草莓Fragaria是属于蔷薇科草莓属的多年生常绿草本植物，由二倍体、四倍体、六倍体和八倍体种构成。现在栽培的草莓主要是八倍体凤梨草莓，原产欧洲，20世纪初传入我国。据中国园艺学会草莓分会2010年统计，我国草莓栽培面积和产量均为世界第一^[1]。福建省处于我国的东南沿海地区，丘陵地貌的高山和半高山较多，山地海拔的差异形成的丰富光热资源，提供了栽培草莓的良好环境因素，草莓生产具有较大的潜力。20世纪40年代初福建省开始小规模的引种草莓，至80年代开始大规模引种栽培，发展迅速^[2]，至2005年以后以“法兰地”为主栽品种，约占到全省草莓栽培面积的90%。截至2011年的测算, 全省草莓种植面积约1 000 hm², 产量约3万t, 在全国居中下水平。然而福建省的草莓栽培目前存在着不少突出问题，如种植品种较为单一、种苗的质量较差、栽培技术落后、由此导致单位面积产量不高等^[3-4]，影响草莓的经济价值，很有必要加大新品种引进力度，筛选出适合福建省栽培的优良品种来丰富市场，满足消费者需要。

草莓栽培品种在我国的不同省份和地区之间除通过从国外引种及相互引种外，还通过自繁自育获得新的品种。本项目主要通过引种国内外具有不同特性的优良草莓品种，进行大棚栽培试验，以期筛选出成熟期早、高产、抗性强、果实品质好、耐贮运并适合福建栽培的草莓优良品种，在生产中推广应用。由于在不同省份和地区之间引种现象普遍存在的同时，品种命名混乱，同名异物或同物异名的现象也时有出现，这不仅阻碍了草莓种质资源的研究，也给草莓的品种收集和利用以及品种知识产权的保护造成困难。近年来，以植物基因组中的微卫星序列为基础的分子标记技术的发展为作物品种资源的鉴定提供了有力的工具。除ISSR标记被应用于草莓品种鉴定外^[5]，随着国内外越来越多草莓属植物的SSR引物被陆续开发^[6-7], SSR标记技术也应用于草莓种质鉴定、遗传多样性分析和遗传图谱构建等研究^[8-12]。由于相对而言，SSR分子标记较为稳定，本研究拟通过SSR分子标记，以在我省主栽草莓品种为对照，针对本项目近年引进示范的草莓品种进行分子鉴定。通过建立遗传树状图，揭示品种之间的亲缘关系，以期为草莓品种鉴定、草莓杂交育种中亲本的选配提供技术支持。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验材料为来自不同国家的11个草莓品种(表 1)，分别引种自美国和省外，现种植于福建省农业科学院生物技术研究所的宁德实验基地。

表  1  供试材料

Table  1.  Materials testeds

编码	品种名称	来源
F	法拉第	美国引进
T	太空2号	本项目北京引进
TC1	甜查里1	美国引进
TC2	甜查里2	本项目单株选育
Z1	紫莓1号	本项目美国引进
Z3	紫莓3号	本项目美国引进
A	阿尔比	美国引进
Fm	福莓	本省选育
H	红宝	贵州引进
Hy	红颜	浙江引进
Zj	章姬	浙江引进

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1.2   草莓DNA提取与PCR反应

取草莓未展开的嫩叶3~5片，采用改良的CTAB法提取草莓总DNA，用紫外分光光度计与琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度。采用上海Bioteke生物工程公司提供的PCR体系(包含Taq酶、缓冲液、Mg²⁺离子和dNTP)进行草莓DNA的SSR-PCR反应。SSR引物来源和序列详见表 2，由上海生工公司合成。引物扩增反应在BioRad Gradient PCR仪上进行，PCR反应混合液总体积为20 μL，包含反应缓冲液，2 mmol·L^-1的4种dNTPs，0. 4 mmol·L^-1的SSR引物，40 ng的提取草莓DNA，0. 8 U的Taq DNA聚合酶。反应程序如下:首先在94℃预变性5 min; 而后32个循环的94℃变性30 s，根据不同引物设置50~60℃的退火温度，反应时间45 s，72℃延伸45 s，最后在72℃反应10 min。反应产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后银染检测，拍照记录结果。

表  2  引物及其扩增结果统计

Table  2.  Summary of amplified SSR primers

引物编号	引物序列	扩增总带数	多态性的带数	多态性占比/%
01H05	F：GGGAGCTTGCTAGCTAGATTTG；R：AGATCCAAGTGTGGAAGATGCT	10	8	80
02C07	F：CTCTCCCCACAAAACCCTAAAC；R：AAAGATCGGTAGGCACAGAGAG	13	13	100
02F07	F：GAGGCTTACCGTTCCAATCTTC；R：GTTGGGATCCTCTAACATCTGG	7	6	85.7
02G01	F：ACGAGGTGGGTTTTGTGTTGT；R：CCCAGATGAAGAAACCGATCTA	13	12	92.3
02H04	F：ATCAGTCATCCTGCTAGGCACT；R：TACTCTGGAACACGCAAGAGAA	13	10	76.9
03B05	F：GGAATCCAAGTTACAGGCTTCA；R：AAGGAGCCTCTCCAATAGCTTC	12	8	66.7
03D11	F：GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG；R：TACCTTCTGCATTCACCATGAC	18	14	77.8
04G04	F：ACGAGGCCTTGTCTTCTTTGTA；R：GCTCCAGCTTTATTGTCTTGCT	3	3	100
08C11	F：GGACGTCCCCTTCTTTATTTCT；R：ACCCCACATTCCATACCACTAC	14	11	78.6
08H09	F：CTTCACCTAATCACTTGCCTGA；R：GGTCTGTTCCTTTCCTTGTTTG	6	6	100
总计		109	91	83.5

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1.3   数据分析

依据电泳结果记录清晰可重复的条带，清晰且可重复的条带记为“1”，模糊不清的弱带且不重复或无条带出现记为“0”，形成“1、0”数据矩阵；统计扩增带总数和特异条带数目，计算多态性比率；利用NTsys 2.10e软件构建草莓供试品种材料的聚类树状图。

2.   结果与分析

2.1   草莓DNA的SSR分子标记引物的筛选与扩增结果

以筛选到的具有多态性特征、重复性好的10条SSR引物为基础进行草莓参试样品的PCR反应。反应结果如表 2所示：所用引物扩增得到谱带共计有109条，其中在品种间可形成多态性的谱带有91条，多态性比率达到了84%。其中引物02H04和03B05对11种草莓品种样品的扩增结果如图 1所示。

图  1  引物02H04(左图)与03B05(右图)在11个草莓供试品种材料中的扩增图谱

Figure  1.  Amplified profiles of primer 02H04 (photo on the left) and 03B05 (photo on the right) from 11 tested strawberry samples

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2.2   草莓品种聚类分析

根据SSR-PCR电泳扩增结果，构建聚类树状图(图 2)。聚类分析表明，11份草莓种质资源的遗传相似系数为0.62~0.89，在遗传相似系数为0.62处可把供试品种划分为2个主类群。第1类包括红颜、红宝、章姬、福莓等4个品种，除福莓(Fm)为福州市蔬菜科学研究所选育的品种外，其余均为外省引进，其中红宝为本项目组首次从贵州引进。第2类包括7个品种，除太空2号(T)为本项目组首次从北京引进的品种外，其余的品种均为原产于美国的品种，其中法兰地为福建省的主栽品。在这个类群的参试品种中，两个甜查理样品之间的遗传相似系数最高, 为0.89, 次高的为法兰第(F)与甜查理(TC)之间的遗传相似系数。但从美国引种的紫莓3号和从北京引种的太空2号可与其他品种明显区别开来。总体而言，供试的草莓品种材料间的遗传相似系数还是比较高，表明草莓供试品种材料间的亲缘关系比较近。

图  2  11个草莓样品SSR分子标记聚类

Figure  2.  Dendrogram of 11 strawberry cultivars based on SSR molecular markers

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3.   讨论与结论

3.1   草莓品种的SSR分子标记鉴定效果

根据2005年和2012年2个版本的《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南草莓》，草莓测试标记的选择都以植株的形态特征为主，主要包含了质量性状(QL)、数量性状(QN)和假质量性状(PQ)等3种表达类型；测试方法包含了群体测量(MG)、个体测量(MS)、群体目测(VG)和个体目测(VS)等4种方式^[13]。由于草莓商业种植的品种一般是八倍体，且基因型杂合度高，传统的形态学标记在草莓种质资源研究中局限性日显。SSR标记作为分子水平的标记，具有操作过程简单、标记结果为共显性且具有多态性明显、重复性好等优势，并且在相同的种属间，一套SSR引物具有一定程度的通用性。前人曾报道利用SSR标记对草莓品种资源的遗传关系进行了研究，扩增的多态性条带能较全面地反映参试草莓群体间的变异^[8-11]。本研究用10对SSR引物对征集自我省的11个草莓品种进行遗传多样性分析，成功鉴别了它们之间的亲缘关系。从本试验的研究结果来看，筛选的SSR引物能有效地反映草莓品种间的多态性，而且多次扩增结果的重复性好，再次证明用SSR标记对草莓亲缘关系进行分析是完全可行的，标记图谱可作为鉴别草莓品种的参考依据。通过本研究筛选的SSR引物明显地鉴别出近年来本项目组引进的4个草莓新品种，在下一步的品种推广过程中，必将很好地用于品种的知识产权保护。

3.2   福建省栽培的草莓品种的来源状况

本研究通过聚类分析发现福建省栽培的草莓品种的亲缘关系与地理来源存在明显的相关性，主要为两个系列的品种：一个引种于其他省份，另一个来源于美国；而现在福建各个区域主栽的品种法兰第(F)与甜查理(TC)均是早期从美国引进，并经过多年的田间种植而成为最适宜于在福建省种植的传统品种，其中法兰第(F)的种植面积在省内占90%左右。本项目组也于2011年从美国引进新品种，通过田间中试，筛选出的紫莓1号和3号也聚于美洲类群，说明它们有一定的亲缘关系，但紫莓3号的分子特异性较为显著。

利用EST-SSR对我国的草莓品种进行分析，聚类结果与草莓品种的实际来源情况相符，在0.54水平上完全可以把起源于东方与西方的品种区分开^[7]。由于日本在近两个世纪里育出了几十个著名的品种，我国早期种植的品种主要就是来源于东方的日本，福建省从外省引种的来品种中章姬(Zj)本身为从日本引进的品种^[9]，推测这个类群的其余品种(包括福州选育的福莓)也应该是在日系品种的基础上选育的。由此可见：福建省的草莓种植面积虽然逐年扩大，但生产上所用的品种大多依靠引进，由于生态条件及消费习惯的不同，引入的品种不完全适应本省的栽培条件及当地居民的消费习惯。此外，日系品种优质不抗病，欧美品种抗病不优质，生产上品种选择陷入两难。因此，将来必须在引进的基础上加大自主育种的力度，本研究为育种资源的选择、品种鉴定以及品种知识产权的保护提供了技术基础。