硒是人体必需的微量元素之一，具有防治肿瘤、克山病、大骨节病和防癌抗癌及延缓机体衰老的作用，生物源有机硒在生理和药理上的功效比无机硒更优越，且对人体安全无毒副作用^[1-2]。姬松茸Agaricus blazei Murill.又称巴西蘑菇、小松菇，作为滋补防病的食药用真菌之一，在调节免疫功能、抗癌、降血脂、安神等方面具有独特功效，而使其产生神奇疗效的主要活性物质是多糖和蛋白质等^[3-6]，且该菌类菌丝体富硒能力较强^[7]，能够实现硒的有机化转变，已有研究发现其菌丝硒多糖对动物癌性恶病质有代谢调节作用^[8-9]，因此，富硒培养出的姬松茸多糖产品，集活性多糖和有机硒于一体，可作为一种新型高效的保健品来源。食用菌子实体和液体发酵菌丝体都可作为多糖提取的原料，两者所提取的多糖在含量与药理效果上较接近，甚至很多菌类菌丝体的多糖含量和药理效果优于子实体^[10]。现阶段姬松茸多糖主要从子实体中提取，但子实体栽培对环境要求较严，生产周期长(达半年之久)，劳动强度大，产量和品质无法保证，且易出现重金属富集问题；而采用液体发酵技术生产菌丝体，可避免上述弊端，生产周期短(约半个月)，菌丝体产量大，生产成本低，便于工业化生产。目前，从姬松茸菌丝体中提取多糖的研究报道较少^[11-13]，也尚未有该菌类富硒菌丝体多糖提取工艺的相关报道，本研究以液体发酵获得的姬松茸富硒菌丝体为原料探讨多糖提取方法，通过单因子试验和正交试验对菌丝体多糖的热水浸提条件进行了优化，以期获得最佳工艺，为进一步研发富硒菌丝多糖保健品提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与设备

1.1.1   材料与试剂

姬松茸富硒菌丝体通过液体发酵获得，液体发酵培养基采用前期试验筛选出的配方：玉米粉3%、葡萄糖2%、硫酸铵0.2%、酵母膏0.3%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄·7H₂O 0.1%、维生素B₁ 0.01%，pH 7.0^[14]，添加硒15 μg·mL^-1。主要试剂为无水乙醇、丙酮、葡萄糖、苯酚、浓硫酸等，均为分析纯。

1.1.2   仪器与设备

JA2003型电子天平，SCS-24型往复式水平摇床，701-4型电热干燥箱，PK-121R型离心机，HH-l型数显恒温水浴锅，RE-52型旋转蒸发器，AFS-230 E型荧光分光光度计，UV-752型分光光度计。

1.2   试验方法

1.2.1   富硒菌丝干粉制备

1 000 mL三角瓶装液体发酵培养基250 mL，灭菌冷却后接入姬松茸菌种，置于25℃恒温往复式摇床中，以转速80 r·min^-1培养10 d，即可得到大量菌丝体，双层纱布过滤并冲洗干净，于60℃烘干后研磨成粉状，过80目筛备用。

1.2.2   粗多糖提取

采用热水浸提法提取多糖。称取1 g菌丝粉→加若干比例水→置于适当温度的热水中浸提一定时间→离心(4 000 r·min^-1，20 min)→重复提取若干次后收集上清液并旋转蒸发(60~70 r·min^-1，90℃)至黏稠状→加入适当浓度乙醇沉淀24 h→离心(4 000 r·min^-1，20 min)→沉淀物用无水乙醇、丙酮洗涤2~3次→真空冷冻干燥得菌丝体粗多糖。其中料水比(菌丝干重g:蒸馏水体积mL)、乙醇沉淀浓度和浸提温度、时间及次数为本研究单因素试验的5个考查因素。

1.2.3   试验指标测定

将供试菌丝体粗多糖复溶到100 mL蒸馏水中，沸水浴30 min后定容至250 mL，采用苯酚-硫酸法^[15]测出吸光度，重复3次取平均值，通过葡萄糖标准曲线回归方程(y=12.06x+0.4355，R²=0.9962) 和公式[多糖提取量/(mg·g^-1)=多糖量mg/菌丝干重g]计算出多糖提取量。富硒菌丝体多糖中硒的含量测定采用原子荧光法^[16]。

1.2.4   单因素试验设计

将料水比1:30(g·mL^-1)、浸提温度80℃、浸提时间3 h、浸提次数3次和乙醇沉淀质量分数80%作为多糖提取的基本条件，分别对这5个考查因素进行筛选试验，各考查因素设置不同水平，其他条件同上。料水比设置梯度为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50和1:60(g·mL^-1)，浸提温度设置梯度为60、70、80、90和100℃，浸提时间设置梯度为0.5、1、2、3、4和5 h，浸提次数设置梯度为1、2、3、4和5次，乙醇沉淀质量分数设置梯度为60%、70%、80%、90%和100%，每个梯度处理3次重复。

1.2.5   正交试验设计

根据以上单因素试验结果，选取正交试验的因素和水平，按照L₉(3⁴)正交设计进行试验，每个参数组合进行3次平行重复试验取平均值，通过分析试验结果后确定最佳工艺参数组合。

2.   结果与分析

2.1   料水比对多糖提取量的影响

从图 1可看出，料水比在1:10~1:50(g·mL^-1)范围内，多糖提取量随料水比降低而增加，这是因为姬松茸富硒菌丝体多糖能够溶解于水中，而且随着料水比的降低(即水的比例逐渐增大)，多糖溶出越容易，故多糖提取量随之增加。当料水比为1:60(g·mL^-1)时，因水比例过大导致多糖提取过程中损耗量增加，从而造成提取量略减少。另外，当料水比为1:10~1:30(g·mL^-1)，多糖提取量增加显著，而料水比为1:30~1:50(g·mL^-1)，多糖提取量增幅趋缓，说明此时多糖溶解基本达到了平衡势。在实际生产中，料水比过小，后续浓缩操作难度会增大，且能耗也会增加，故选取料水比1:30(g·mL^-1)。

图  1  料水比对多糖提取量的影响

Figure  1.  Effect of sample/water ratios on extraction yield of polysaccharides

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2.2   浸提温度对多糖提取量的影响

从图 2可看出，随着浸提温度的升高，多糖提取量呈现先缓慢增加后减少的趋势。浸提温度 < 90℃时，热作用可以加快分子运动速度，从而降低溶液黏度，促使菌丝胞内多糖向外扩散，故多糖提取量随温度升高而快速增加，当温度为90℃时多糖提取量最大(达62.5 mg·g^-1菌丝干重)。此后继续升高温度，多糖由于热不稳定性发生分解，导致提取量减少。此外，温度越高，对设备要求也越高，能耗也越大，故初步选择浸提温度为90℃。

图  2  浸提温度对多糖提取量的影响

Figure  2.  Effect of temperature on extraction yield of polysaccharides

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2.3   浸提时间对多糖提取量的影响

从图 3可看出，浸提时间为0.5~3 h，多糖提取量随着时间的延长而逐渐增加，当时间达到适宜值即3 h时，多糖充分溶解并达到平衡，故提取量也最多；继续延长时间，因浸提过程中长时间的加热，使一部分多糖发生降解，导致提取量呈现减少趋势。因此，浸提时间选择3 h为佳。

图  3  浸提时间对多糖提取量的影响

Figure  3.  Effect of duration on extraction yield of polysaccharides

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2.4   浸提次数对多糖提取量的影响

从图 4可看出，浸提次数在3次以下时，多糖提取量随浸提次数的增多而快速增加，而浸提次数超过3次后多糖提取量增幅甚微。说明随着提取次数的增加，细胞中未提取出来的多糖被逐渐浸出，当提取次数超过3次，多糖基本上完全溶解出来了。综合考虑浸提效率和经济成本等，确定适宜浸提次数为3次。

图  4  浸提次数对多糖提取量的影响

Figure  4.  Effect of repeated cycles on extraction yield of polysaccharides

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2.5   乙醇沉淀对多糖提取量的影响

多糖是极性大分子化合物，溶于水却不溶于醇，因此采用乙醇可沉淀出多糖。从图 5可看出，随着乙醇沉淀质量分数的提高，多糖提取量呈现先增加后减少的趋势。当乙醇沉淀质量分数在60%~90%，多糖提取量呈明显增加趋势；当乙醇沉淀质量分数为90%时，醇析效果最好，多糖提取量最高；当乙醇沉淀质量分数超过90%后，多糖提取量基本趋于稳定。因此，初步选取乙醇沉淀质量分数为90%。

图  5  乙醇沉淀质量分数对多糖提取量的影响

Figure  5.  Effect of ethanol concentration for precipitation on extraction yield of polysaccharides

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2.6   热水浸提法提取姬松茸富硒菌丝体多糖的正交试验

正交设计见表 1，试验结果见表 2。从表 2可看出，姬松茸富硒菌丝体多糖的最佳提取条件组合为A₃B₂C₁D₃，即料水比1:35(g·mL^-1)、乙醇沉淀质量分数90%、浸提温度85℃、浸提时间3.5 h。在此条件下进行验证试验，重复3次取平均值，得出富硒菌丝多糖的提取量及其硒含量分别为69.5 mg·g^-1和12.1 μg·g^-1(干菌丝体)，提取效果好且试验误差较小，说明该工艺条件较为稳定可靠。方差分析发现，在姬松茸富硒菌丝体多糖提取过程中，料水比、乙醇沉淀质量分数、浸提温度和浸提时间均为不显著因素；这4个因素对多糖提取效果的影响大小依次为：料水比>乙醇沉淀质量分数>浸提温度>浸提时间，其中料水比和乙醇沉淀浓度的影响程度明显大于其他2个因素，对所提取多糖中硒含量的影响大小依次为：乙醇沉淀质量分数>浸提时间>料水比>浸提温度，其中乙醇沉淀质量分数影响程度明显大于其他3个因素，因此实际生产中应调控好各参数尤其是乙醇沉淀质量分数和料水比。

表  1  L₉(3⁴)正交试验因素及水平

Table  1.  Factors and levels of L₉(3⁴) orthogonal test

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表  2  L₉(3⁴)正交试验结果与分析

Table  2.  Results of L₉(3⁴) orthogonal test and analysis

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3.   讨论与结论

采用单因素试验和正交试验，通过综合分析试验结果后得出，热水浸提法提取姬松茸富硒菌丝多糖的最佳条件为：料水比1:35(g·mL^-1)、乙醇沉淀质量分数90%、浸提次数3次、浸提温度85℃、浸提时间3.5 h，在此条件下，通过验证试验进一步表明，姬松茸富硒菌丝体多糖的提取量及其硒含量分别达到69.5 mg·g^-1和12.1 μg·g^-1(菌丝干重)。

真菌多糖提取方法主要有热水浸提法、酸提取法、碱提取法和酶提取法等，其中热水浸提法较简单，成本也低，提取效率较高，故本试验采用此法。与姬松茸菌丝多糖提取有关的研究结果相比，本试验的多糖提取量与黄翔宇用热水浸提法得出的结果^[17]较接近，又明显低于姜荷报道的用冷碱法所提取的^[18]。但从总体上来看，本研究所建立的工艺简单、稳定、可行，且经济成本低、适用于姬松茸富硒菌丝体多糖的提取，可为深入研发姬松茸等食用菌富硒菌丝多糖保健品提供理论依据。

食用菌等真菌液体发酵过程中菌丝体代谢产生的多糖有两种存在方式，一种是蓄积在菌丝体内(称为胞内多糖)，另一种是从菌丝体分泌出来附着在菌丝体表面或释放到发酵液中(称为胞外多糖)，本研究仅对姬松茸富硒菌丝胞内多糖提取条件进行优化，而胞外多糖的含量与提取工艺等还有待于进一步探讨。