Nested RT-PCR Assay for Detecting Broad bean wilt virus 2 and Turnip mosaic virus in Pseudostellaria heterophylla
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摘要: 为探求快速、灵敏的太子参脱毒检测技术，建立太子参蚕豆萎蔫病毒2（Broad bean wilt virus 2，BBWV2）和芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的巢式RT-PCR快速检测方法，根据GenBank数据库中这2种病毒外壳蛋白（coat protein，cp）基因核苷酸序列的保守区域分别设计2对简并引物，建立和优化巢式RT-PCR扩增体系，继而进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较，并应用巢式RT-PCR对7份田间栽培太子参病样和4份脱毒苗样品进行检测。结果显示：BBWV2、TuMV的巢式引物最佳退火温度分别为60、62℃；采用巢式RT-PCR，这两种病毒样品cDNA原液在稀释105倍后仍能扩增出特异性条带，比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。本研究建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测BBWV2和TuMV，且具有更高的灵敏度，更能满足太子参脱毒检测的需要。
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关键词:
- 太子参 /
- 太子参蚕豆萎蔫病毒2(BBWV2) /
- 芜菁花叶病毒(TuMV) /
- 巢式RT-PCR
Abstract: To enable a rapid and sensitive determination of being virus-free for a Pseudostellaria heterophylla seedling, a nested RT-PCR method was developed. Detection of the presence of either Broad bean wilt virus(BBWV2) or Turnip mosaic virus(TuMV) in the sample was a proof of the existence of the diseases. Two pairs of degenerate primers were designed respectively according to the conserved sequence regions of the two coat protein (cp) genes of the viruses from GenBank. The nested RT-PCR detection protocols were optimized. Subsequently, detecting sensitivities of the conventional and the nested RT-PCRs were compared. Meanwhile, 7 samples of cultivated P. heterophylla along with 4 of virus-free test-tube plantlets were used in a challenge test on the nested RT-PCR methodology. The results showed that, by using the annealing temperature of 60℃ for BBWV2 and 62℃ for TuMV on the nested primers, specific bands could be detected on a 105x dilution of the first strand cDNA for both viruses. That suggested at least 10-fold higher a sensitivity was achieved by the nested than the conventional RT-PCR. It was concluded that the newly established assay method was rapid, stable, sensitive and accurate for detecting BBWV2 or TuMV in P. heterophylla, and therefore, could be adequately applied to certify a virus-free status or not on a P. heterophylla sample. -
太子参Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax，为石竹科假繁缕属多年生草本药用植物，以块根入药，具有益气健脾、生津润肺之功效。由于长期采用块根进行营养繁殖，病毒逐代积累，病毒病普遍发生并加剧，导致太子参种质退化，产量和品质不断下降，已成为太子参产业发展的瓶颈问题[1]。然而，针对太子参病毒病目前尚无有效的防治措施。应用现代生物技术进行太子参脱毒快繁及工厂化育苗有望减少病毒病带来的经济损失[2-4]。而脱毒苗均须经过严格的脱毒检测确定脱毒后才能进行推广应用。因此，研究高灵敏度的快速脱毒检测技术成为太子参脱毒种苗生产的关键环节。近年来各地的栽培太子参主要侵染蚕豆萎蔫病毒Broad bean wilt virus 2(BBWV2)和芜菁花叶病毒Turnip mosaic virus(TuMV)这2种[5]。迄今为止，关于太子参病毒的快速检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)[6]、单一RT-PCR检测方法[6]和双重RT-PCR检测方法[1]。ELISA法准确、快速，但其灵敏度不够高，不适合用于检测病毒浓度较低的样品。大量研究表明，与传统的病毒检测方法相比，分子检测技术具有快速、稳定、特异性强、灵敏度高等优点，已广泛应用于浓度较低的植物病毒检测[7-12]，而巢式RT-PCR是建立在常规RT-PCR方法上的具有更高灵敏度的分子检测方法[13-16]。目前尚未见采用巢式RT-PCR方法对太子参病毒进行快速高效检测的报道。因此，本研究拟根据GenBank数据库中BBWV、TuMV病毒衣壳蛋白(coat protein，cp)基因的核苷酸序列分别设计2对简并引物，建立太子参BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR检测方法，以期为太子参的脱毒检测提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试BBWV2和TuMV毒源样品7份，经DAS-ELISA、单一RT-PCR及序列测定后确认。健康太子参样品为经DAS-ELISA检测、常规RT-PCR检测均呈阴性的太子参脱毒苗。此外，脱毒苗样品4份用于脱毒检测，其中采用种胚脱毒的样品3份、茎尖脱毒后的样品1份。以上样品均由福建省特色药用植物工程技术研究中心收集和保存。
1.2 引物设计
根据GenBank数据库中BBWV2、TuMV cp基因核苷酸序列的保守区域，采用Primer 5.0、DNAman 9软件分别设计2种病毒的巢式RT-PCR引物。引物名称、序列、预期目的片段大小及退火温度(Annealing Temperature，Ta)见表 1。
表 1 BBWV2和TuMV的巢氏RT-PCR检测引物Table 1. Nested RT-PCR primers for BBWV2 and TuMV identification引物名称 引物序列(5′-3′) 目的片段大小
/bp退火温度
/℃BBWV2--F TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT 1345 57 BBWV2-R TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM BBWV2-NF AAYGCTCCRAARGTVGATGCYARRA 498 - BBWV2-NR CBCCTCTTGCYGARTCYAAATCCCA TuMV-F AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY 775 60 TuMV-R GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT TuMV-NF TCATCTRATYCTRTACACGCCRGAGC 337 - TuMV-NR TGTATGGTCGGTCTTGGTTACGC 1.3 叶片总RNA的提取及cDNA第一链的合成
叶片总RNA的提取及cDNA第一链的合成参照匡云波等[1]的方法。
1.4 巢式PCR引物退火温度的筛选
以反转录产物为模版，分别采用外侧引物BBWV2-F、BBWV2-R和TuMV-F、TuMV-R进行第1轮PCR扩增。然后以第1轮PCR扩增产物(稀释100倍)为模板，分别采用内侧引物BBWV2-NF、BBWV2-NR和TuMV-NF、TuMV-NR进行第2轮PCR扩增，并对其退火温度进行优化。退火温度设置52、54、56、58、60、62℃，观察不同退火温度对第2轮扩增效果的影响。
PCR反应体系及PCR扩增条件参照匡云波[1]的方法。取2种PCR产物2 μL进行琼脂糖(1%)电泳检测。目的片段回收后克隆至pMD18-T连接载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态，阳性克隆子送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。
1.5 常规RT-PCR和巢式RT-PCR灵敏度的比较
分别将感染BBWV2、TuMV的太子参病叶样品cDNA原液按10倍梯度依次稀释101～106倍，进行常规RT-PCR和巢式RT-PCR扩增，比较2种方法的灵敏度。试验以健康太子参样品的cDNA作为阴性对照。
1.6 供试样品检测
应用建立的巢式RT-PCR方法，对太子参病叶样品和脱毒组培苗样品进行病毒检测。试验以健康太子参样品的cDNA作为阴性对照。
2. 结果与分析
2.1 巢式RT-PCR退火温度的优化
巢氏RT-PCR扩增结果表明，利用BBWV2、TuMV的巢式引物可从太子参病样中扩增出明亮、大小分别为498 bp和337 bp的单一目的条带。BBWV2在退火温度为52～62℃均能扩增得到目的条带，但62℃时条带稍弱，因此，选择60℃作为最佳退火温度(图 1-A)。TuMV在退火温度为52～62℃的PCR扩增效果差异较小，但较高的温度更有利于得到特异性条带，因此选择62℃作为最佳退火温度(图 1-B)。将测序得到的cDNA片段的核苷酸序列在NCBI的GenBank数据库中在线进行Blast，结果显示与太子参BBWV2和TuMV cp基因(GenBank登录号分别为KT936523和KT898800)的相应片段[17-18]在核苷酸序列上具有100%同一性，证明了巢氏RT-PCR检测结果的可靠性。
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图 1 不同退火温度下BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR扩增注：A为BBWV2；B为TuMV；M为DM2000；1～6依次为52、54、56、58、60、62℃。Figure 1. Amplification of BBWV2 and TuMV by nested RT-PCR at different annealing temperatures2.2 常规RT-PCR和巢式RT-PCR的灵敏度比较分析
采用常规RT-PCR进行BBWV2和TuMV灵敏度检测试验，在太子参病叶cDNA原液稀释104倍后仍能扩增出特异性条带，但稀释103倍后条带已较弱(图 2)。而采用巢式RT-PCR，在cDNA原液稀释105倍后仍能扩增出清晰、明亮的特异性条带(图 3)。表明巢式RT-PCR比常规RT-PCR灵敏度至少高10倍。
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图 2 常规RT-PCR扩增的灵敏度分析注：A为BBWV2；B为TuMV；M为DM2000；1～5依次为cDNA原液稀释101、102、103、104、105倍；6为阴性对照。Figure 2. Amplification sensitivity of conventional RT-PCR![]()
图 3 巢式RT-PCR扩增的灵敏度分析注：A为BBWV2；B为TuMV；1为阴性对照；2～7依次为cDNA原液稀释101、102、103、104、105、106倍；M为DM2000。Figure 3. Amplification sensitivity of nested RT-PCR2.3 巢式RT-PCR方法在太子参样品病毒检测中的应用
供试的7份太子参病叶样品中，有6份感染了BBWV2(图 4-A)，6份样品感染了TuMV(图 4-B)；而4份脱毒太子参组培苗样品均未检测出病毒，与常规RT-PCR的检测结果一致。结果证明，使用建立的巢式RT-PCR检测方法可快速、稳定、准确地检测太子参BBWV2和TuMV。
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图 4 太子参样品的巢式RT-PCR病毒检测结果注：A为BBWV2；B为TuMV；1为阴性对照；2～4为福建病样；5～8依次为江苏、湖南、贵州和山东病样；M为DM2000；9～11为种胚脱毒的组培苗；12为茎尖脱毒的组培苗。Figure 4. Detection of BBWV2 and TuMV in P.heterophylla samples by nested RT-PCR3. 讨论与结论
建立快速、稳定、灵敏的脱毒检测方法，对于太子参脱毒苗的工厂化生产及其推广应用具有十分重要的意义。而通过指示植物法、ELISA法和电子显微镜观察法[19-22]等方法进行太子参病毒检测时，不但操作繁琐，且检测周期长。与传统的病毒检测方法相比，常规RT-PCR[6]和双重RT-PCR[1]虽然具有快速、稳定、特异性强、灵敏度高等特点，但对于携带病毒极其微量的脱毒苗等无性繁殖材料，仍需要寻找具有更高灵敏度的分子检测技术。
病毒cp基因具有较高的序列保守性，常用于植物病毒的快速分子检测[23-25]。本研究根据BBWV2、TUMV这2种病毒cp基因的核苷酸序列设计引物，建立的巢式RT-PCR检测方法在太子参样品cDNA原液稀释105倍后仍能扩增出明亮、清晰的特异条带，比常规RT-PCR的灵敏度至少高10倍。此前，闻伟刚等[26]建立了菜豆荚斑驳病毒Bean pod mottle virus(BPMV)的半巢式RT-PCR检测技术，其检测灵敏度比常规RT-PCR高1 000倍以上。傅华英等[13]建立了甘蔗赤条病Acidovo avenae avenae的巢式RT-PCR检测技术，并验证了其比常规RT-PCR检测灵敏度至少高1 000倍。沈万宽等[14]建立了甘蔗宿根矮化病菌Leifsonia xyli xyli巢式RT-PCR检测技术，田间疑似感病样品检测结果表明，巢式RT-PCR比常规RT-PCR灵敏度高100倍。贾平乔等[27]针对进境苹果果实中所携带的梨火疫病菌Erwinia amylovora设计了巢式RT-PCR检测方法，研究证明其检测灵敏度高于常规RT-PCR方法。在本研究中，建立的巢式RT-PCR检测方法仅为常规RT-PCR的10倍，可能是由于在进行模板稀释时，所采用的太子参组织样品液中病毒RNA的浓度过低所致。因此，巢式RT-PCR检测方法可大大提高检测灵敏度，提高脱毒苗中的病毒检出率，有利于保证脱毒种苗的质量，更能满足太子参脱毒检测的需要。
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图 1 不同退火温度下BBWV2和TuMV的巢式RT-PCR扩增
注：A为BBWV2；B为TuMV；M为DM2000；1～6依次为52、54、56、58、60、62℃。
Figure 1. Amplification of BBWV2 and TuMV by nested RT-PCR at different annealing temperatures
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图 2 常规RT-PCR扩增的灵敏度分析
注：A为BBWV2；B为TuMV；M为DM2000；1～5依次为cDNA原液稀释101、102、103、104、105倍；6为阴性对照。
Figure 2. Amplification sensitivity of conventional RT-PCR
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图 3 巢式RT-PCR扩增的灵敏度分析
注：A为BBWV2；B为TuMV；1为阴性对照；2～7依次为cDNA原液稀释101、102、103、104、105、106倍；M为DM2000。
Figure 3. Amplification sensitivity of nested RT-PCR
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图 4 太子参样品的巢式RT-PCR病毒检测结果
注：A为BBWV2；B为TuMV；1为阴性对照；2～4为福建病样；5～8依次为江苏、湖南、贵州和山东病样；M为DM2000；9～11为种胚脱毒的组培苗；12为茎尖脱毒的组培苗。
Figure 4. Detection of BBWV2 and TuMV in P.heterophylla samples by nested RT-PCR
表 1 BBWV2和TuMV的巢氏RT-PCR检测引物
Table 1 Nested RT-PCR primers for BBWV2 and TuMV identification
引物名称 引物序列(5′-3′) 目的片段大小
/bp退火温度
/℃BBWV2--F TTGGGHTCWAGYYTGGGACGYTTRT 1345 57 BBWV2-R TTRTARAACTTCTTGCTCCCACGM BBWV2-NF AAYGCTCCRAARGTVGATGCYARRA 498 - BBWV2-NR CBCCTCTTGCYGARTCYAAATCCCA TuMV-F AGGTGAAAYGCTTGATGCAGGTY 775 60 TuMV-R GTTHCCATCCARKCCGAACAAAT TuMV-NF TCATCTRATYCTRTACACGCCRGAGC 337 - TuMV-NR TGTATGGTCGGTCTTGGTTACGC 
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[1] 匡云波, 陈满足, 陆伊荣, 等.太子参芜菁花叶病毒和蚕豆萎蔫病毒的双重RT-PCR检测[J].园艺学报, 2017, 44(4): 784-791. https://www.cnki.com.cn/qikan-YYXB201704019.html [2] 吴朝峰, 马雪梅, 林彦铨.太子参茎尖脱毒培养及增产效果[J].福建农业大学学报, 2006, 35(2): 129-133. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10389-2004109240.htm [3] 朱艳, 秦民坚, 周小华.太子参脱病毒技术研究[J].植物资源与环境学报, 2005, 14(4): 27-31. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zwzyyhjxb200504006 [4] 颜培玲, 王振华, 靳志飞, 等.太子参的组织培养与快速繁殖研究[J].安徽农学通报, 2016, 22(23): 50-52. DOI: 10.3969/j.issn.1007-7731.2016.23.019 [5] 高玮, 张敬水, 张建红, 等.太子参花叶病毒的检测与防治[J].中国病毒学, 1993, 8(4): 390-393. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-HBNK201316067.htm [6] 黄颖桢, 陈菁瑛, 朱景花, 等.太子参中芜菁花叶病毒的RT-PCR检测[J].福建农业学报, 2016, 31(6): 616-619. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-FJNX201606012.htm [7] LEE S, LEE G, CHOI I C, et al. Development of PCR diagnostic system for detection of the seed-transmitted Tobacco ringspot virus in quarantine[J]. Indian Journal of Microbiology, 2015, 55(2): 231-233. DOI: 10.1007/s12088-015-0518-8
[8] KOMOROWSKA B, MALINOWSKI T, MICHALCZUK L. Evaluation of several RT-PCR primer pairs for the detection of Apple stem pitting virus[J]. J Virol Methods, 2010, 168(1-2): 242-247. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.04.024
[9] ZHANG P, LIU Y, LIU W, et al. Simultaneous detection of Wheat dwarf virus, Northern cereal mosaic virus, Barley yellow striate mosaic virus and Rice black-streaked dwarf virus in wheat by multiplex RT-PCR[J]. J Virol Methods, 2017, 249170-249174. http://cn.bing.com/academic/profile?id=ea31f20a5375489a1fc2999de3851c0a&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[10] MALANDRAKI I, BERIS D, ISAIOGLOU I, et al. Simultaneous detection of three pome fruit tree viruses by one-step multiplex quantitative RT-PCR[J]. Plos One, 2017, 12(7): e0180877. DOI: 10.1371/journal.pone.0180877
[11] KAJIWARA H, MURAKAMI R. Application of RT-PCR and MALDI-TOF MS for the detection of RNA luteovirus[J]. Anal Biochem, 2017, 53945-53947. http://cn.bing.com/academic/profile?id=1a0a935a53502aa98083717ec1ce56d4&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[12] DAN M, LI S, YU K X, et al. Detection of ratoon stunting disease in virus-free Seedcane of Saccharum officinarum by PCR[J]. Agricultural Science & Technology, 2010, 11(11-12): 111-113. http://cn.bing.com/academic/profile?id=a0a6fe37af1eaafb233c008a731599c4&encoded=0&v=paper_preview&mkt=zh-cn
[13] 傅华英, 葛丹凤, 李晓燕, 等.甘蔗赤条病菌巢式PCR检测[J].植物保护学报, 2017, 44(2): 276-282. http://www.oalib.com/paper/4451714 [14] 沈万宽, 刘睿, 邓海华.甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测[J].植物保护学报, 2012, 39(6): 508-512. http://www.oalib.com/paper/4451714 [15] DEY K K, LIN H, BORTH W B, et al. A highly sensitive single-tube nested PCR assay for the detection of Pineapple mealybug wilt associated virus-2(PMWaV-2)[J]. J Virol Methods, 2012, 183(2): 215-218. DOI: 10.1016/j.jviromet.2012.03.025
[16] ADKAR-PURUSHOTHAMA C R, MAHESHWAR P K, SANO T, et al. A sensitive and reliable RT-nested PCR assay for detection of Citrus tristeza virus from naturally infected citrus plants[J]. Curr Microbiol, 2011, 62(5): 1455-1459. DOI: 10.1007/s00284-011-9883-7
[17] 匡云波, 叶炜, 李金辉, 等.不同产地太子参芜菁花叶病毒CP基因的分离与序列差异性分析[J].热带作物学报, 2016, 37(10): 1974-1979. DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.021 [18] 匡云波, 叶炜, 李金辉, 等.太子参蚕豆萎蔫病毒2号CP基因的遗传多样性及分子进化分析[J].植物病理学报, 2017, 47(4): 470-478. http://www.cqvip.com/QK/91986X/201001/33123287.html [19] 宋荣浩, 濮祖芹.太子参(Pseudostellaria heterophylla)病毒病病原鉴定[J].上海农业学报, 1991, 7(2): 80-85. http://www.cqvip.com/qk/91627X/199102 [20] 陆家云.药用植物病害[M].北京:中国农业出版社, 1995. [21] 黄勇毅, 林丛发.闽东太子参花叶病发病规律调查及防治途径研究[J].宁德师专学报(自然科学版), 2004, 16(1): 65-68. http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-FJND200602003.htm [22] 刘清琪, 陈棣华.太子参花叶病病原及其防治的初步研究[J].中药材科技, 1983(2): 11-12. http://mall.cnki.net/magazine/Article/ZYCA198302009.htm [23] 朱晨熹, 王国平, 郑亚洲, 等.来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析[J].植物病理学报, 2016, 46(1): 11-16. http://www.cqvip.com/QK/91986X/201601/667711923.html [24] 沈建国, 高芳銮, 蔡伟, 等.进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测[J].中国农业科学, 2016, 49(4): 667-676. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.04.006 [25] 金晶, 付翔, 沈建国, 等.利用多重RT-PCR检测水仙黄条病毒、水仙退化病毒和水仙花叶病毒[J].福建农林大学学报(自然科学版), 2015, 44(5): 462-467. http://industry.wanfangdata.com.cn/dl/Detail/Periodical?id=Periodical_fjnydxxb201505003 [26] 闻伟刚, 崔俊霞, 赵秀玲, 等.半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究[J].植物病理学报, 2006, 36(4): 296-300. http://mall.cnki.net/magazine/Article/ZWBL200604001.htm [27] 贾平乔, 周国梁, 吴杏霞, 等.进境苹果果实中梨火疫病菌的套式PCR检测[J].植物病理学报, 2009, 39(5): 1-9. http://www.wanfangdata.com.cn/details/detail.do?_type=perio&id=zwblxb200905001 -
期刊类型引用(2)
1. 梁宇卿，孙春辉，邓丛良，史喜菊，种焱，李永强. 蚕豆萎蔫病毒2号北京玫瑰分离物的鉴定. 园艺学报. 2024(10): 2320-2328 . 
百度学术
2. 王培育，杨学. 柑橘CLas和CYVCV双重PCR检测体系的建立及应用. 武夷科学. 2021(02): 137-142 . 百度学术
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