Genetic Relationship among Guava Germplasms Accessed by Using ISSR Markers
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摘要: 采用ISSR分子标记技术对36份番石榴种质资源的亲缘关系进行分析，PCR产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，通过非加权配对算术平均法（UPGMA）进行数据分析，建立种质资源间的亲缘关系；从100条ISSR引物中筛选出9条多态性较丰富且稳定的引物，共扩增出165条带，其中多态性条带129条，多态性百分率为78.18%；扩增结果可将36份种质资源较好地区分开，各种质间遗传相似系数为0.70~0.93，平均遗传相似系数为0.815；在遗传相似系数0.75处，可将36份种质资源分成4组，与形态分类结果大致相符合。结果表明所收集的番石榴种质资源遗传基础较狭窄，但ISSR分子标记技术能较好地鉴别这些种质资源。Abstract: Using ISSR molecular markers, PCR products of 36 guava germplasms were purified by polyacrylamide gel electrophoresis and photographed the images for a UPGMA analysis to establish the genetic relationship. Out of 100 UBC series ISSR primers, 9 rich and stable polymorphic primers were selected and 165 bands amplified. Among the 165 bands, 129 were polymorphic rendering a polymorphism percentage of 78.18%. The amplified results could satisfactorily distinguish the 36 germplasms. The genetic similarity coefficient of all samples ranged from 0.70 to 0.93, averaging 0.815. At the coefficient of 0.75, the 36 germplasms were divided into 4 groups. The results were consistent with the morphological classification. Although the genetic basis for classification was weak, with the aid of ISSR molecular markers, clear identifications for the individual germplasms of the collection were obtained.
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Keywords:
- guava /
- ISSR /
- genetic relationship
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番石榴Psidium guajava L.为桃金娘科番石榴属的常绿灌木或小乔木，原产于美洲秘鲁至墨西哥一带[1]。目前我国各地种植的番石榴基本都是引进品种或通过实生选种所培育的品种，其亲本并不明确。各地在引种过程中引进的同名品种可能是通过同一亲本培育而来的不同品系，在植物学性状上差异细微，常难以区分。采用分子标记法鉴定番石榴亲缘关系，为番石榴选育良种、培育新品和种质创新利用方面提供重要依据。番石榴的研究主要集中在番石榴加工利用、开发产品及少量的药用价值研究，例如番石榴果实用于酿制果醋[2]、加工成果汁、果糕、果脯等[3-6]系列产品；番石榴叶[7-10]具有良好的降血糖作用，对黄曲霉毒素B1所致的大鼠肝癌具有较强的抑制效果，成熟老叶可作染料，嫩叶、芽可制茶，长期饮用具有养颜美容、健脾养胃[11-14]等保健功效。对于番石榴种质资源方面的研究非常欠缺，吴键雄等[15]将ISSR分子标记应用于16份番石榴种质资源亲缘关系的鉴定；赵志常等[16]采用CTAB、SDS和改良的CTAB法分别从新鲜的番石榴叶片中提取DNA，并对其进行琼脂糖凝胶电泳检测和SCoT-PCR分析。
ISSR (inter-simple sequence repeat) 是Zietkeiwitcz等[17]于1994年发展起来的一种微卫星基础上的分子标记。ISSR分子标记引物多态性高, 且1套ISSR引物可以适用于多种作物的遗传分析[18]，是当前应用于大批量种质资源遗传多样性分析的最理想分子标记之一。目前ISSR标记已在茶树、葡萄、金茶花等农作物[19-21]的亲缘关系分析、指纹图谱构建等方面有过突出表现，且其已成功应用于菌类[22]及部分抗性基因鉴定[23]等方面的试验研究。ISSR标记也应用于番石榴的亲缘关系鉴定，但采用的是分辨率较低的琼脂糖凝胶电泳法，且从未将番石榴形态与聚类结果相结合进行系统分析。本研究通过ISSR标记对36份番石榴种质亲缘关系进行分析，筛选出多态性引物，旨在了解36份种质资源之间的亲缘关系，为分析我国番石榴种质资源的遗传关系及日后指纹图谱构建、分子辅助育种等研究提供关键的技术手段。
1. 材料与方法
2015-2016年，在广西亚热带优势作物繁育与综合开发利用重点实验室对36份番石榴种质资源进行遗传多样性和亲缘关系研究。对100条ISSR标记引物进行筛选，利用筛选的引物分别对番石榴种质资源进行多态性分析，试验重复2次。
1.1 试验材料
1.1.1 供试材料
供试番石榴种质资源36份，分别取各种质的幼嫩叶片，硅胶干燥后，于液氮中速冻，快速研磨至粉末状，并迅速分装到1.5 mL离心管中，-70℃保存备用 (表 1)。
表 1 供试资源及取样地点Table 1. Sources of germplasms and sampling sites编号 资源名称 取样地点 1 龙州1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 2 龙州2号 3 龙州3号 4 长果新世纪番石榴 5 圆果新世纪番石榴 6 新世纪实生番石榴 7 新西兰番石榴 8 嘉缘番石榴 9 珍珠番石榴 10 梨形番石榴 11 东兴农家种番石榴 12 汕红番石榴 13 老虎岭番石榴 14 琼番石榴17号 15 泰国大果番石榴 16 全红番石榴 17 维邦1号 18 维邦2号 19 维邦3号 20 景洪1号 云南省西双版纳热作所资源圃 21 景洪2号 22 河口1号 云南省红河热带农业科学研究所 23 河口2号 24 小平田1号 云南省保山市隆阳区热经所 25 小平田2号 26 南宁本地番石榴1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 27 南宁本地番石榴3号 28 南宁本地番石榴6号 29 南宁本地番石榴7号 30 南宁本地番石榴9号 31 南宁本地番石榴10号 32 迷你番石榴 33 南宁本地番石榴实生1号 34 南宁本地番石榴实生2号 35 八桂田园番石榴 36 南宁本地番石榴8号 注：供试种质名称为收集种质时所采用的品种名，品种名不明确的，以收集地或植株果实特征命名。所有供试种质通过嫁接现均保存于广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃内。 1.1.2 试剂与引物
CT法植物基因组DNA提取试剂盒购自HYQbio公司，2x Es Taq MasterMix购自康为世纪生物公司，试验所用引物采用加拿大哥伦比亚大学公布的UBC系列100条引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取
依照HYQ CT法植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取番石榴基因组DNA，得到的DNA产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，稀释至20~30 ng·μL-1，贮于-20℃备用。
1.2.2 ISSR-PCR扩增
20 μL反应体系包括：1 μL引物 (10 μmol·L-1 )，10 μL Taq Master Mix，1 μL DNA模板，ddH2O补足至20 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR产物于8%聚丙烯酰胺凝胶中电泳 (195 V，1 h)，银染 (0.1% AgNO3，摇床银染15 min)，ddH2O冲洗2次 (不超过10 s)，显影 (1.2% NaOH+0.4%甲醛溶液，直至看到条带)，拍照并记录结果。
1.3 数据分析
选取对所有资源均能扩增清晰、多态性丰富的引物进行分析。在相同电泳条件下，凝胶上同一迁移距离处某条可重复带的有无记录 (0，1) 数据矩阵，有记为1，无记为0。利用NTSYSpc2.10e软件进行品种间多态性和相似系数分析，通过非加权配对算术平均法 (UPGMA) 进行聚类分析，建立亲缘关系图。结合供试种质的形态学特征，对聚类分析结果进行分析讨论，验证试验结果是否真实有效。
2. 结果与分析
2.1 ISSR多态性分析
以随机挑选的5份番石榴种质DNA为模板，从100条引物中筛选出9条多态性较丰富且稳定的引物用于36份材料的扩增 (表 2)。9条引物共扩增得到条带165条，其中多态性条带129条，多态性条带占比为78.18%。单条引物扩增的条带为13~28条，平均为18.33条。扩增条带最多的引物为UBC890(图 1)，达28条，最少的为引物UBC857，为13条。每条引物的多态性带比例均高于50%，大部分在80%~100%。
表 2 ISSR引物序列及其扩增结果Table 2. ISSR primer sequence and amplification引物编号 引物序列 总条带数/条 多态性条带/条 多态性带比例/% UBC810 gagagagagagagagat 15 13 86.67 UBC811 gagagagagagagagac 22 19 86.36 UBC812 gagagagagagagagaa 20 16 80 UBC841 gagagagagagagagayc 20 12 60 UBC842 gagagagagagagagayg 16 9 56.25 UBC857 acacacacacacacacyg 13 13 100 UBC861 accaccaccaccaccacc 14 9 64.29 UBC889 dbdacacacacacacac 17 12 70.59 UBC890 vhvgtgtgtgtgtgtgt 28 26 92.86 合计 165 129 78.18 2.2 聚类结果
36份番石榴种质资源间遗传相似系数为0.70~0.93，平均遗传相似系数为0.815。根据UPGMA聚类结果，在遗传系数0.75处，将36份种质资源分成4组 (图 2)。第1组包含13份种质 (编号1~13号)，这组种质除海南引进的汕红番石榴，新西兰引进的新西兰番石榴和广西引进的龙州1、2、3号农家种番石榴外，其余都是珍珠番石榴和新世纪番石榴及其变异株，故聚为一类进行分析。珍珠番石榴与新世纪番石榴自引进入圃后，在其后几年的种植过程中发生了不同程度的变异，部分植株已表现出与母株完全不同的明显差异，故以其收集地点名称或植物学特征对各个变异株进行重新命名和编号，作为单份试验材料进行亲缘关系鉴定。聚类分析结果显示，大部分的种质在种植过程中出现的植物学性状上的差异为遗传层面的差异。其中长果新世纪与圆果新世纪由于遗传相似系数极为接近而无法区分，表明其尚未发生遗传层面的变异。第2组种质资源 (编号14~16号，编号20~25号) 均为外省引进品种，具体为云南引种6份 (编号20~25号)、福建1份 (编号14号)、广东1份 (编号16号) 和泰国1份 (编号15号)。从同一地区引进的种质资源遗传相似系数差异不大，因而说明其亲缘关系相对较近，说明同地区种质资源间可能存在同种进化变异，在自然变异过程中相近种质间相互影响等现象。第3组种质资源 (编号26~36号) 全部是南宁本地及其周边引进品种，除迷你番石榴与该组其他种质在植物学性状上存在较明显的差异外，其余种质从植物学角度观察，差异不显著。但迷你番石榴与其他种质收集地属同一区域，遗传相似系数也非常接近，与第2组出现的情况相类似，故聚为同一组。第4组包含3份种质 (编号17~19号)，其收集地点均为南宁市维邦公司，3份种质在植物学性状上差距极不显著，遗传系数也较近，故聚为一小类。这组种质极有可能由同一亲本发生遗传变异产生，但由于时间较久远，现在已无法找到其准确的母本品种。
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图 2 番石榴种质资源的UPGMA聚类注：1~36为资源编号同表 1；A、B、C、D分别对应为聚类分析中的第1组、第2组、第3组、第4组。Figure 2. UPGMA dendrogram of guava germplasms2.3 类组分析
聚类分析第1组 (编号1~13号) 中，龙州1、2、3号番石榴均引自广西龙州县，与东兴农家种番石榴一样，为引种地的地方品种。其中龙州1、3号与东兴农家种植株形态特征极其相似，仅在嫩叶颜色上有细微差异；龙州1号的嫩叶颜色与另2份种质的黄绿色不同，其边缘稍带一点红色，聚类分析发现这3份种质的亲缘关系很近。而聚类分析发现龙州2号与海南引种的汕红番石榴的亲缘关系比较接近，二者在形态上更为接近，都是青皮红肉番石榴，但龙州2号果实个体较小。嘉缘番石榴、梨形番石榴、老虎岭番石榴都属于珍珠番石榴的变异株，其形态特征与珍珠番石榴极其接近，但又有细微差别；嘉缘番石榴、老虎岭番石榴的植株叶形与珍珠番石榴的长椭圆形不同，呈披针形；梨形番石榴的果形则与珍珠番石榴的偏梨形 (部分呈扁圆形) 不同，呈标准的梨形；在果实品质方面，嘉缘番石榴果实个体最大，可溶性固体物含量相对较高，梨形番石榴果实口感疏松绵软，与珍珠番石榴的脆爽大相径庭。聚类分析结果也表明，这几份变异种质与母株相比，发生了遗传层面的变异。新西兰番石榴植株在外观上更接近珍珠番石榴，最明显的差异在于二者的果实；新西兰的果形多呈长椭圆形，果实个体较大，成熟果皮颜色与珍珠番石榴的淡黄色不同，为淡青色；遗传相似系数显示，二者的亲缘关系也较近。长果新世纪与圆果新世纪均为新世纪变异株，其在引种中均标记为新世纪番石榴，但在几年的种植过程中植株发生变异，特别是果形上出现明显差异，故此次试验将其作为2份种质进行分析，不过聚类结果显示，其并未发生遗传层面变异。
聚类分析的第2组包含9份种质，其中广东引进的全红番石榴，福建引进的琼番石榴17号都与其他种质在形态上存在明显差异；全红番石榴以其红叶、红花、红果的形态特征而得名，琼番石榴17号与全红番石榴同为红肉番石榴，不过其果皮颜色为淡青色，植株树势较开放，主梢特别光滑；聚类结果发现，二者的亲缘关系很近。泰国番石榴据认为是新世纪番石榴的母株，新世纪番石榴由其自然选育而得来[24]，故二者在形态上极为接近，但泰国番石榴果实个体大 (单果重可达500 g以上)，因而被称为泰国大果番石榴；可能由于新世纪番石榴自然进化的时间比较长，与泰国番石榴在遗传层面上的变异比较多，聚类分析结果发现，二者的亲缘关系较远。第2组中的另外6份种质全部引自云南省，都是引种地地方品种。除河口2号果皮颜色为淡黄色外，其余种质果皮均为青色。6份种质的果实个体都比较小 (平均单果重低于150 g)，植株形态差异也不明显。聚类结果显示，6份种质的亲缘关系较近。
聚类分析的第3组包含11份种质，除迷你番石榴外，全部为南宁本地品种；其中八桂田园番石榴与珍珠番石榴的形态极其相似，但聚类分析结果显示，2份种质之间的亲缘关系较远，其反而与南宁本地各种质的亲缘关系较近。南宁本地番石榴1、3、6、7、8、9、10号以及南宁本地实生1、2号番石榴的植株差异都非常小，其明显差异主要体现在果实上。南宁本地1号为青皮红肉番石榴，香味浓郁，果肉软糯；南宁本地3号果形为偏梨形，白肉；南宁本地6号果实颜色呈明显淡黄色；南宁本地7号果形为标准的柚子形；南宁本地9号为红肉番石榴，果肉较硬，香味淡；南宁本地10号果形为偏球形，白肉；以上种质的果实个体都较小，平均单果重一般不高于200 g。南宁本地实生1、2号番石榴在引种时都标记为南宁本地实生番石榴，在种植过程中本地实生2号的树势发生变化，较实生1号开放，叶形为长椭圆形，叶片较扩张，故在此作为2份种质进行分析，聚类分析结果表明，二者发生了遗传层面变异。总体而言，南宁本地各种质间的亲缘关系非常近。迷你番石榴因其植株叶片迷你、果实小而得名，其叶片大概仅成人拇指指甲大小，平均单果重仅15 g，但其叶形、树势等形态与该组其他种质接近，聚类结果显示，其遗传相似系数与南宁本地各种质也较接近，说明它们的亲缘关系较近。
聚类分析的第4组包含3份种质，全部引自南宁市维邦公司，形态上的差异主要在于果实。维邦1号果实呈标准梨形，为青皮白肉番石榴；维邦2号成熟果皮颜色为淡黄色透粉红色，香气浓郁，果肉颜色为淡黄色；维邦3号果实与维邦2号相像，但果实个体更小，与2号果形的偏梨形不同，3号果形更偏椭圆形。3份种质的聚类结果显示它们的亲缘关系非常近。
3. 讨论与结论
番石榴植株适应性强，果实采收期长，种植见效快。但番石榴属于南方小宗优稀果树，正式通过品种审定与命名的品种非常少，且缺乏大规模种植生产与有效的管理，在全国各地的引种过程中常常以引种地点名称或种质特征加以命名，因而极易出现同一品种命名，实质却并非同一品种的现象。且同一品种的番石榴植株在同一地区种植超过几年之后极易受到自然环境影响或与其地理位置相近的其他植株相互影响而产生变异株，类似于本试验中出现的各种珍珠番石榴变异株与新世纪番石榴变异株，这些变异株大部分形态特征差距都极其不明显，有些发生了遗传变异；有些则仅为饰变，类似本试验中的长果番石榴与圆果番石榴的现象；因而需要寻求一种简单有效的方法将这些资源从遗传层面进行甄别，而后方能更好的保护并加以利用。
本试验是首次将36份番石榴种质研究应用于ISSR-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳分析法，试验经过重复验证，结果相同，说明试验结果真实有效。本研究也首次将番石榴形态分析与分子聚类分析相结合，在遗传相似系数0.75处，将36份资源分成4组；聚类结果与形态学分类结果基本一致，说明ISSR分子标记法可对不同番石榴种质分类，归为一类的种质往往具有来自同一产地或者具有遗传背景相似等特点，为今后番石榴种质资源研究鉴定和批量进行番石榴种质资源分类工作提供了一定的理论依据。但由于供试材料与技术的局限性，无法提供确切的番石榴属间与种间材料对比，成为本次试验的空白，在随后的工作中将结合其他技术手段，为番石榴种质资源利用和保护打下更为坚实的基础。
另外，番石榴叶富含多糖多酚物质[7]，前人采用改良的CTAB方法，加入漂洗液2次洗涤，能够较好地去除杂质，得到较高质量的DNA[16]。本研究发现在提取番石榴DNA的过程中可以采用加入Tris-酚的方法或使用特殊的植物DNA提取试剂盒，也可达到去除多酚等杂质的目的，得到的DNA可以很好地应用于后续的PCR反应。本试验是在前人研究的基础上，对番石榴植株、果实形态进行了观察，结合了分子标记对番石榴进行了亲缘关系远近的鉴定。由于材料的局限性，36份种质的亲缘关系都较近；但分子聚类结果与形态分析结果相契合，说明ISSR分子标记可以较好地鉴别这些种质资源。
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图 2 番石榴种质资源的UPGMA聚类
注：1~36为资源编号同表 1；A、B、C、D分别对应为聚类分析中的第1组、第2组、第3组、第4组。
Figure 2. UPGMA dendrogram of guava germplasms
表 1 供试资源及取样地点
Table 1 Sources of germplasms and sampling sites
编号 资源名称 取样地点 1 龙州1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 2 龙州2号 3 龙州3号 4 长果新世纪番石榴 5 圆果新世纪番石榴 6 新世纪实生番石榴 7 新西兰番石榴 8 嘉缘番石榴 9 珍珠番石榴 10 梨形番石榴 11 东兴农家种番石榴 12 汕红番石榴 13 老虎岭番石榴 14 琼番石榴17号 15 泰国大果番石榴 16 全红番石榴 17 维邦1号 18 维邦2号 19 维邦3号 20 景洪1号 云南省西双版纳热作所资源圃 21 景洪2号 22 河口1号 云南省红河热带农业科学研究所 23 河口2号 24 小平田1号 云南省保山市隆阳区热经所 25 小平田2号 26 南宁本地番石榴1号 广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃 27 南宁本地番石榴3号 28 南宁本地番石榴6号 29 南宁本地番石榴7号 30 南宁本地番石榴9号 31 南宁本地番石榴10号 32 迷你番石榴 33 南宁本地番石榴实生1号 34 南宁本地番石榴实生2号 35 八桂田园番石榴 36 南宁本地番石榴8号 注：供试种质名称为收集种质时所采用的品种名，品种名不明确的，以收集地或植株果实特征命名。所有供试种质通过嫁接现均保存于广西壮族自治区亚热带作物研究所番石榴种质资源圃内。 
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表 2 ISSR引物序列及其扩增结果
Table 2 ISSR primer sequence and amplification
引物编号 引物序列 总条带数/条 多态性条带/条 多态性带比例/% UBC810 gagagagagagagagat 15 13 86.67 UBC811 gagagagagagagagac 22 19 86.36 UBC812 gagagagagagagagaa 20 16 80 UBC841 gagagagagagagagayc 20 12 60 UBC842 gagagagagagagagayg 16 9 56.25 UBC857 acacacacacacacacyg 13 13 100 UBC861 accaccaccaccaccacc 14 9 64.29 UBC889 dbdacacacacacacac 17 12 70.59 UBC890 vhvgtgtgtgtgtgtgt 28 26 92.86 合计 165 129 78.18
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