Immunological Efficacy of Streptococcus agalactiae SIP Oral Vaccine on Tilapia (Oreochromis niloticus)
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摘要: 为研究无乳链球菌Streptococcus agalactiae表面免疫蛋白（surface immunogenic protein，SIP）微胶囊口服疫苗对罗非鱼Oreochromis niloticus的免疫效果，将制备的无乳链球菌SIP微胶囊疫苗口服免疫健康的罗非鱼，以注射免疫无乳链球菌灭活疫苗为阳性对照，口服包埋PBS的微胶囊颗粒为阴性对照，分别于免疫后0、7、14、28 d取脾脏组织，通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏组织中的白细胞分化抗原CD4、白介素IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子TNF-α、核转录因子NF-κB等5种免疫相关基因表达的变化，并于第5周进行人工感染攻毒试验，计算无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗对罗非鱼的相对免疫保护率。结果显示，免疫接种之后，SIP微胶囊疫苗口服免疫组（SIP疫苗组）和全菌灭活疫苗注射免疫组（灭活疫苗组）罗非鱼脾脏中的5种免疫相关基因表达均不同程度上调，且相对表达量显著高于阴性对照免疫组（阴性对照组）（P < 0.05）。在人工感染攻毒试验中，SIP疫苗组和灭活疫苗组的死亡率均显著低于阴性对照组（P < 0.05），灭活疫苗组比SIP疫苗组得到了更高的免疫保护率，但两组的死亡率差异不显著（P>0.05）。说明罗非鱼无乳链球菌SIP微胶囊口服疫苗免疫效果好，在罗非鱼无乳链球菌病的免疫防治中有良好的应用前景。Abstract: The immunological efficacy of Streptococcus agalactiae surface immunogenic protein (SIP) oral vaccine on tilapia (Oreochromis niloticus) was studied. Randomly grouped fish were injected with the inactivated vaccine as the positive control (Group Inactivated Vaccine), or orally administered with SIP vaccine (Group SIP Vaccine) for treatment or PBS as the negative control (Group Negative Control). Spleen samples from the tilapias were collected at 0, 7, 14 and 28 d after the immunization. The gene expressions of the cluster determinant 4 (CD4), interleukin-8 (IL-8), interleukin-10 (IL-10), tumor necrosis factor α(TNF-α) and nuclear transcription factors κB(NF-κB) were determined by the quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). Four weeks after the treatments, the groups were challenged by the artificial infection of S. agalactiae to observe the relative percent survivals (RPS) on the fish. The results show that the expressions on CD4, IL-8, IL-10, TNF-α and NF-κB genes of Group SIP Vaccine and Group Inactivated Vaccine increased in varying degrees, and were significantly higher (P < 0.05) than those of Group Negative Control. The death rates of fish in Group SIP Vaccine and Group Inactivated Vaccine were significantly lower (P < 0.05) than that of Group Negative Control. The RPS of Group Inactivated Vaccine was higher than that of Group SIP Vaccine, but not significantly different (P>0.05). It appeared that the SIP oral vaccine could be used with satisfaction in protecting tilapias from S. agalactiae infection.
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樱桃番茄Lycopersicon esculentum var. Cerasiforme，又名圣女果、小西红柿，果实风味浓郁，果实中含有丰富的番茄红素、β-胡萝卜素、维生素C、维生素E和酚类化合物等，具有良好的抗氧化和保健功效[1]。番茄中所含的番茄红素还具有降低患乳腺癌、胃癌、前列腺癌和心血管疾病等慢性疾病风险的作用[2]。然而，由于樱桃番茄的含水量高，采后易受到蒸腾作用和病害的影响，不易贮藏和运输[3]。干燥是最古老且有效的食品加工和贮藏方法，干燥食品具有延长保质期，降低包装、贮藏、处理和运输成本等优点，能为消费者提供丰富多样化的产品[4]。传统的热风干燥是农产品干燥的主要方法, 然而物料在持续的高温干燥条件下，容易造成表面皱缩，硬度增加，复水能力降低，并对风味、色泽和营养成分造成破坏[5]。而且，热风干燥番茄所需的干燥时间长，能耗高, 较高的干燥温度是造成番茄果干褐化和维生素C含量下降的重要原因[6]。
研究表明，通过联合不同的干燥技术并优化工艺参数可达到保留加工产品中的风味及其营养价值的目的[7-8]。微波真空干燥技术是近年来被广泛应用的一项汇集多门学科技术的现代高新干燥技术，在真空干燥的过程中引入微波辐射能，利用微波能快速从内向外加热的特性，使水分的传热速度加快，食品的干燥时间得以缩短，从而降低能耗，提高生产效率[9-10]。Yousif等[11]研究结果表明传统热风干燥处理的香料的色泽和复水能力明显不如微波真空干燥后的产品。Michalska等[12]比较了不同干燥方法对李果的干燥效果，发现微波真空干燥对于李果中的酚类物质的保存具有最好的效果。Zielinska等[13]比较了热风对流干燥、微波真空干燥及其联合干燥方法对蓝莓干燥后的品质的影响，结果表明采用热风对流与微波真空联合干燥方法能最大限度保留花青素成分。因此，在微波真空干燥的基础上，联合其他干燥处理方法，有利于进一步提升干燥产品的品质[14]。
本研究以经过渗透预处理的樱桃番茄为研究对象，重点研究渗透预处理樱桃番茄中的水分在微波真空干燥过程中的变化规律，及在微波真空干燥的过程中微波功率、真空度和装载量3个因素的影响。通过设计单因素试验，分析整合试验数据，建立樱桃番茄微波真空干燥的动力学模型，描述樱桃番茄干基含水率在干燥过程中随时间变化的规律，为进一步研究樱桃番茄的微波真空干燥工艺提供理论依据和生产指导。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
樱桃番茄(采自福建省农业科学院中以示范农场)，红色，九成熟，大小均衡，软硬适度，新鲜饱满，无明显机械损伤。采后于4℃冰箱中贮存保鲜。蔗糖和食盐，均为食品级，购自福州市当地超市。
1.1.2 仪器与设备
KL-4型微波真空干燥设备，中国广州市凯棱工业用微波设备有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；PL602-L型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 渗透预处理
选取形态适中、成熟度一致、无损坏的新鲜樱桃番茄，去蒂，用蒸馏水清洗。在樱桃番茄表皮上用直径1 mm的细针均匀扎孔20个。采用40%蔗糖与10%食盐的混合溶液为渗透液，固液比为1:10[15]，在45℃下水浴渗透6 h[16]。渗透时间到达后，从渗透溶液中取出樱桃番茄，迅速用蒸馏水冲洗果粒表皮，并将表面水分用滤纸吸干后备用。
1.2.2 微波功率对樱桃番茄干燥特性的影响
将经渗透预处理的樱桃番茄，在装载量200 g，真空度-75 kPa，微波功率分别为1、2、3、4 kW的条件下进行微波真空干燥处理，并测定樱桃番茄的干燥曲线和降水速率随含水率变化曲线。
1.2.3 真空度率对樱桃番茄干燥特性的影响
将经渗透预处理的樱桃番茄，在装载量为200 g，微波功率为2 kW，真空度分别为-55、-65、-75、-85 kPa的条件下进行微波真空干燥处理，并测定樱桃番茄的干燥曲线和降水速率随含水率变化曲线。
1.2.4 装载量对樱桃番茄干燥特性的影响
将经渗透预处理的樱桃番茄，在微波功率2 kW，真空度-75 kPa，装载量分别为100、200、300和400 g的条件下进行微波真空干燥处理，并测定樱桃番茄的干燥曲线和降水速率随含水率变化曲线。
1.3 测定方法
1.3.1 干燥曲线的测定
称取一定质量经渗透预处理的樱桃番茄，果粒单层摆放，均匀地平铺于微波真空干燥设备的托盘中，干燥过程中，每隔1 min快速取样称重并记录质量变化，直至样品的含水率在7%左右。每组试验重复3次。
1.3.2 降水速率随含水率变化曲线的测定
干基含水率/%=[(mt-mg)/mg]×100%
式中，mt为物料t时刻所对应的质量(g)，mg为物料的绝干质量(g)。
降水速率/%=Δm/Δt
式中，Δm为相邻两次测量的降水质量(g)，Δt为相邻两次测量的时间间隔(min)。
1.4 数据分析
应用SPSS17.0数据处理软件进行回归分析与模型拟合。
2. 结果与分析
2.1 樱桃番茄微波真空干燥特性
2.1.1 微波功率对樱桃番茄干燥特性的影响
由图 1-A干燥曲线可知，在真空度及装载量保持不变的条件下，用微波真空干燥对樱桃番茄进行处理，各个微波功率(1、2、3和4 kW)下的干燥时间分别为33、17、9和6 min。干燥时间随着微波功率的增大而缩短，干燥曲线的走势随着微波功率的增大而越显陡峭。因为当微波功率增大，可加速水分子间的摩擦和振动速度，更容易产生摩擦热，促进升温。在真空环境下，水的汽化温度会因为蒸汽压的减小而降低，使得汽化的速度加快，从而加快干燥，缩短干燥时间。由图 1-B降水速率随含水率变化曲线可知，樱桃番茄的最大降水速率会随着微波功率的增大而提升。在微波真空干燥过程中，樱桃番茄的降水速率有加速、恒速以及减速3个阶段。在加速阶段中，樱桃番茄中的水分吸收微波辐射能，水蒸气的排出及单位时间内蒸汽的压力差和温度的压力差的升高，都迫使自由水向果体表面转移，使果体表面的水分优先受热蒸发，导致降水速率加快。在恒速阶段中，果体表面的水分扩散速率与内部的水分扩散速率基本保持平衡。在樱桃番茄微波真空干燥进入降速阶段后，干燥以脱去结合水为主，降水速率开始逐渐降低。
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图 1 不同微波功率下樱桃番茄的干燥曲线(A)和降水速率随含水率变化(B)Figure 1. Drying curves (A) and correlation between dehydration rate and moisture content (B) of cherry tomatoesprocessed at different microwave power2.1.2 真空度对樱桃番茄微波真空干燥特性的影响
由图 2-A干燥曲线可以得到，在微波功率、装载量因素保持不变的条件下，各个真空度(-55、-65、-75和-85 kPa)干燥所需时间分别为20、18、17和16 min，干燥所需时间随着真空度的提高而略有缩短，但差异并不显著。图中可得出，在真空度为-85 kPa的条件下，将樱桃番茄的干基含水率降至7%左右，所需的干燥时间较-55 kPa条件下的干燥时间缩短了4 min。提高微波真空干燥的真空度有降低水的沸点的作用，在一定程度上使樱桃番茄中水分的汽化和蒸发的温度降低。由图 2-B降水速率随含水率变化曲线可知，在不同真空度条件下，樱桃番茄的微波真空干燥过程分为加速、恒速及减速3个阶段，与不同微波功率下的过程阶段类似。樱桃番茄的最大降水速率随着真空度的增大而增大，但真空度不是越大越好，因为在高真空状态下进行微波干燥，不仅会增加能量损耗，还会产生击穿放电的危险[17]。因此，应根据情况选择适宜的真空度对樱桃番茄进行微波真空干燥。
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图 2 不同真空度下樱桃番茄的干燥曲线(A)和降水速率随含水率变化(B)Figure 2. Drying curves (A) and correlation between dehydration rate and moisture content (B) of cherry tomatoeswith varied degrees ofvacuum2.1.3 装载量对樱桃番茄微波真空干燥特性的影响
由图 3-A干燥曲线可以得出，在微波功率和真空度因素保持不变的条件下，不同的装载量(100、200、300和400 g)干燥所需时间分别为13、17、21和26 min。随着装载量的不断增大，干燥时间也会随之延长。这一现象的产生是由于在微波功率及真空度因素恒定的情况下，装载量越大，待干燥的樱桃番茄的总含水量也就越大，水分蒸发的表面积也就越大，从而导致单位质量的樱桃番茄吸收到的微波辐射能越少，单位时间内蒸发的水分质量减少，使干燥时间延长。由图 3-B降水速率随含水率变化曲线可得，在微波功率和真空度因素均不变，装载量不同的条件下，装载量越多，樱桃番茄的最大降水速率也越高。其微波真空干燥过程分为加速、恒速和减速3个阶段。其中，装载量越大，升速阶段越久。
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图 3 不同装载量下樱桃番茄的干燥曲线(A)和降水速率随含水率变化(B)Figure 3. Drying curves (A) and correlation betweendehydration rate and moisture content (B) cherry tomatoeswith different loading capacities2.2 樱桃番茄微波真空干燥动力学
2.2.1 干燥动力学模型介绍
目前，农业物料薄层干燥过程通常采用三种模型来描述[18-20]，即：
单项扩散模型：
MR=Ae−rt (1) 指数模型：
MR=e−rt (2) Page方程：
MR=e−rtN (3) 式中：MR=(Mt-Me)/(M0-Me)，MR为水分比，t为干燥时间，Mt为t时刻物料含水率，Me为平衡含水率，M0为初始含水率，A、r、N为待定系数。
由于Me值与Mt和M0相比很小，故设定Me为0，因此MR=(Mt-Me)/(M0-Me)可简化为MR=Mt/M0。
2.2.2 樱桃番茄真空微波干燥动力学模型
指数模型其实是单项扩散模型和Page方程模型的特殊形式，为便于分析，用单项扩散模型和Page方程模型来模拟樱桃番茄真空干燥的过程。
将单项扩散模型和Page方程模型式取对数化成线性，分别表示为：
ln(MR)=lnA−rt (4) ln[−ln(MR)]=lnr+Nlnt (5) 根据实验数据，分别绘制不同微波功率、真空度、装载量下的ln MR随干燥时间和ln t与ln[-ln(MR)]的关系曲线(图 4~6)。
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图 4 不同微波功率下lnMR随干燥时间(A)和lnt与ln[-ln(MR)](B)的关系Figure 4. Correlationsbetween t and lnMR (A) and between lnt and ln[-ln(MR)] (B) at different microwave power![]()
图 5 不同真空度下lnMR随干燥时间(A)和lnt与ln[-ln(MR)](B)的关系曲线Figure 5. Correlationsbetweent and lnMR (A) and between lnt and ln[-ln(MR)] (B) at different vacuum levels![]()
图 6 不同装载量下lnMR随干燥时间(A)和lnt与ln[-ln(MR)](B)的关系Figure 6. Correlationsbetweent and lnMR (A) and between lnt and ln[-ln(MR)] (B) at different loading capacities由图 4~6可知，ln(MR)与干燥时间t呈非线性关系，ln[-ln(MR)]与lnt呈线性关系，因此将Page方程作为樱桃番茄微波真空干燥动力学模型。令：
lnr=a+bx1+cx2+dx3 (6) N=e+fx1+gx2+hx3 (7) 式中：x1表示装载量(g)；x2表示真空度(kPa)；x3表示微波功率(W)；a、b、c、d、e、f、g、h为待定系数。
将(6)和(7)代入式(5)，可以得到
ln[−ln(MR)]=(a+bx1+cx2+dx3)+(e+fx1+gx2+hx3)lnt (8) 利用SPSS17.0统计软件对试验数据进行多元线性回归，求得方程线性拟合所需的各待定系数，结果如表 1所示。其中，F=472.734，P＜0.001，表明所求得的回归方程显著。回归方程的可决系数R2=0.948，说明模型拟合度较好，试验误差较小，得到回归方程如下：
ln[-ln(MR)]=(0.998+0.01x1+0.005x2-0.0023x3)+(-2.774+0.0013x1+0.0004x2+0.0019x3)ln t
即：MR=e-rtN，
r=e0.998+0.01x1+0.005x2-0.0023x3其中：N=-2.774+0.0013x1+0.0004x2+0.0019x3
式中：x1表示装载量(g)；x2表示真空度(kPa)；x3表示微波功率(W)。
2.3 动力学模型的验证
选取试验中的任意一组数据做验证试验，对上述得到的动力学模型进行进一步的准确性验证。所选取的试验条件为：微波功率2 kW，真空度-75 kPa，装载量200 g。将模型的预测值同该组所得的试验值进行比对(表 1、图 7)。由图 7可知，所选试验组的试验值与Page方程的预测值基本拟合，证明樱桃番茄在微波真空干燥中水分变化规律能够被该方程较为准确地反映，因此樱桃番茄的微波真空干燥过程可用此模型来预测。
表 1 樱桃番茄微波真空干燥动力学模型Table 1. Kinetic model of microwave-vacuum drying cherry tomatoes模型形式 待定系数 R2 F值 P值 MR=e-rtN a=0.998 0.948 472.723 ＜0.001 b=0.01 c=0.005 d=-0.0023 e=-2.774 f=0.0013 g=0.0004 h=-0.0019 ![]()
图 7 相同条件下试验值与预测值的比较Figure 7. Comparison between experimental and predicted data under same conditions3. 讨论与结论
本文通过对单因素试验的结果进行制图和拟合，可以得出：樱桃番茄在微波真空干燥过程具有加速、恒速及减速3个干燥阶段。在干燥的加速阶段和恒速阶段，樱桃番茄主要脱去的是细胞间的自由水。减速阶段，主要蒸发的是吸附和结合在有机固体物质上的结合水，降水速率明显降低。微波功率和装载量两个因素在樱桃番茄的干燥过程中对樱桃番茄的干燥时间有较明显的影响，而真空度的影响则较轻。微波功率越大，真空度越高，装载量越小，其干燥时间越短，含水率越低。试验结果显示：Page方程的预测值与试验值基本吻合，表明樱桃番茄在微波真空干燥过程中的规律可以被该模型正确地反映。该模型可较好地对樱桃番茄微波真空干燥过程中的水分变化做出预测。
致谢: 感谢福建省淡水水产研究所水产动物病害防治研究室为本研究提供了SIP微胶囊口服疫苗颗粒基础，饲料研究室协助制备了疫苗饲料；福建农林大学林旋老师在罗非鱼养殖过程中予以帮助；本研究还得到福建省水产技术推广总站中心实验室吴斌高级工程师的指导和同事李苗苗、王巧煌、邱西敏、元丽花的帮助，在此一并感谢！ -
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图 1 免疫后5个免疫相关基因在罗非鱼脾脏中的相对表达量
注：A为CD4，B为IL-8，C为IL-10，D为TNF-α，E为NF-κB。不同字母表示同一时间点不同处理组间相对表达量有显著性差异(P < 0.05)。
Figure 1. Expression of immunity-related genes in spleen of tilapia after vaccination
表 1 荧光定量PCR所用引物
Table 1 Primers used in qRT-PCR
引物名 引物序列(5′-3′) NCBI登录号 GAPDH-F CCAGGTGGTGTCCTCTGATT XM_005455438.2 GAPDH-R GTGCATGTACAGCAGCAGGT CD4-F GTTGATCTTGCACGGAGGTC XM_005455473.3 CD4-R ATGAACTGTCCCATCTGCCA IL-8-F CTGTCATGGTCTGCATCTC NM_001279704.1 IL-8-R GAGGAAGTGGTCTTCTGCT IL-10-F ATCAGTCCGTCGAAGACTCC KP645179.1 IL-10-R CAGAACACCAGCGTGGTTAG TNF-α-F GCTGGAGGCCAATAAAATCA NM_001279533.1 TNF-α-R CCTTCGTCAGTCTCCAGCTC NF-κB-F GCTGTGCAGTCTAACAGGTG XM_003454831.4 NF-κB-R ACCTTAAACTCCACCGTCGT 
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表 2 各实验组罗非鱼的免疫保护率
Table 2 RPS of tilapia in 3 groups
序号 分组 免疫途径 试验鱼数/尾 死亡数/尾 死亡率/% 相对免疫保护率/% 1 SIP疫苗 口服 30 10 33.3a 57a 2 阴性对照 口服 30 23 76.7b 3 灭活疫苗 注射 30 6 20.0a 74a 注：同列数据后相同字母表示差异不显著(P > 0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05)。
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