶解pH值对灵芝黄酮得率的影响

按不同的酶pH值，酶添加量为1.0%，提取温度50℃，提取时间80 min的条件下测得黄酮得率。由图 1-A可知，当酶添加量为1.0%，提取温度50℃，提取时间80 min时，不同的酶解pH会显著影响灵芝黄酮的得率。当pH为5时，黄酮得率达到最大，因此选择pH值为5.0进一步试验。

图  1  不同因素对灵芝黄酮得率的影响

注：A为pH值对灵芝黄酮得率的影响；B为酶解温度对灵芝黄酮得率的影响；C为酶解时间对灵芝黄酮得率的影响；D为酶用量对黄酮得率的影响。

Figure  1.  Effect of pH on yield of G. lucidum flavone

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2.1.2   酶解温度对灵芝黄酮得率的影响

按不同的酶解温度，酶添加量为1.0%，提取pH为5，提取时间80 min的条件下测得的黄酮得率。由图 1-B可知当酶添加量为1.0%，提取酶pH值为5.0，提取时间为80 min时，在考查温度范围内，随着温度的升高，黄酮得率逐渐升高，当温度为50℃时，黄酮得率达到最高。

2.1.3   酶解时间对灵芝黄酮得率的影响

按不同的酶解时间，酶添加量为1.0%，提取pH为5，酶解温度50℃的条件下测得的黄酮得率。由图 1-C可知，当酶添加量为1.0%，提取酶pH值为5.0，酶解温度50℃时，随着纤维素酶和果胶酶对灵芝作用时间的延长，黄酮得率逐渐增加，当酶解80 min时，黄酮得率最大，而中性蛋白酶则在酶解100 min时得率最大, 但是为了后面复合酶比例优化的方便，统一酶解时间为80 min做进一步考查。

2.1.4   酶用量对灵芝和黄酮得率的影响

按不同的酶用量，酶解时间为80 min，提取pH为5，酶解温度50℃的条件下测得的黄酮得率。由图 1-D可知，当酶提取时间80 min，提取酶pH值为5.0，酶解温度50℃时，根据总黄酮得率，纤维素酶的最佳用量为1.5%，果胶酶的最佳用量为0.8%，中性蛋白酶的最佳用量为2.0%。

2.2   复合酶响应面试验结果

用Design Expert软件对响应面试验结果进行处理和方差分析：得到灵芝黄酮得率的复合酶用量配比的二次多元回归方程：Y=0.69+0.049X₁+0.055 X₂+0.039X₃-0.0075X₁X₂-0.005X₁X₃-0.012X₂X₃-0.18 X₁²-0.18 X₂²-0.088 X₃²。

表  2  响应面试验结果

Table  2.  Response surface experimental results

试验 号	X1 纤维素酶/%	X2 果胶酶/%	X3 中性蛋白酶/%	黄酮得率 /(mg·g-1)
1	1.50	0.80	2.50	0.4
2	2.00	0.80	2.00	0.63
3	1.50	1.20	2.00	0.36
4	2.00	0.80	2.00	0.72
5	2.50	1.20	2.00	0.4
6	2.00	1.20	1.50	0.46
7	2.00	0.80	2.00	0.67
8	2.00	0.80	2.00	0.7
9	2.50	0.40	2.00	0.31
10	2.50	0.80	1.50	0.45
11	1.50	0.80	1.50	0.3
12	1.50	0.40	2.00	0.24
13	2.00	1.20	2.50	0.5
14	2.00	0.40	2.50	0.41
15	2.00	0.40	1.50	0.32
16	2.50	0.80	2.50	0.53
17	2.00	0.80	2.00	0.69

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对该模型和回归系数的方差分析结果显示，P < 0.01表明响应回归模型极显著，即模型有意义。R²为0.971 0，R_Adj²为0.933 6，变异系数为8.33，表明模型的拟合程度较好，试验误差小。失拟项P值为0.569 7，提示其影响不显著，即失拟项与纯误差之间差异不显著，由此可知，试验操作可信度较高，可以用回归方程对试验结果进行分析和预测。

对回归方程系数进行显著性检验，表 3表明纤维素酶X₁及其二次项X₁²，果胶酶X₂及其二次项X₂²和中性蛋白酶X₃及其二次项X₃²对黄酮得率影响显著 (P < 0.05) 的因素项。依据一次项系数X₁为0.049；X₂为0.055；X₃为0.039的绝对值可知因素的主效应关系，果胶酶对黄酮得率影响最大，中性蛋白酶的影响最小。

表  3  黄酮得率回归系数及显著性检验

Table  3.  Regression coefficient and significance test on flavone yield

变异来源	平方和	自由度	均方差	F值	P值
模型	0.3643	9	0.0405	26.01	0.0001**
X1	0.0190	1	0.0190	12.22	0.0101*
X2	0.0242	1	0.0242	15.55	0.0056**
X3	0.0120	1	0.0120	7.72	0.0274*
X1X2	0.0002	1	0.0002	0.14	0.7151
X1X3	0.0001	1	0.0001	0.06	0.8072
X2X3	0.0006	1	0.0006	0.40	0.5464
X12	0.1282	1	0.1282	82.38	<0.0001**
X22	0.1246	1	0.1246	80.03	<0.0001**
X32	0.0266	1	0.0266	17.10	0.0044**
残差	0.0109	7	0.0016
失拟项	0.0040	3	0.0013	0.77	0.5697
纯误差	0.0069	4	0.0017
总差	0.3752	16
R2=0.9710，RAdj2=0.9336，CV=8.33%，*P < 0.05，差异显著；**P < 0.01，差异极显著。

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由图 2-A可以看出：纤维素酶和果胶酶对灵芝黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，随着提取时间的延长，得率经过一个先升高后降低的过程。由图 2-B可以看出：纤维素酶对灵芝黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，随着提取时间的延长，提取率经过一个先升高后降低的过程；中性蛋白酶对灵芝黄酮得率的影响不太显著，曲面较缓和并且随着温度的上升，提取率经过一个先升高后稍微减小的过程。由图 2-C可以看出：果胶酶对灵芝黄酮得率的影响较显著，曲面较陡，随着提取时间的延长，提取率经过一个先升高后降低的过程；中性蛋白酶对灵芝黄酮得率的影响不太显著，曲面较缓和并且随着温度的上升，得率经过一个先升高后稍微减小的过程。通过软件分析可以得到，对黄酮得率影响，酶添加量分别为：纤维素酶添加量2.07%；果胶酶添加量0.86%；中性蛋白酶添加量2.11%。在此条件下黄酮得率预测的最大值为0.685 mg·g^-1。采用上述最优提取条件进行验证试验，结果测得的灵芝黄酮得率为0.75 mg·g^-1，与模型预测值的误差为0.79%，因此本试验得到的灵芝黄酮提取条件的参数比较准确，可为实际应用提供参考。

图  2  不同因素交互作用对灵芝黄酮得率响应曲面的影响

注：A为纤维素酶与果胶酶两因素交互作用对灵芝黄酮得率响应曲面的影响；B为纤维素酶与中性蛋白酶两因素交互作用对灵芝黄酮得率响应曲面的影响；C为果胶酶与中性蛋白酶两因素交互作用对灵芝黄酮得率响应曲面的影响。

Figure  2.  Response surface showing interactive effects of cellulase and pectinase on extraction yield of G. lucidum flavone

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2.3   灵芝提取液抗氧化活性试验结果

2.3.1   灵芝提取液对DPPH自由基清除作用

由图 3可知，灵芝提取液各组分对DPPH清除率结果中，在试验浓度范围内，灵芝提取液对DPPH的清除率随着浓度的增大而显著增加，但当浓度大于0.8 mg·mL^-1时，对DPPH的清除率没有发生显著性变化 (P>0.05)。经计算灵芝提取液对DPPH的清除率的IC₅₀为2.54 mg·mL^-1。

图  3  灵芝提取液对DPPH的清除作用

Figure  3.  Scavenging ability of Ganoderma extract on DPPH radicals

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2.3.2   灵芝提取液对羟自由基清除作用

由图 4可知，灵芝提取液对羟自由基清除结果中，当浓度在0.4~1.6 mg·mL^-1范围内，灵芝提取液对羟自由基的清除率具有显著性影响 (P < 0.05)，且随着浓度的增大而增大。当质量浓度超过1.6 mg·mL^-1后，对羟自由基的清除率影响趋于平缓。经计算灵芝提取液对羟自由基的清除率的IC₅₀为2.39 mg·mL^-1。

图  4  灵芝提取液对羟自由基的清除作用

Figure  4.  Scavenging ability of Ganoderma extract on hydroxyl radicals

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2.3.3   灵芝提取液的总还原力

由图 5可知，灵芝提取液表现出较强的还原力，在实验质量浓度范围内，灵芝提取液的还原力随着质量浓度的增加而增大，两者呈正相关，在9 mg·mL^-1还原力达到1.71。

图  5  灵芝提取液的还原力

Figure  5.  Reducing Power of Ganoderma extract

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3.   讨论与结论

黄酮类化合物是一类活性物质, 并具有特殊的保健及疗效功能。其提取方法多样，有热水提取法、碱液提取法、丙酮提取法、乙醇浸提法、微波萃取法、超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超滤法等。彭晓青等^[2]利用复合酶法提取总黄酮，具有较高的提取率。目前在黄酮类化合物的提取方法中，溶剂提取法、热水提取法等传统方法仍占主导地位，但与酶解、超滤、微波等提取分离技术相比，逐渐暴露了许多问题，如提取温度高，时间长，能量消耗大，不利于黄酮类化合物母核活性的保护，产品中黄酮类化合物得率和含量低，尤其是存在溶剂残留。相反酶解等提取方法提取速度快，产率和纯度高，提取条件温和，耗能少，有利于黄酮类化合物母核活性的保护等特点。

酶解温度、酶解时间和酶用量都会对酶的作用效果产生一定的影响，因此本试验在单因素的基础上确定复合酶中各种酶的最佳酶解温度、酶解时间和酶用量，进而利用Box-Behnken响应面试验对复合酶中各种酶的配比进行优化。得出复合酶提取灵芝黄酮的最佳酶比例为纤维素酶:果胶酶:中性蛋白酶为2.07:0.86:2.11。在该工艺条件下，灵芝黄酮实际得率可达0.75 mg·g^-1。经体外抗氧化活性测定，结果显示，灵芝提取液具有较强的还原力，对DPPH自由基清除率、羟自由基清除率的IC₅₀分别为2.54 mg· mL^-1和2.39 mg· mL^-1，说明灵芝提取液具有一定的抗氧化活性。如何提高灵芝的黄酮类化合物的得率以及其提取液的抗氧化活性一直是研究的热点，此研究可为开发天然抗氧化剂提供一定参考。