灵芝Ganoderma属真菌界Kingdom Fungi，担子菌门Basidiomycota，担子菌纲Basidiomycetes，多孔菌目Polyporales，多孔菌科Polyporaceae灵芝属Ganoderma^[1]，是中国传统药用真菌。

灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、不饱和脂肪酸、生物碱、甾醇类物质等^[2]。其中多糖和三萜两大类活性物质被认为是其主要药效成分，其含量可作为衡量栽培和野生灵芝质量的标准^[3]。灵芝多糖具有降“三高”、抗癌、提高免疫调节作用等活性^[4]；灵芝三萜具有保肝排毒、抑制肿瘤细胞、抗HIV病毒、降低胆固醇、调血脂和抗炎等活性^[5-6]。灵芝多糖和三萜类物质的提取纯化是对其分子结构、药理活性等进行深入研究的基础。

灵芝的药用价值被广泛发掘，人们对灵芝的需求日益增长。为满足市场需求，人工栽培灵芝逐渐成为灵芝生产的重要来源。目前对灵芝的研究趋于完善，适合人工栽培的品种被广泛推广，但灵芝基础研究一直难以取得突破性进展。目前市场上主要是以赤芝与紫芝作为栽培种，其他品种较少。野生灵芝可能有栽培灵芝所没有的优良性状，存在人们意想不到的优良品种。

野生灵芝和人工栽培灵芝的有效成分及药理作用是否有很大的差异，学术界意见不统一，分歧较大，可以说是众说纷纭，各执一词。曹恒生等^[7]对大别山野生灵芝和栽培灵芝子实体主要生化成分的含量进行比较研究，结果表明：野生灵芝的多糖含量比栽培灵芝的高。陈康林^[8]也认为在栽培灵芝中多糖含量只有野生的1/3左右，药理活性很强的灵芝酸含量已很低，各种有效成分的活性极低。吉清妹等^[9]分析认为，通过改进栽培技术可提高栽培灵芝的某些成分和功效，并优于野生灵芝。目前大多研究认为野生灵芝主要活性成分高于栽培灵芝，其大都是对不同菌株亦或不同种的野生灵芝与栽培灵芝主要活性成分的研究，实际意义低且不具备说服性，利用同一菌株野生子实体和栽培子实体进行比较，更具有说服性。

本研究以采集的野生灵芝作为试验对象，对组织分离后的野生菌株子实体进行ITS测序并构建系统进化树以确定野生菌株的种类，利用所采集的野生菌株进行组织分离人工代料培养得到栽培子实体，对其提取多糖和三萜，分析比较野生子实体与其栽培子实体的多糖和三萜含量，以期比较野生和栽培子实体利用价值，更好地挖掘利用野生灵芝的潜在价值，充分发挥栽培灵芝的功效。

1.   材料与方法

1.1   供试菌株

供试菌株为采集自漳州市云霄县的野生灵芝YX，采集自湛江市的野生灵芝ZJ，将野生灵芝进行组织分离人工代料培养得到的栽培灵芝YX(z)、ZJ(z)。

1.2   培养基

PDA固体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然。

LB液体培养基：胰蛋白胨10 g·L^-1、氯化钠10 g·L^-1、酵母粉5 g·L^-1、pH 7.0。

LB固体培养基：胰蛋白胨10 g·L^-1、氯化钠10 g·L^-1、酵母粉5 g·L^-1、琼脂15 g·L^-1、pH 7.0。

木屑培养基：木屑76%，麸皮20%，玉米粉3%，石膏1%。

1.3   子实体的组织分离

在超净工作台，用已灭菌的解剖刀在新鲜无病虫害的灵芝子实体边缘截取子实体内部的一小块菌管转到PDA斜面上，置于27℃生化培养箱中培养。待长出菌丝后，挑取边缘新鲜的菌丝块活化到新的PDA试管斜面，27℃培养。

1.4   ITS测序及比对

1.4.1   DNA的提取

制备PDA平板，挑取两个野生菌株的菌块接种到贴有玻璃纸的PDA平板中，封口倒置，27℃培养。待菌丝长满平板收集灵芝菌丝，于预冷研钵中加入液氮研磨成细粉。参照傅俊生改良的CTAB法^[10]提取供试菌株的总DNA。

1.4.2   ITS序列扩增及测序

参照White等^[11]ITS通用引物序列设计引物：ITS1：5′-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G- 3′；ITS4：5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC- 3′。其ITS- PCR 30 μL扩增体系：10×Buffer 3 μL，DNTP 2 μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，模版1 μL，ddH₂O 21.7 μL。反应程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min；4℃保存。

ITS- PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下成像保存。

选择YX、ZJ菌株，按照说明书的要求做产物的克隆试验。按照ITS体系和程序经PCR验证后，阳性克隆子委托福州博尚公司测序。

1.4.3   构建系统进化树

将测定的序列结果在NCBI数据库中进行比对，选择在线BLAST分析，再选取nucleotide blast得到与测定序列相近的序列结果。在CLUSTXAL1.83软件中将ITS序列对位排列并去掉两端差异的部分，用MEGA 6.0软件采用最大可能性法(Maximum Likelihood，ML)构建系统进化树，运行1 000次bootstrap检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性^[12]，根据Kimura-2法计算各序列间的进化距离^[13]。

1.5   灵芝主要活性成分的比较

1.5.1   子实体多糖的提取及检测

子实体多糖的提取：用粉碎机将干燥的灵芝子实体粉碎，并过孔径1 mm的筛子，精确称取2 g粉末，加蒸馏水到料液比为1:50，在90℃回流提取3 h，过滤，用旋转蒸发仪将提取液浓缩，定容至25 mL。吸取10 mL多糖提取液，加入80 mL无水乙醇，醇沉约12 h，5 000 r·min^-1离心10 min，将沉淀物定容至25 mL。采用改良后的苯酚-硫酸法^[14]检测子实体粗多糖。每组3个重复。

1.5.2   子实体三萜的提取及检测

结合黄书铭等^[15]与张志军等^[16]的灵芝中三萜化合物的提取方法：精确称取细粉末1 g，加85%乙醇25 mL(料液比1:25)，常温浸提2h，再超声30 min，过滤；滤液用旋转蒸发仪于60℃减压抽滤除去乙醇。色谱级甲醇溶解蒸干析出物，用容量瓶定容至25 mL。采用香草醛-冰醋酸法^[17]检测，每组3个重复。

1.5.3   子实体三萜的高效液相色谱法(HPLC)分析

提取液用0.45 μm的有机微孔过滤膜过滤备用，三萜的HPLC分析程序采用叶丽云等^[18]的方法。采用Inertsustain C18色谱柱，以0.1%乙酸水(A)和浓度梯度的乙腈(B)洗脱系统，洗脱比例B浓度为：0~20 min：30%~40%；20~25 min：40%~55%；25~30 min：55%~65%；30~40 min：65%~65%；柱温40℃，流速0.8 mL·min^-1，进样量10 μL，检测波长254 nm。

灵芝酸A标准样品图谱，精确称取4.0 mg的灵芝酸A晶体，用色谱级甲醇定容至50 mL，得到浓度为0.08 mg·mL^-1的灵芝酸A标准液。按照以上方法对其进行HPLC分析。其他标准样品的分析同理。

1.6   数据统计与分析

应用Excel 2010和SPSS 22.0数据分析软件对多糖、三萜提取结果进行统计分析，应用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版对各三萜酸含量及指纹图谱相似度进行统计分析。

2.   结果与分析

2.1   ITS克隆测序及系统进化树构建

克隆测序的菌株ITS序列已上传至NCBI，登录号为：MH023509。ITS琼脂凝胶电泳结果(图 1)，可以看出菌株YX、ZJ的ITS序列片段大小在500~750 bp，符合灵芝菌株的ITS序列片段在650 bp左右的现象。将克隆测序的菌株ITS序列置于NCBI数据库进行BLAST分析比对，结果表明菌株YX、ZJ为Ganoderma sp.。下载各组群比对结果相应的灵芝菌株ITS序列：G.lucidum-JQ520182.1和G.lucidum-JN222421.1，G.multipileum-JQ781874.1和G.multipileum-KJ868083.1，G.flexipes-JN383978.1和G.flexipes-JN383979.1；G.tsugae-JQ781853.1和G.tsugae-JQ781854.1，Ganoderma sp.，G.sinense-HQ235633.1和G.sinense-KF494998.1构建系统进化树。系统进化树(图 2)显示，采集的两个野生菌株YX、ZJ均属于Ganoderma sp.。

图  1  灵芝菌株ITS- PCR图谱

注：M为DL2000 DNA Marker，1为YX菌株，2为ZJ菌株。

Figure  1.  ITS-PCR spectra of Ganoderma sp.

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图  2  灵芝菌株系统进化树

Figure  2.  Maximum likelihood phylogenetic tree of Ganoderma sp.

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2.2   野生和栽培灵芝主要活性成分的比较

2.2.1   野生和栽培子实体多糖含量比较

两个G.sp.的野生和栽培子实体多糖含量如图 3所示。比较栽培子实体和野生子实体的多糖，可知野生子实体YX的多糖含量为7.93 mg·g^-1，约为相应菌株栽培子实体YX(Z)含量的77%；野生子实体ZJ的多糖含量为5.84 mg·g^-1，约为相应菌株栽培子实体ZJ(z)含量的87%。可以发现同一菌株其栽培子实体多糖含量明显高于野生子实体多糖含量。但是G.sp.-YX的野生子实体多糖含量高于G.sp.-ZJ的栽培子实体ZJ(z)，因此不同菌株的栽培子实体和野生子实体的多糖含量没有可比性。

图  3  灵芝野生和栽培子实体的多糖含量

注：YX(z)、ZJ(z)为栽培子实体，YX、ZJ为野生子实体。不同小写字母表示差异显著(P < 0.05), 图 4、6、7同。

Figure  3.  Polysaccharides in fruiting bodies of wild and cultivated Ganoderma of a same strain

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图  4  灵芝野生和栽培子实体的三萜含量

Figure  4.  Triterpenoids in fruiting bodies of wild and cultivated Ganoderma of a same strain

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图  6  灵芝野生和栽培子实体灵芝酸含量

Figure  6.  Ganoderic acid in fruiting bodies of wild and cultivated Ganoderma of a same strain

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图  7  野生和栽培的子实体三萜指纹图谱

注：S1表示G. sp.-YX的野生子实体，S2表示G.sp.-YX的栽培子实体。

Figure  7.  Fingerprint of triterpene in fruiting bodies of wild and cultivated Ganoderma of a same strain

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2.2.2   野生和栽培子实体三萜含量比较

两个G.sp.菌株的野生和栽培子实体三萜含量如图 4所示，比较栽培子实体和野生子实体的多糖，可知野生子实体YX的三萜含量为7.16 mg·g^-1，约为相应菌株栽培子实体YX(z)含量的77%；野生子实体ZJ的多糖含量为7.97 mg·g^-1，约为相应菌株栽培子实体ZJ(z)含量的75%，可以发现两个菌株的栽培子实体三萜含量均高于野生子实体的三萜含量。

2.2.3   灵芝子实体三萜的HPLC图谱比较

灵芝的3个三萜酸的标准样品HPLC指纹图谱如图 5所示，保留时间逐渐递增对应的标准样品为灵芝酸A、灵芝酸E、灵芝酸F，其保留时间分别为23.6、27.9、28.7 min。将G.sp子实体根据标准样品计算公式计算三萜酸含量，分别得出子实体的灵芝酸A、E、F含量(图 6)，分析三萜中各灵芝酸含量发现：G.sp子实体主要含灵芝酸F，且其栽培子实体灵芝酸含量为野生子实体的1.5倍左右。G.sp.-YX的野生和栽培子实体三萜HPLC图谱如图 8所示，虽然相似度计算结果很低(表 1)，野生子实体和栽培子实体的图谱相似度仅0.439，但是图 7显示两者的主要峰型一致，说明野生和栽培子实体的主要三萜酸成分相似。峰面积结果表明，G.sp.-YX的栽培子实体三萜酸含量总体高于野生子实体，因此从三萜酸成分和含量分析，说明野生的灵芝子实体并没有比栽培的好。结合其多糖和总三萜检测结果，栽培灵芝的子实体两大主要有效成分明显高于相应的野生子实体，说明栽培灵芝子实体的主要活性成分较高。

图  5  标准样品的指纹图谱

Figure  5.  Fingerprints of standard samples

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表  1  指纹图谱相似度比较

Table  1.  Similarity on fingerprints

项目	S1	S2	对照指纹图谱
S1	10.439	0.753
S2	0.439	10.922
对照指纹图谱	0.753	0.9221

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3.   讨论与结论

分子生物学技术手段是对灵芝菌株进行分类鉴定的有效方法，ITS序列能够有效分析近缘种对其进行分类鉴定^[19]。通过野生灵芝ITS序列的凝胶电泳图谱得知ITS片段大小500~750 bp，符合灵芝菌株的片段大小。克隆测序菌株，在NCBI数据库进行BLAST比对，确定两野生灵芝是G.sp.种类。利用下载的相应灵芝菌株ITS序列与试验菌株的ITS序列构建系统进化树，确定了两个野生灵芝属于G.sp.种群。

通过提取两个G.sp.菌株的野生和栽培子实体多糖、三萜含量，得出两个G.sp.菌株的栽培子实体三萜含量均高于野生子实体的三萜含量，野生子实体三萜含量约为相应菌株栽培子实体三萜含量的75%，对其多糖含量的比较分析略有不同，同一菌株的栽培子实体多糖含量明显高于其野生子实体多糖含量，然而G.sp.-YX的野生子实体多糖含量高于G.sp.-ZJ的栽培子实体多糖含量。因此不同菌株的栽培和野生子实体没有可比性，只能说明同一菌株的栽培子实体的多糖比野生子实体的要高。

高效液相色谱法检测三萜类化合物，快速、简便、灵敏、分离度好，适用于灵芝子实体、孢子粉、发酵菌丝体及相关制剂的三萜类物质检查和含量测定。通过HPLC对野生和栽培的同菌株子实体的三萜酸成分分析得知：G.sp三萜酸种类丰富，且含量高，其主要峰面积显示有5种含量较高的三萜酸，因此认为G.sp的三萜酸成分方面开发价值较高。将G.sp子实体和标准样品进行匹配得出其主要含有灵芝酸F。从野生和栽培子实体三萜HPLC图谱三萜酸成分和含量分析可知野生的灵芝子实体并没有比栽培好。

结合其多糖和总三萜检测结果可知，同一菌株栽培的子实体两大主要有效成分明显高于相应的野生子实体，可以得出本研究中同一灵芝菌株的栽培子实体优于野生子实体。数据处理分析结果表明，对于同一菌株来说野生灵芝并不一定比栽培的有效成分要高，相反栽培子实体的主要活性成分高于野生子实体，因为是对同一菌株的野生子实体和栽培子实体的主要活性成分分析，较之前人所研究的不同种抑或是不同菌株野生和栽培子实体主要活性成分而言更具有比较性和说服性。且通过数据比较证明不同菌株栽培和野生子实体没有可比性，无法得出一致的结论，从侧面说明关于野生灵芝要优于人工栽培灵芝的说法有待商榷，人工栽培灵芝主要活性成分不比野生灵芝差。本研究对人工栽培灵芝提出更正确客观的认识，为市场上灵芝产品的选择提供参考，同时充分挖掘利用野生灵芝菌株的潜在价值，为野生灵芝驯化必要性提供理论依据。