Genetic Relationship among Guava Germplasms Accessed by Using ISSR Markers
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摘要: 采用ISSR分子标记技术对36份番石榴种质资源的亲缘关系进行分析，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行数据分析，建立种质资源间的亲缘关系；从100条ISSR引物中筛选出9条多态性较丰富且稳定的引物，共扩增出165条带，其中多态性条带129条，多态性百分率为78.18%；扩增结果可将36份种质资源较好地区分开，各种质间遗传相似系数为0.70~0.93，平均遗传相似系数为0.815；在遗传相似系数0.75处，可将36份种质资源分成4组，与形态分类结果大致相符合。结果表明所收集的番石榴种质资源遗传基础较狭窄，但ISSR分子标记技术能较好地鉴别这些种质资源。Abstract: Using ISSR molecular markers, PCR products of 36 guava germplasms were purified by polyacrylamide gel electrophoresis and photographed the images for a UPGMA analysis to establish the genetic relationship. Out of 100 UBC series ISSR primers, 9 rich and stable polymorphic primers were selected and 165 bands amplified. Among the 165 bands, 129 were polymorphic rendering a polymorphism percentage of 78.18%. The amplified results could satisfactorily distinguish the 36 germplasms. The genetic similarity coefficient of all samples ranged from 0.70 to 0.93, averaging 0.815. At the coefficient of 0.75, the 36 germplasms were divided into 4 groups. The results were consistent with the morphological classification. Although the genetic basis for classification was weak, with the aid of ISSR molecular markers, clear identifications for the individual germplasms of the collection were obtained.
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Keywords:
- guava /
- ISSR /
- genetic relationship
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0. 引言
【研究意义】丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi, AMF）可以与地球上90%的陆生高等植物建立起共生模式，形成特定的“菌根”结构。丛枝菌根作为最常见的内生菌根，与植物构建共生关系后，可以促进植物对周围根系土壤营养元素的吸收，从而促进植物自身的生长发育 [1]，提高植物耐旱、耐盐碱和抗病能力[2]。红豆杉是珍贵的用材树种，具有较高的观赏价值，红豆杉中的紫杉醇是一种抗癌活性成分，能够有效抑制癌细胞的生长和繁殖，具有很高的药用价值 [3]。南方红豆杉（Taxus wallichiana var. mairei）为中国红豆杉的变种，高20 m，是中国分布最为广泛的红豆杉 [4]，主要分布于湖南、台湾、福建、广西等南方各省。现代医药中具有抗癌作用的成分紫杉醇，其主要来源于红豆杉属植物，是一种二萜生物碱类化合物，Lun等 [5]研究发现可以作用于癌细胞增殖转移过程中的蛋白质，并明显阻止癌细胞增殖。对于药用植物红豆杉而言，红豆杉的质量和产量对其入药至关重要，如何提高红豆杉产量和有效药用成分含量一直是重要的研究方向。【前人研究进展】王海娟 [6]研究发现，接种AMF，使植物与AMF形成一种共生关系，可以提高植物根系周围土壤的微生物含量，促进植物对土壤周围营养的吸收，改善植物生长速率和生长状况。马放等[7]研究发现AMF可以促进小麦的生长，耿云芬等[8]研究表明接种AMF的国家二级濒危植物铁力木的侵染率、苗高、地径、叶片数、干重、鲜重等均增加，丛枝菌根能和铁力木幼苗形成共生关系，促进铁力木幼苗生长，提高幼苗的光合效率。研究还发现AMF对与之形成共生关系的植物具有促进生长的作用，可以为次生代谢合成提供底物，同时AMF与植物共生能够显著影响植物次生代谢的合成与积累 [9]。目前人为的过度采伐等原因导致大部分南方红豆杉呈现濒危趋势 [10]，故对南方红豆杉的研究较为热门。付晓峰等 [11]研究发现接种AMF对南方红豆杉的生长具有促进作用，接种AMF还促进了南方红豆杉根际重要土壤酶（酸性磷酸酶、脱氢酶、转化酶）活力的增加。【本研究切入点】目前AMF对南方红豆杉重要药用成分影响的系统研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以南方红豆杉幼苗和AMF为试验材料，将两种不同的AMF单独接入或混接于南方红豆杉实验条件下的盆栽苗根际，研究其对南方红豆杉的生长指标、土壤理化性质以其次生代谢产物的影响，旨在揭示不同接种处理在南方红豆杉生长过程中产生的作用，探究是否能通过微生物与植物的互作来提高其紫杉醇含量，筛选可以更有效提高次生代谢物紫杉醇含量的AMF，从而为促进红豆杉体内有效药用成分生产提供重要的理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试材料为一年半生南方红豆杉直生苗（成都中医药大学药用植物园提供），供试AMF菌种为根内根孢囊霉菌Rhizophagus intraradices（RI）和摩西斗管囊霉菌Funneliformis mosseae（FM），菌剂购自北京市农林科学院植物营养与资源研究所，菌剂为干燥全培养物（基质菌丝、孢子、真菌侵染的根段以及培养基质的混合物）。供试基质河沙用自来水冲洗干净后与蛭石、土壤按体积1∶1∶1混匀，于灭菌锅121 ℃、0.1 MPa下灭菌2 h（灭菌土pH=7、呈中性，呈粉末状）。
1.2 试验方法
试验用塑料盆（25 cm×19 cm×17 cm）进行种植，塑料盆提前经过0.2%高锰酸钾浸泡过夜备用。试验前提前将供试基质混合并分装，挑选大小一致且长势良好的南方红豆杉幼苗，使用无菌水浸泡苗木的根部10遍。本试验播种和接种同步进行，每盆装入适量混合灭菌土，接种处理每盆加10 g菌种，每盆播种苗木1株。设置4个处理，分别为：CK（不接种）、GM（单独接种F. mosseae）、GI（单独接种R. intraradices）、MA（F. mosseae、R. intraradices共同接种），每个处理6个栽植盆；分别贴好标签，移至室外进行培养并在生长期内定期浇灌无菌水。
1.3 侵染率、植物生长指标及土壤理化性质的测定
1.3.1 侵染率检测
接种60 d后，对侵染率进行检测来筛选优势AMF。利用台盼蓝对植物根系进行染色，用于 AMF 观察和侵染率的测定 [12]。根系侵染率/%=（被侵染的根段/检测的总根段）×100。
1.3.2 植物生长指标测定
测量生长6月的南方红豆杉幼苗的各项生长指标，利用测量尺测定株高和主根长度；利用游标卡尺（精确到0.1 mm）测量地径，计算南方红豆杉幼苗一级分支数。
1.3.3 土壤理化性质检测
生长10月后在栽培盆内进行采样，每个培养盆内取5个样点，各取样点间隔5 cm，去掉表层 1 cm 厚的表土，采集距地表2～10 cm 土层的根围土壤，5个样点土壤混合。将土壤中的石块、树枝、树叶等剔除干净后，根据不同测定方法要求将土壤适当研磨、充分混匀、过16目筛后分装。在实验室中分别测定土壤含水量[13]、土壤速效磷含量[14]、土壤碱解氮[15]和土壤速效钾含量[16]。
1.4 紫杉醇含量测定
采用高效液相色谱法测定。色谱条件为WATERS 2695 高效液相色谱仪2996DAD检测器；甲醇∶水=45∶55，检测波长228 nm；流速l.0 mL·min−1；检测温度：室温；进样量：30 μL。精密称取12.5 mg紫杉醇对照品，将其用甲醇溶液溶解于25 mL容量瓶并进行定容，最终制成紫杉醇标准溶液0.5 mg·mL−1。然后分别用移液管取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL标准溶液到10 mL容量瓶中，以甲醇溶液进行定容、摇匀，最后分别制成质量浓度为5、10、20、40、80 μg·mL−1的标准品溶液，以供制作标准曲线时使用。
每组处理随机取样，剪取幼苗的叶片以及枝条，所有样品在 105 ℃ 的烘箱中干燥 30 min，再于70 ℃ 的温度下烘 48 h，直到质量稳定为止，随后用研钵研成粉末。用电子天平精密称取苗木干枝叶粉末1 g，置于试管中，加入20 mL无水乙醇，在45 ℃的恒温水浴条件下，浸提3 h，然后进行静置过滤，滤渣再以20 mL无水乙醇在相同的条件下浸提3 h，过滤后把2次滤液合并，通过旋转蒸发仪旋转蒸发，蒸至墨绿色浸膏状。最后以适量的甲醇溶解浸膏，完全溶解成液体状，再将全部的液体溶液转移至10 mL的容量瓶中，用甲醇完全定容。经过0.45 μm微孔滤膜过滤，得到样品溶液。将供试样品分别进行高效液相色谱检测，按最佳的洗脱条件进行洗脱，记录峰的面积和保留时间，通过标准曲线计算各个样品中相应的紫杉醇含量。
1.5 数据分析
采用IBM SPSS 26.0软件（Armonk，NY， USA）对数据进行单因素方差分析（ANOVA）和LSD多重比较检验。数据显示为平均值±标准误差（SEM）。使用Origin 2023进行图表绘制。
2. 结果与分析
2.1 不同处理组侵染情况及土壤理化性质
图1A～D依次为空白对照组、接种摩西斗管囊霉菌、接种根内根孢囊霉菌和混合接种摩西和根内根孢囊霉菌的菌根侵染情况图，其侵染率依次为2%、18%、28%、17%，发现接种处理的侵染率显著高于对照组。图中还可以观察到AMF的泡囊和菌丝。
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图 1 不同处理组对南方红豆杉幼苗侵染效果Figure 1. AMF infection rates on T. chinensis seedlings by different treatments不同的AMF对其土壤理化性质的影响有所不同（表1），GM、GI组对pH的影响显著小于CK组和MA组，说明接种摩西斗管囊霉菌或根内根孢囊霉菌可以显著降低根围土壤的pH值；从土壤含水量分析，AMF对土壤含水量的影响不显著；对于土壤速效钾、碱解氮含量来说，GI组和GM组的土壤速效钾和碱解氮含量显著大于CK组和MA组，说明GI和GM真菌对土壤的速效钾和碱解氮具有显著影响作用；从速效磷含量来看，GM、GI对土壤速效磷含量显著小于其余组，说明GM、GI两组植物对磷的吸收量显著高于对照组；从侵染率分析，GI的侵染率最大，在其余组中，侵染率GM＞MA＞CK，不同AMF对土壤理化性质影响不同；土壤中的速效钾、碱解氮和速效磷3个指标中，接种组的含量与对照组的含量相比差异显著，且GI组和GM组与CK组和MA组相比影响较为显著，其中速效钾和碱解氮含量呈增加，而速效钾含量呈减少，也进一步说明接种AMF更有利于植物吸收土壤中的速效磷，相对而言， GI组和GM组对土壤理化性质影响比较显著。
表 1 不同 AM 真菌的土壤理化性质（平均值+标准误）Table 1. Soil physicochemical properties under AMF treatments (mean+SE)处理
Treatment酸碱度
pH含水量
Moisture
content/%速效钾
Rapidly available
potassium/
(μg·mL−1)碱解氮
Alkali hydrolyzable
nitrogen/
(mg·kg−1)速效磷
Rapidly available
phosphorus/
(mg·L−1)侵染率
Colonization
rate/%CK 6.57±0.52b 41.02±3.61a 1.46±0.56c 1.58±0.76b 6.13±0.12a 2.03±0.10c GM 6.01±0.29d 41.12±5.33a 1.76±0.25b 2.85±1.16a 4.67±0.05b 18.56±5.81b GI 6.31±0.92c 42.09±1.94a 2.14±0.38a 3.11±3.16a 4.48±0.50b 28.34±3.35a MA 6.99±0.32a 41.27±3.47a 1.81±1.20b 1.93±1.91b 6.88±0.13a 17.82±9.07b 同一列数据后字母不同者表示差异显著（P ＜ 0.05）。
Date with different letters are significantly different (P ＜ 0.05) in the same column.2.2 不同AM真菌对南方红豆杉幼苗生长指标的影响
生长指标可以更直接表现出培养期间幼苗的生长状况。通过试验数据分析，不同AMF培养下的南方红豆杉幼苗的株高、根长、一级枝数、地径都不同（图2）。在为期6个月的幼苗培养期间，发现接种AMF组的各项生长指标均优于未接种组；其中南方红豆杉株高GM、GI显著高于其余各组（P ＜ 0.05）；GI组幼苗地径显著高于其余各组（P ＜ 0.05）；GI、GM组的苗木根长显著高于其余各组（P ＜ 0.05）；GM组苗木一级枝数响显著大于其余各组，而GM和GI组之间不存在显著性差异。
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图 2 不同处理组对南方红豆杉幼苗生长指标的影响具有不同字母的处理差异显著（P＜0.05）。下同。Figure 2. Effect of AMF inoculation on growth of T. chinensis seedlingsPanel containing different letters indicates significantly difference at P＜0.05. Same for below.2.3 土壤理化性质指标与生长指标相关性分析
通过生长指标和土壤理化性质指标的相关性分析，结果（表2）表明，速效钾与侵染率和地径之间呈现极显著正相关性（P ＜ 0.01），与碱解氮、根长呈显著正相关（P ＜ 0.05）；碱解氮与侵染率、根长、地径和株高呈现极显著正相关（P ＜ 0.01），但与速效磷呈极显著负相关（P ＜ 0.01）；速效磷与碱解氮、根长、地径和株高之间呈现极显著负相关性（P ＜ 0.01），与侵染率呈现显著负相关（P ＜ 0.05），与pH呈极显著正相关（P ＜ 0.01）；pH与根长、地径和株高呈极显著负相关，与速效磷呈极显著正相关；侵染率与pH之间存在极弱的相关关系，菌根的侵染率与植物的根长、地径、速效钾和碱解氮之间呈现极显著正相关（P ＜ 0.01），与速效磷呈现显著负相关性（P ＜ 0.05），与株高呈显著正相关（P ＜ 0.05）；根长与碱解氮、侵染率、地径和株高呈呈极显著正相关（P ＜ 0.01），与pH和速效磷呈极显著负相关（P ＜ 0.01）；地径与速效钾、碱解氮、侵染率和根长呈极显著正相关（P ＜ 0.01）。
表 2 土壤理化性质与生长指标相关性分析Table 2. Correlation between soil physicochemical property and seedling growth项目
Item速效钾
Rapidly
available
potassium碱解氮
Alkali
hydrolyzable
nitrogen速效磷
Rapidly
available
phosphorus酸碱度
pH侵染率
Colonization
rate根长
Root
length地径
Ground diameter株高
Plant
height速效钾 Rapidly available potassium 1 碱解氮 Alkali hydrolyzable nitrogen 0.618* 1 速效磷 Rapidly available phosphorus −0.493 −0.818** 1 酸碱度 pH −0.230 −0.559 0.814** 1 侵染率 Colonization rate 0.855** 0.789** −0.618* −0.336 1 根长 Root length 0.683* 0.812** −0.868** −0.795** 0.747** 1 地径 Ground diameter 0.709** 0.868** −0.883** −0.781** 0.821** 0.917** 1 株高 Plant height 0.534 0.782** −0.837** −0.795** 0.621* 0.845** 0.878** 1 *表示显著相关（P ＜ 0.05），**表示极显著相关P ＜ 0.01。
* Indicates significant correlation at P＜0.05; **Indicates extremely significant correlation at P＜0.01.2.4 AMF对红豆杉紫杉醇含量的影响
从色谱图中查得峰面积并计算其浓度，如图3所示。将样品检测所得到的峰面积带入标准紫杉醇标准曲线中，计算得CK、GM、GI、MA的紫杉醇含量分别为37.50 、62.42 、76.43 、44.89 μg·mL−1；对比可以发现，接种AMF的处理组紫杉醇含量均显著高于空白对照组；而在接种的3个处理中紫杉醇含量由大到小分别是根内根孢囊霉菌、摩西斗管囊霉菌、混合接种。其中接种根内根孢囊霉菌的红豆杉紫杉醇含量高于其他处理组，且高达未接种组红豆杉紫杉醇含量的两倍，可以说明接种根内根孢囊霉菌对南方红豆杉次生代谢物紫杉醇含量的促进效果最好；同时，接种摩西斗管囊霉菌的红豆杉紫杉醇含量次之，也高达未接种组红豆杉紫杉醇含量的1.5倍，这都说明接种AMF对红豆杉紫杉醇含量有显著促进作用；混合接种组红豆杉紫杉醇含量高出未接种组红豆杉紫杉醇含量不多，说明两种不同的AMF混合接种的效果不如单独接种。
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图 3 不同处理对南方红豆杉幼苗紫杉醇质量浓度的影响Figure 3. Effects of AMF treatments on paclitaxel content in T. chinensis seedlings3. 讨论与结论
3.1 不同AMF对南方红豆杉幼苗生长及幼苗根围土壤理化性质的影响
将根内根孢囊霉菌和摩西斗管囊霉菌单独接入或混接于苗木根系进行南方红豆杉和AMF的共培养试验，发现AMF具有促进幼苗根系生长的功能，其中根内根孢囊霉菌促进效果更佳。AMF在植物根系成功定殖后，会形成庞大的菌丝网络，不仅可以提高根系对水分、营养物质的吸收和利用效率，还可以加强植物体内营养元素的运输，从而促进植物的生长发育。当土壤环境发生变化时，根系会首先感受并随之产生一系列的生理生化变化 [17]，在适磷条件下，接种AM真菌提高根系体积48%，在低磷条件下，接种AM真菌显著提高根系总长、投影面积、表面积、平均直径和体积[18]，根茎上的根毛被AMF侵染后与植物共生形成菌根，汲取土壤中的氮、磷、钾等营养物质，使得植物根茎获得更多的营养成分 [19]。
AMF与南方红豆杉根系形成共生形成菌根有利于土壤无机元素的活化、养分的积累等。Liu等[20]将红豆杉定为内生菌根植物，并指出南方红豆杉可与丛枝菌根真菌形成丛枝-囊泡型菌根。AMF能够通过与南方红豆杉共生来增强其生长能力，AMF能够在植物根部形成菌根，活化土壤里的无机元素，促使有机元素增多，同时也增加根系周围土壤的微生物数量，促进植物吸收养分和水分[21]。Qiu 等 [22]研究发现接种AMF提升了固氮植物的固氮作用，增加了土壤中的总氮。同时，该研究还发现，AMF复垦土壤中根系菌根侵染率与速效钾含量呈正相关关系，表明根系菌根侵染率高的AMF复垦土壤具有积累土壤速效钾的潜力。李佳齐等 [23]研究发现AMF可以通过多种方式提高酸化和盐碱化土壤中的养分含量，如碳、氮、磷等固定土壤的养分使之更容易被植物吸收，改良土壤pH。在本研究中所测定的速效钾、碱解氮的含量是明显高于CK和MA组的。潘龙等[24]研究表明AMF活化了无机元素，而速效磷的含量却减少，是因为AMF能够和土壤中的解磷细菌互作，促进土壤中无效磷向有效磷的转化，进而促进植物对磷的高效吸收。
3.2 AMF对南方红豆杉次生代谢的影响
接种AMF可显著提高南方红豆杉根际土壤微生物数量及土壤酶活力，提高土壤微生物碳源利用率和土壤肥力，增加土壤中的生物多样性，从而达到间接促进宿主植物南方红豆杉生长的目的 [11]。AMF能显著影响南方红豆杉次生代谢物紫杉醇的合成以及含量变化，对紫杉醇的积累也产生了明显的积极影响，其中根内根孢囊霉菌促进效果更佳。AMF作为土壤生态系统中广泛分布的优质微生物资源，能够直接或间接影响植物次生代谢过程，引起药用植物次生代谢产物含量的变化 [25]。南方红豆杉菌根具有不同于其他器官组织内生真菌的菌群，其原始根组织中有远高于普通根及其他器官组织的紫杉醇含量，且愈伤组织与菌根菌互作可提高其紫杉醇含量 [26]。AMF可以促进南方红豆杉中倍半萜类次生代谢物的积累，其中包括紫杉醇、伽玛-谷甾醇等化合物 [3]，本研究结果表明接种AMF的南方红豆杉所积累的紫杉醇含量远远大于未接种的，其中根内根孢囊霉菌组的紫杉醇含量最高。
综上所述，AMF能够显著影响南方红豆杉的次生代谢物，包括促进生长期产生的次生代谢物合成和增加次生代谢物含量等，这对深入了解南方红豆杉与AMF共生的机制、开发南方红豆杉的药用价值具有重要的理论和应用意义。本文探究了根内根孢囊霉菌、摩西斗管囊霉菌对南方红豆杉生长状况以及代谢产物紫杉醇的影响，但对其侵染南方红豆杉的机制还有待研究。今后可应用分子技术以及同位素标记法探讨丛枝菌根共生体系，为接种丛枝菌根真菌提高紫杉醇的含量分子机制研究提供理论基础。同时，本研究仅涉及AMF对南方红豆杉苗期的影响，在种植的过程中，可能会有其他菌种与南方红豆杉形成共生关系，从而影响南方红豆杉的生长状况及代谢产物紫杉醇的含量，关于接种AMF后对土壤其他微生物的影响有待进一步研究。
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图 2 番石榴种质资源的UPGMA聚类
注：1~36为资源编号同表 1；A、B、C、D分别对应为聚类分析中的第1组、第2组、第3组、第4组。
Figure 2. UPGMA dendrogram of guava germplasms
表 1 供试资源及取样地点
Table 1 Sources of germplasms and sampling sites
编号 资源名称 取样地点 1 龙州1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 2 龙州2号 3 龙州3号 4 长果新世纪番石榴 5 圆果新世纪番石榴 6 新世纪实生番石榴 7 新西兰番石榴 8 嘉缘番石榴 9 珍珠番石榴 10 梨形番石榴 11 东兴农家种番石榴 12 汕红番石榴 13 老虎岭番石榴 14 琼番石榴17号 15 泰国大果番石榴 16 全红番石榴 17 维邦1号 18 维邦2号 19 维邦3号 20 景洪1号 云南省西双版纳热作所资源圃 21 景洪2号 22 河口1号 云南省红河热带农业科学研究所 23 河口2号 24 小平田1号 云南省保山市隆阳区热经所 25 小平田2号 26 南宁本地番石榴1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 27 南宁本地番石榴3号 28 南宁本地番石榴6号 29 南宁本地番石榴7号 30 南宁本地番石榴9号 31 南宁本地番石榴10号 32 迷你番石榴 33 南宁本地番石榴实生1号 34 南宁本地番石榴实生2号 35 八桂田园番石榴 36 南宁本地番石榴8号 注：供试种质名称为收集种质时所采用的品种名，品种名不明确的，以收集地或植株果实特征命名。所有供试种质通过嫁接现均保存于广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃内。 
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表 2 ISSR引物序列及其扩增结果
Table 2 ISSR primer sequence and amplification
引物编号 引物序列 总条带数/条 多态性条带/条 多态性带比例/% UBC810 gagagagagagagagat 15 13 86.67 UBC811 gagagagagagagagac 22 19 86.36 UBC812 gagagagagagagagaa 20 16 80 UBC841 gagagagagagagagayc 20 12 60 UBC842 gagagagagagagagayg 16 9 56.25 UBC857 acacacacacacacacyg 13 13 100 UBC861 accaccaccaccaccacc 14 9 64.29 UBC889 dbdacacacacacacac 17 12 70.59 UBC890 vhvgtgtgtgtgtgtgt 28 26 92.86 合计 165 129 78.18
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