Isolation, Identification and Fungicide Toxicity of Ustilaginoidea virens
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摘要: 为优化稻绿核菌的分离方法，筛选防控稻曲病的有效药剂，采用孢子敲落法和火焰灼烧法分别分离不同成熟度的稻曲球，从形态学、致病性、rDNA-ITS序列等方面对HP-7菌株进行鉴定，并通过菌丝生长抑制法测定了HP-7菌株对7种杀菌剂的敏感性。结果表明，采用孢子敲落法分离鲜黄色稻曲球成功率最高，达98.33%，将HP-7菌株的rDNA-ITS序列在NCBI上进行BLAST比对，菌株HP-7与稻绿核菌相似度达99%，结合形态学特征分析确定HP-7为稻绿核菌。离体试验表明，戊唑醇和嘧菌酯对稻绿核菌的菌丝生长抑制作用最强，其EC50值分别为0.109 1、0.158 5 mg·L-1。其结果可为稻绿核菌的分离鉴定及稻曲病防控提供理论参考。Abstract: Two methods for isolating HP-7 (Ustilaginoidea virens) and 7 fungicides for controlling the false smut disease on rice caused by the pathogen were compared. Fungal spores at different maturation stages were separated by means of shaking or flame burning. HP-7 was verified by its morphology, pathogenicity, and rDNA-ITS sequences. The sensitivity of HP-7 toward and toxicity on the fungi by the fungicides were determined based on the fungal mycelium growth under treatment. It was found that the successful rate in separating the fresh yellow chiamydospores by shaking was up to 98.33%, which was better than the flaming method. The rDNA-ITS sequences of HP-7 were submitted to NCBI for a BLAST analysis that showed a 99% homogeny with U. virens. Combining that result with the morphological observations, HP-7 was verified to be the pathogen that caused the rice false smut. Among the fungicides tested, tebuconazole and azoxystrobin exhibited the highest inhibition rates on HP-7, with EC50 at 0.109 1 and 0.158 5 mg·L-1, respectively. It appeared that an effective spore separation method was identified, and the positive identification and appropriate selection on fungicide for effective control of the false smut disease on rice crops were obtained.
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Keywords:
- rice false smut /
- Ustilaginoidea virens /
- identification /
- laboratory toxicity test
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0. 引 言
【研究意义】 植物甾醇是一类生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、预防和治疗心脑血管疾病等作用[1-3]。铁皮石斛（Dendrobium officinale）是名贵中药材，具有增强免疫力、降血糖和抗肿瘤等生理活性[4-5]。已有研究表明铁皮石斛含有豆甾醇、β谷甾醇、γ-谷甾醇和油菜甾醇等植物甾醇类次生代谢产物[6-7]。鲨烯单加氧酶（Squalene Monooxygenase，SQE）又称鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase, SE），催化角鲨烯生成2,3-氧化鲨烯[8-9]。环阿屯醇合酶（Cycloartenol synthase, CAS）催化2,3-氧化鲨烯形成环阿屯醇，代谢流向植物甾醇；羽扇豆醇合成酶（Lupeol synthase, LS）、β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase, β-AS）和达玛烯二醇合成酶（Dammarenediol synthase, DS）催化2,3-氧化鲨烯形成羽扇豆醇、β-香树脂醇和达玛烯二醇，代谢转向三萜类生物合成通道[10-13]。因此，SQE是植物甾醇和三萜类物质合成途径的一个关键限速酶。开展铁皮石斛SQE基因的克隆及表达模式分析，对探讨铁皮石斛植物甾醇生物合成分子机制及代谢调控具有重要的意义。【前人研究进展】 孙蓉等[14]克隆了金龙胆草（Conyza blinii H. Lev）CbSQE基因，编码525个氨基酸，构建了原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。祝传书等[15]克隆了雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）TwSE1和TwSE2基因，具76.18%相似性，TwSE1基因在花中表达量最高，TwSE2基因在花和嫩叶中的表达量最高，均受MeJA诱导上调表达，上调幅度TwSE1基因高于TwSE2基因。王学方等[16]对17种大戟科（Euphorbiaceae）植物的SE分析发现只有蓖麻（Ricinus communis）4和木薯（Manihot esculenta）1的SQE具有信号肽；5个没有跨膜结构域，7个只在N末端有跨膜结构域，5个N末端和C末端都有跨膜结构域。此外，在人参（Panax ginseng）[17]、绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）[18]、野三七（Panax vietnamensis var. fuscidiscus）[19]、金铁锁（Psammosilene tunicoides）[20]等药用植物也开展了SQE基因的克隆研究。【本研究切入点】目前，未见铁皮石斛SQE基因的相关研究报道。【拟解决的关键问题】本课题组通过铁皮石斛茎和叶的转录组测序，分析了植物甾醇的生物合成途径相关基因[21]，获得2个带5′末端的SQE基因片段，以此为基础开展全长cDNA及ORF克隆和表达模式分析。本研究通过已获得2个带5′末端的SQE基因片段设计3′RACE引物，克隆基因全长cDNA序列和ORF，并分析2个基因在不同营养生长期铁皮石斛茎和叶中的表达模式，以期为进一步研究铁皮石斛SQE基因功能及植物甾醇生物合成分子机制和代谢调控奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
植物材料为福建冠豸山种源铁皮石斛，2017年种于亚热带农业研究所温室大棚，基质为松树皮，光照强度8 000～10 000 lx，空气相对湿度70%～90%。于不同营养生长期（2018年8月、10月、12月）取铁皮石斛的茎和叶，每个样品3重复，超低温冰箱−80℃保存，用于RNA提取。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和cDNA合成
按照TaKaRa的RNAiso Plus说明提取铁皮石斛茎、叶的总RNA，检测RNA的质量和浓度。以提取的总RNA为模板，随机引物逆转录合成cDNA第l链。
1.2.2 DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA的克隆
根据已经获得的DoSQE1与DoSQE2基因信息设计用于3′RACE的引物及接头引物（表1）。取8月、10月、12月铁皮石斛茎和叶的cDNA各10 μL混合作为模板，用引物3DoSQE1F1和dT-adaptor、3DoSQE2F1和dT-adaptor分别进行PCR。把PCR产物稀释10倍作为模板，3DoSQE1F2和adaptor、3DoSQE2F2和adaptor进行巢式PCR。反应体系25 μL：ddH2O 8.5 μL，上下游引物（10 μmol·L−1）各1 μL，2×SanTaq PCR Mix 12.5 μL，模板2 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经电泳检测后，胶回收目的片段，与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后涂LB平板（含100 mg·L−1氨苄青霉素），选择经菌落PCR鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
表 1 PCR引物序列信息Table 1. Sequence of PCR primers引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence（5′-3′）引物用途
Primer usage3DoSQE1F1 CCTTCCATTGCTAACGGAGAGA DoSQE1基因 3′RACE引物3′RACE primers of DoSQE1 3DoSQE1F2 CCTGGAGCACTTCTAATGGGAG 3DoSQE2F1 CTCTTCCTACACCTGGAGCACT DoSQE2基因3′RACE引物 3′RACE primers of DoSQE2 3DoSQE2F2 TATACCTTGCGTAAGCCCGTTG dT-adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′RACE接头引物 Adaptor primers of 3′RACE adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCC DoSQE1F CGCGGTACCATGATGCTTCTCCAGTACA DoSQE1基因ORF克隆引物 primers of DoSQE1 ORF clone DoSQE1R CGCGTCGACGGAGTTCTCATTGTGTAGG DoSQE2F CGCGGTACCATGGTGATGCCACTTTCGTA DoSQE2基因ORF克隆引物 primers of DoSQE2 ORF clone DoSQE2R CGCGTCGACGTTGGAAGTTCACCCACGAG DoSQE1-F AGGACGCAAACAGCGAGAG DoSQE1基因表达分析引物 Expression analysis primers of DoSQE1 DoSQE1-R CACCAACGATTCTATGAGGC DoSQE2-F CCCCAGATACCGAGTCAG DoSQE2基因表达分析引物 Expression analysis primers of DoSQE2 DoSQE2-R CCCATCAGAAGTGCTCCAG DoACT-F AGGAAGGCGGCTTTGAATC 内参基因 Reference gene DoACT-R CCATGCCAACCATGACACC 注：下划线碱基为酶切位点。
Note：The ud bases were the enzyme site.1.2.3 DoSQE1与DoSQE2基因ORF的克隆
根据DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA序列设计DoSQE1基因的ORF克隆引物DoSQE1F（带Kpn Ⅰ酶切位点）与DoSQE1R（带Sal Ⅰ酶切位点）和DoSQE2基因的ORF克隆引物DoSQE2F（带Kpn Ⅰ酶切位点）与DoSQE2R（带Sal Ⅰ酶切位点），产物长度分别为1 579 bp和1 645 bp（表1）。以2 μL混合的cDNA为模板，PCR扩增体系和反应程序同上，延伸时间90 s。阳性克隆送去测序。
1.2.4 DoSQE1与DoSQE2基因的生物信息学分析
ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析DoSQE1与DoSQE2基因编码蛋白的理化性质，蛋白跨膜区预测利用TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/），二级和三级结构预测使用在线工具SSPro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）。采用NCBI的BLAST P搜索DoSQE1与DoSQE2基因编码蛋白的同源序列及保守结构域，通过MEGA6.0（Neighbor Joining Tree, Bootstrap 1000）构建系统进化树[22]。
1.2.5 DoSQE1与DoSQE2基因的表达分析
设计DoSQE1基因引物DoSQE1-F和DoSQE1-R、DoSQE2基因引物DoSQE2-F和DoSQE2-R、内参Actin基因引物DoACT-F和DoACT-R（表1）用于荧光定量PCR。把不同月份茎和叶的cDNA浓度定量为200 ng·μL−1。用Roche LightCycler 96检测DoSQE1与DoSQE2基因在不同生长期铁皮石斛茎和叶中的表达量。反应体系为：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O补足 20 μL。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，45个循环；每个反应设置 3 个重复。利用2−∆∆CT法分析相对表达量[23]，DPS数据处理软件对结果进行方差分析，多重比较采用新复极差法（Duncan法）。
2. 结果与分析
2.1 DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA的克隆
以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用3′RACE引物进行巢式PCR扩增DoSQE1与DoSQE2基因3′末端，DoSQE1与DoSQE2基因分别得到1条特异条带，约800 bp和680 bp（图1-A、C），目的条带经过胶回收、连接、转化和克隆验证后送去测序、测序结果利用DNAMAN V6.0进行序列拼接及ORF预测，获得DoSQE1基因cDNA序列全长1 796 bp（GenBank 登录号MT160182），含有1个1 554 bp的ORF，编码517个氨基酸，5′末端非翻译区24 bp，3′末端非翻译区218 bp；DoSQE2基因cDNA序列全长1 963 bp（GenBank 登录号MT160183），含有1个1 578 bp的ORF，编码525个氨基酸，5′末端非翻译区127 bp，3′末端非翻译区258 bp。
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图 1 PCR产物电泳结果注：M. 分子量标记；A. DoSQE1基因3′RACE；B. DoSQE1基因开放阅读框；C. DoSQE2基因3′RACE；D. DoSQE2基因开放阅读框。Figure 1. PCR products by electrophoresisNote: M. DNA marker; A. 3′RACE of DoSQE1; B. ORF of DoSQE1; C. 3′RACE of DoSQE2; D. ORF of DoSQE2.2.2 DoSQE1与DoSQE2基因开放阅读框的克隆
以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用扩增ORF的引物扩增DoSQE1与DoSQE2基因的ORF，电泳结果显示，DoSQE1与DoSQE2基因分别得到1条约1 579 bp和1 645 bp的特异条带（图1-B、D），大小与预测一致。PCR产物经过克隆及验证后送去测序，测序结果经DNAMAN V6.0比对，结果表明获得了DoSQE1与DoSQE2基因ORF，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%。提取阳性克隆的质粒pMD19-T-DoSQE1和pMD19-T-DoSQE2超低温冰箱保存。
2.3 DoSQE1与DoSQE2蛋白基本性质分析
利用ProtParam tool在线分析DoSQE1与DoSQE2蛋白的理化性质。结果表明，DoSQE1蛋白的分子量为56.235 kD，理论等电点为8.96，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为45，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为55，不稳定系数是44.92，总平均疏水性是0.084，属于一种不稳定的疏水性蛋白。DoSQE2蛋白的分子量为56.541 kD，理论等电点为8.77，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为46，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为53，不稳定系数是39.66，总平均疏水性是0.137，属于一种稳定的疏水性蛋白。使用TMHMM Server v.2.0预测DoSQE1与DoSQE2蛋白跨膜区，结果显示（图2），DoSQE1具有2个跨膜区，分别在4～22 aa和55～72 aa；DoSQE2只有1个跨膜区，在5～23 aa。DoSQE1蛋白在204～476 aa、DoSQE2蛋白在211～484 aa处含有鲨烯环氧酶结构域，E值分别为1.32×10−157和3.04×10−154。
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图 2 DoSQE1与DoSQE2蛋白跨膜区预测Figure 2. Predicted transmembrane regions in DoSQE1 and DoSQE22.4 DoSQE1与DoSQE2蛋白空间结构分析
SSPro在线预测DoSQE1与DoSQE2蛋白二级结构结果（图3）表明，DoSQE1和DoSQE2形成无规则卷曲氨基酸残基分别有207（40%）和231（44%）个，形成α螺旋氨基酸残基分别为232（44.9%）个和216（41.1%）个，形成β折叠氨基酸残基都是78个，分别占15.1%和14.9%。通过SWISS-MODEL在线预测，DoSQE1与DoSQE2蛋白3D结构如图4，同源建模的模板都是6c6n.1.A，一致性分别为48.07%和47.37%，建模范围在51～496和78～504位氨基酸残基，覆盖率85%和80%。
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图 3 铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2蛋白的二级结构预测注：大写字母：氨基酸序列；小写字母：二级结构；c：无规则卷曲；h：α螺旋；e：β折叠。Figure 3. Predicted secondary structures of DoSQE1 and DoSQE2 from D. officinaleNote:capital letters show amino acid sequence; lowercase letters show amino acid chain structure, as c for random coil, h for α-helix, and e for β-extended form.![]()
图 4 预测的铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2蛋白三维结构Figure 4. Predicted 3D structures of DoSQE1 and DoSQE2 from D. officinale2.5 DoSQE1与DoSQE2蛋白同源性系统进化分析
使用BLAST P检索DoSQE1与DoSQE2蛋白的同源序列，结果表明：DoSQE1蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris, XP_020599860.1）、高粱（Sorghum bicolor, XP_002468222.1）和油棕（Elaeis guineensis, XP_010936193.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为86%、85%和84%。DoSQE2蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris, XP_020579136.1）、小米（Setaria italica, XP_004985122.1）和玉米（Zea mays, ONL95392.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为87%、86%和86%。将DoSQE1与DoSQE2蛋白的氨基酸序列与其他15个物种的SQE氨基酸序列进行系统进化分析，结果（图5）显示，兰科植物的铁皮石斛和姬蝴蝶兰聚为一类，DoSQE1与姬蝴蝶兰的XP_020599860.1亲缘关系最近，DoSQE2与姬蝴蝶兰的XP_020579136.1亲缘关系最近。
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图 5 铁皮石斛DoSQE蛋白系统进化树分析注：图中各节点处数字代表可信度。Figure 5. Phylogenetic tree analysis on DoSQE from D. officinaleNote: the numbers at the node of the figure is credibility.2.6 DoSQE1与DoSQE2基因表达分析
利用qRT-PCR检测DoSQE1和DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达模式，结果（图6）表明，茎和叶中都能检测到2个基因的表达，相同时间叶的表达量显著高于茎。DoSQE1基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量8月份最高，10月份次之，12月份最低。DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量10月份最高，8月份次之，12月份最低。
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图 6 DoSQE1和DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的相对表达量Figure 6. Expressions of DoSQE1 and DoSQE2 in stems and leaves of D. officinale3. 讨论与结论
鲨烯单加氧酶是三萜类和甾醇类化合物生物合成关键酶。本研究克隆了铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%，含有鲨烯环氧酶结构域。DoSQE1与野三七的PvfSE[19]一样具有2个跨膜区；DoSQE2与雷公藤的TwSE2[15]一样仅有1个跨膜区。由于DoSQE1和DoSQE2跨膜区个数不同，推测蛋白在膜内和膜外的结构不一样，催化活性也存在差异。
不同植物具有不同的SQE基因拷贝数[24]，不同SQE基因组织表达模式也具有差异。雷公藤TwSE1基因表达量最高的是花，最低的是根；TwSE2基因表达量最高的是花和嫩叶，最低的是老叶[15]。DEVARENNE[25]等研究发现，提高或降低SQE基因的表达量，三萜皂苷的生成量也随之增加或减少。CHOI等[26]研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）诱导提高SQE基因的表达，增加了三萜的合成量。铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因在茎和叶都有表达，叶的表达量显著高于茎。DoSQE1基因从8月份到12月份表达量逐渐降低。DoSQE2基因表达量从8月份到12月份是先升高后降低。DoSQE1和DoSQE2基因表达模式不同，推测两者在铁皮石斛营养生长过程的催化活性存在差异。
本研究克隆了铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因，分析了营养生长期的表达模式，为进一步研究其在铁皮石斛甾醇类化合物生物合成中的功能奠定基础。
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图 3 稻曲病的发病症状
注：A、B、C分别为鲜黄色、黄绿色和墨绿色稻曲球。
Figure 3. Symptom of false smut disease on rice
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图 5 HP-7菌株基于rDNA-ITS序列的系统发育树
Figure 5. Phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences of HP-7 strain
表 1 2种分离方法分离不同成熟度的稻曲球的分离效果
Table 1 Two methods for separating rice smut spores at different maturation stages
分离方法 稻曲球 分离成功
率/%分离成功
率/%分离成功
率/%平均成功
率/%孢子敲落法 鲜黄色 95 100 100 98.33 黄绿色 5 0 0 1.66 墨绿色 0 0 0 0 火焰灼烧法 鲜黄色 70 55 65 63.33 黄绿色 40 35 20 31.66 墨绿色 0 5 10 5 
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表 2 7种杀菌剂对绿核菌的室内毒力
Table 2 Laboratory toxicity determination on 7 fungicides against U. virens
药剂 供试药剂质量浓度
/(mg·L-1)毒力回归方程(y) 相关系数
(r)EC50/
(mg·L-1)戊唑醇 0.5 0.25 0.125 0.0625 0.03125 y=6.9689+2.0454x 0.9644 0.1091 井冈霉素 200 100 50 25 12.5 y=2.5989+1.4157x 0.9896 49.6773 苯醚甲环唑 1.6 0.8 0.4 0.2 0.1 y=6.4634+2.1397x 0.9849 0.2071 甲基硫菌灵 0.8 0.4 0.2 0.1 0.05 y=4.6507+1.0272x 0.9852 2.1881 嘧菌酯 2 1 0.5 0.25 0.125 y=6.9368+2.4213x 0.9974 0.1585 己唑醇 2 1 0.5 0.25 0.125 y=6.4263+2.5744x 0.9973 0.2792 多菌灵 1.6 0.8 0.4 0.2 0.1 y=5.0768+1.9426x 0.9816 0.9137
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