Formation of Proteus mirabilis Persister in Chicken under Gentamicin Sulphate Treatment
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摘要: 为了解奇异变形杆菌持留菌形成特征和防控家禽养殖中细菌性疾病，以鸡源致病菌奇异变形杆菌PM2658为研究对象，通过二倍稀释法测得抗生素对鸡源奇异变形杆菌PM2658的最小抑菌浓度（Minimum inhibitory of concentration，MIC），用斑点培养（spot-plate）法分析PM2658在不同抗生素和营养条件下持留菌形成特征。结果显示，硫酸庆大霉素、头孢噻肟钠、氧氟沙星对PM2658的MIC值分别为1.56、0.78和3.13 μg·mL-1。在16×MIC和100×MIC硫酸庆大霉素处理下，鸡源奇异变形杆菌PM2658都可以形成持留菌，形成率分别为8.04×10-4和1.03×10-6。16×MIC硫酸庆大霉素-4×MIC头孢噻肟钠、16×MIC硫酸庆大霉素-4×MIC氧氟沙星、4×MIC头孢噻肟钠-4×MIC氧氟沙星、16×MIC硫酸庆大霉素-4×MIC头孢噻肟钠-4×MIC氧氟沙星不同抗生素组合处理下，鸡源奇异变形杆菌PM2658的持留菌形成规律与单独硫酸庆大霉素处理的持留菌形成规律一致，也表明鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌具有多重抗生素耐受性。在16×MIC硫酸庆大霉素处理下，与LB和1/2 LB培养条件相比，1/5 LB培养条件下鸡源奇异变形杆菌持留菌形成率最高，比前两者分别提高了17.67倍和5.05倍，说明鸡源奇异变形杆菌持留菌的形成还与营养环境密切相关。持留菌遗传学特性检测结果显示，鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌的遗传学特性并没有发生改变。鸡源奇异变形杆菌确实可以形成持留菌，其形成特征取决于特定的抗生素条件。Abstract: For understanding the biological characteristics of persister formation of Proteus mirabilis, and control and prevention of bacterial diseases in poultry, Proteus mirabilis PM2658 from chicken was used as materials. Minimum inhibitory of concentrations (MIC) of antibiotics to Proteus mirabilis PM2658 were determined by two-fold dilution method. Under different antibiotic treatments and nutritional conditions, the characteristics of persister formation of Proteus mirabilis were determined by spot-plate protocol. Results showed that MIC of gentamicin sulphate (Gen), cefotaxime sodium (Cef) and ofloxacin (Ofx) to Proteus mirabilis PM2658 were 1.56, 0.78 and 3.13 μg·mL-1, respectively. Treated by 16×MIC and 100×MIC of Gen, stationary phase of Proteus mirabilis PM2658 could form persister, and the percentages of persister formation were 8.04×10-4 and 1.03×10-6, respectively. Moreover, the regularity of peresister formation under antibiotic combinations of 16×MIC Gen-4×MIC Cef, 16×MIC Gen-4×MIC Ofx, 4×MIC Cef-4×MIC Ofx, 16×MIC Gen-4×MIC Cef-4×MIC Ofx was the same as that of single Gen treatment, indicating that persister of Proteus mirabilis PM2658 had multiple drug tolerance. The rate of formation of Proteus mirabilis PM2658 persister in 1/5 LB was higher than those in LB and 1/2 LB under 16×MIC Gen treatment, which separately increased by 17.67 times and 5.05 times, which indicated that the formation of Proteus mirabils PM2658 persister was related to nutrition of environment. The heritage of Proteus mirabilis PM2658 persister did not change, which was further determined after every different treatments mentioned above. Taken together, Proteus mirabilis from chicken do form persister, and characteristics of persister formation depends on specific antibiotic.
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Keywords:
- Proteus mirabilis /
- drug tolerance /
- persister /
- gentamicin sulphate
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抗生素是人类控制和治疗细菌感染的重要手段，但在首例耐药细菌报道的同时，抗生素治疗中的细菌持续存在(Persistence)问题也随之产生[1]。细菌可以通过基因突变对抗生素产生耐药性，但是对抗生素耐受的持留菌(Persister)及其子代并没有产生抗生素耐药性，而是在暴露于致死剂量的抗生素治疗时，它们始终以一种休眠或缓慢生长的状态存在[2]。由于抗生素只能靶向功能活跃的细胞，不能有效作用不活跃或休眠的持留菌，所以抗生素治疗结束后，持留菌又开始恢复正常生长，重新感染。
持留菌现象相当普遍，目前研究得比较清楚的主要有结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和类鼻疽伯克氏菌等[1, 3-5]。奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)属于肠杆菌科变形杆菌属，是泌尿道感染的主要病原菌之一(仅次于大肠埃希菌)，女性第一次尿道感染后约20%会复发，80%感染过2次尿道感染的女性仍会再复发[6]。2014年Borgman CJ报道一位84岁泪囊炎病人，虽已进行经典的抗生素治疗，但是仍反复出现泪囊炎；进一步对这位病人眼部分泌物进行培养，发现导致泪囊炎反复发病的是很少在眼部出现的奇异变形杆菌[7]。临床实践显示奇异变形杆菌存在持留菌现象。奇异变形杆菌还是家禽养殖的重要病原微生物，各日龄的鸡群均可感染。在环境改变、季节更替、转群和混合感染其他病原时，鸡群抵抗力下降，病情加重，病死率升高，给家禽养殖业带来巨大的经济损失[8]。硫酸庆大霉素是奇异变形杆菌治疗常用的抗生素，研究结果显示，硫酸庆大霉素已经无法高效控制鸡源奇异变形杆菌所引起的感染[9]。这一现象可能是由鸡源奇异变形杆菌产生耐药性引起的，也可能是因为持留菌导致的。目前还没有关于硫酸庆大霉素作用下鸡源奇异变形杆菌持留菌形成特征的相关报道。本研究以本实验室分离的鸡源奇异变形杆菌PM2658为研究对象，首先分析奇异变形杆菌对抗生素的药敏性，研究奇异变形杆菌在不同条件下持留菌形成特征和抗生素耐受性，以期为控制鸡源奇异变形杆菌流行传播提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 菌种和培养基
鸡源奇异变形杆菌PM2658，由闽南师范大学福建省生物实验教学示范中心保存，来源于感染奇异变形杆菌的雏鸡肝。鸡源奇异变形杆菌PM2658用LB(Luria-Bertani)培养基培养。LB液体培养基配方如下：10 g蛋白胨、5 g酵母粉、10 g NaCl，调节pH值至7.4~7.6；LB固体培养基加入琼脂15 g。为了抑制奇异变形杆菌在固体培养基上的迁移生长，形成单个菌落，在LB固体培养基里加入0.1%苯酚。水解酪蛋白培养基(Mueller-Hinton，MH)用于抗生素对细菌最小抑菌浓度(Minimum inhibitory of concentration，MIC)的测定。
1.2 抗生素配制
10 mg·mL-1硫酸庆大霉素(Gentamicin sulphate，Gen)，无菌水配制，0.22 μm滤器过滤除菌；10 mg·mL-1头孢噻肟钠(Cefotaxime sodium，Cef)，二甲基亚砜配制；5 mg·mL-1氧氟沙星(Ofloxacin，Ofx)，冰醋酸配制，0.22 μm滤器过滤除菌。所有抗生素均于-20℃保存。
1.3 试验方法
1.3.1 鸡源奇异变形杆菌最小抑菌浓度(MIC)测定
利用二倍稀释法[10]，挑取鸡源奇异变形杆菌PM2658单菌落于LB培养基中，37℃培养至A600为0.5~0.8，用MH稀释A600为0.02，同时用MH培养基两倍稀释Gen、Cef和Ofx在一定的浓度范围内。取100μL上述稀释好的细菌至100 μL含有相应抗生素的MH培养基中，37℃培养24 h，岛津UV-1750分光光度计测定波长为600 nm处的光吸收值，分析MIC值。试验重复3次。
1.3.2 鸡源奇异变形杆菌在硫酸庆大霉素不同浓度下形成持留菌的比较
根据Hofsteenge等[5]的报道，LB培养基培养鸡源奇异变形杆菌PM2658至稳定期，用LB培养基稀释至A600为0.2，分别加入Gen使终浓度为16×MIC和100×MIC，在2、4、6和12 h不同处理时间点，取菌液100 μL，8 000 r·min-1离心5 min，0.85%生理盐水洗涤1次，10倍连续稀释抗生素处理过的菌液和A600为0.2未处理的菌液，取5 μL斑点培养(spot-plate)于不含抗生素LB培养基上，37℃培养，24 h后计菌落形成个数(CFU，Colony-forming unit)。GraphPad Prism 6软件分析持留菌形成率，持留菌形成率=每毫升抗生素处理过菌液的CFU/每毫升A600为0.2未处理菌液的CFU。利用软件SPSS 25分析在不同浓度下持留菌形成率是否有显著性差异。
1.3.3 奇异变形杆菌持留菌遗传特性的检测
为了检测1.3.2中及下面实验中经抗生素处理后在普通LB培养基上生长的菌落不是基因突变产生的抗生素耐药菌株，把经抗生素处理后的菌液平行地斑点培养于含有相应浓度抗生素的LB培养基上，37℃培养，24 h后观察生长情况[11]。随机挑取1.3.2中及下面经过抗生素处理后在不含有抗生素LB培养基上生长的菌落，培养至对数期，按照二倍稀释法，测定其MIC值[10]。
1.3.4 鸡源奇异变形杆菌持留菌抗生素多重耐受性的分析
取稳定期的鸡源奇异变形杆菌PM2658，按照1.3.2和1.3.3的方法测定其在不同抗生素组合下的持留菌形成情况和遗传学特性，抗生素组合如下：16×MIC Gen-4×MIC Cef、16×MIC Gen-4×MIC Ofx、4×MIC Cef-4×MIC Ofx、16×MIC Gen-4×MIC Cef-4×MIC Ofx。
1.3.5 鸡源奇异变形杆菌不同营养条件形成持留菌的研究
分别在LB培养基、1/2 LB培养基和1/5 LB培养基中，培养鸡源奇异变形杆菌PM2658至稳定期，在16×MIC Gen处理下，采用1.3.2和1.3.3的方法测定其持留菌形成率和遗传学特性。
2. 结果与分析
2.1 鸡源奇异变形杆菌PM2658药敏性分析
通过二倍稀释法测得Gen、Cef和Ofx对鸡源奇异变形杆菌PM2658的MIC值分别为1.56、0.78和3.13 μg·mL-1。
2.2 鸡源奇异变形杆菌在不同硫酸庆大霉素浓度下形成持留菌的情况
不同Gen浓度下持留菌的形成情况分析结果(图 1)表明，经16×MIC和100×MIC Gen处理，稳定期的鸡源奇异变形杆菌在最初4 h数量急剧下降，随后Gen的杀菌速率几乎为零，表明形成了数量相对稳定的具有Gen耐受能力的持留菌。PM2658在16×MIC Gen和100×MIC Gen处理下，持留菌形成率分别为8.04×10-4和1.03×10-6。在100×MIC Gen处理下持留菌形成率比16×MIC Gen处理下持留菌形成率下降了两个数量级别，并且两组间持留菌形成率有显著性差异，显示在100×MIC Gen高致死浓度下鸡源奇异变形杆菌PM2658仍然可以形成持留菌。
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图 1 不同Gen浓度下鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌形成情况Figure 1. Formation of P. mirabilis PM2658 persisters under various concentrations of Gen2.3 鸡源奇异变形杆菌持留菌的遗传学特性
为了确认上述研究中的鸡源奇异变形杆菌PM2658遗传特性是否发生改变，把经过16×MIC和100×MIC Gen处理的鸡源奇异变形杆菌菌液斑点培养在含有相应浓度Gen的LB培养基上，结果(图 2)显示，经16×MIC和100×MIC Gen处理的鸡源奇异变形杆菌在含有相应浓度Gen的LB培养基上都未长出菌落，但在不含抗生素培养基上都可以正常生长。除此之外，随机挑取上述的在不含抗生素培养基上生长出来的单菌落，测定得到它们对Gen的MIC值与原始出发菌株PM2658一致，均为1.56 μg·mL-1。说明鸡源奇异变形杆菌持留菌PM2658药敏性没有发生改变；在高致死浓度抗生素处理下，鸡源奇异变形杆菌生理状态发生了改变，进入了持留菌状态，能够在高致死浓度抗生素作用下生存；也显示了鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌的遗传学特性没有发生改变。
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图 2 鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌遗传学特性检测结果注：A为未经抗生素处理PM2658和经16×MIC和100×MIC Gen处理4 h后持留菌在不含抗生素培养基上的生长情况；B为经过16×MIC和100×MIC Gen处理4 h后持留菌在含有相应浓度Gen培养基上的生长情况。Figure 2. Growth of P. mirabilis PM2658 persisters on culture media containing different amount of Gen2.4 鸡源奇异变形杆菌持留菌多重抗生素耐受性
本试验还研究了Gen与其他抗生素组合下鸡源奇异变形杆菌持留菌形成情况。图 3显示鸡源奇异变形杆菌PM2658在16×MIC Gen、4×MIC Cef和4×MIC Ofx 3种抗生素环境下作用4 h后持留菌形成数量趋于稳定，形成率分别为5.77×10-4、4.29×10-3和3.12×10-4。在Cef作用下，持留菌形成率高于Gen和Ofx一个数量级，提示Cef对鸡源奇异变形杆菌的有效性正在逐渐减弱。不同抗生素组合对鸡源奇异变形杆菌PM2658的杀菌规律与单独抗生素的杀菌规律一致。稳定期的PM2658在16×MIC Gen-4×MIC Cef、16×MIC Gen-4×MIC Ofx、4×MIC Cef-4×MIC Ofx、16×MIC Gen-4×MIC Cef-4×MIC Ofx处理4 h后都能不同程度地形成持留菌，形成率分别为9.43×10-5、3.59×10-5、6.46×10-5和1.07×10-6。说明鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌的形成取决于特定的抗生素条件，并可以形成具有多重抗生素耐受性的持留菌。在进行上述研究的同时，还进一步分析持留菌的药敏性，均与原始出发菌株PM2658一样，表明持留菌没有因为不同抗生素条件导致遗传特性的变化。
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图 3 鸡源奇异变形杆菌持留菌多重抗生素耐受性注：A为持留菌对Gen-Cef耐受性；B为持留菌对Gen-Ofx耐受性；C为持留菌对Gen-Cef-Ofx耐受性。Figure 3. Multi-drug tolerance of P. mirabilis PM2658 persisters2.5 不同营养条件下鸡源奇异变形杆菌持留能力
用16×MIC Gen分别处理在LB培养基、1/2 LB培养基和1/5 LB培养基生长至稳定期的奇异变形杆菌PM2658，结果如图 4所示。1/2 LB和1/5 LB培养基培养条件相对于普通的LB培养基更有利于持留菌的形成，持留菌形成率分别提高了3.51和17.67倍，说明奇异变形杆菌持留菌的形成与外界营养环境密切相关。随机测定不同营养条件下形成的持留菌在普通LB培养基上生长的菌落的Gen MIC值，均为1.56 μg·mL-1，说明它们对Gen的药敏性与起始菌株一样。
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图 4 鸡源奇异变形杆菌不同营养条件下持留菌形成特征Figure 4. Formation of P. mirabilis PM2658 persisters under varied nutritional conditions3. 讨论
近些年随着广谱及超广谱抗生素的广泛应用，奇异变形杆菌对一些常见的经典抗生素的敏感性逐渐下降，给治疗带来了极大的困难，包括氨苄西林、头孢唑林、头孢呋辛、四环素、复方新诺明、环丙沙星、诺氟沙星、氨苄西林/舒巴坦、头孢噻肟、左旋氧氟沙星、头孢曲松、头孢克洛和庆大霉素等，提示它们均已逐渐不能再高效地控制奇异变形杆菌引起的感染[12]。在本研究中鸡源奇异变形杆菌持留菌不仅具有高致死浓度Gen的耐受性，而且还具有同时对Gen和其他抗生素的多重耐受性。这些均提示奇异变形杆菌可以通过产生耐药性，还可以通过形成持留菌，以提高对抗生素的耐受性。2008年，Pearson MM等[13]首次完成了奇异变形杆菌HI4320的全基因组测序，为奇异变形杆菌持留菌形成特征和抗生素耐受机制的分析提供了有利条件。
为了降低细菌持续存在的危害，目前最为行之有效的办法之一就是针对持留菌生物学形成特征及其抗生素耐受机制进行研究，筛选新的药物作用靶点，阻断持留菌的产生和抗生素耐受性。持留菌现象相当普遍，除了抗生素条件之外的一些其他不利环境，包括氧化胁迫、营养缺失、群体效应、DNA损伤和胞内胁迫等也会促进持留菌的产生[14-18]。在本试验中，1/5 LB培养基中鸡源奇异变形杆菌持留菌形成率比LB和1/2 LB培养基中均有不同程度的提高，说明鸡源奇异变形杆菌持留菌的形成确实与营养环境密切相关。持留菌的产生是细菌瞬时获得和胁迫信号双重作用下的应激反应(Stringent response, SR)。研究结果表明大肠杆菌hipA7突变株持留菌数量增加了100~1 000倍，HipA毒素可以影响核酸和蛋白质的合成，破坏对于细菌利用营养物质构建蛋白质至关重要的化学“信号”过程，细菌将其解读为一种“饥饿信号”，使得细菌进入到失活的状态，从而促进产生持留菌的应激反应[19-20]。但是，当大肠杆菌和铜绿假单胞菌relA和spoT基因缺失后，持留菌的产生却减少了[19, 21]。持留菌产生的应激反应还依赖于RelA和SpoT介导的(p)ppGpp的合成，(p)ppGpp可以调控基因的表达来促进细菌的存活[22]。持留菌形成及其抗生素耐受机制涉及细菌生存进化的复杂过程，目前关于持留菌及其抗生素耐受机制的相关报道相对于细菌耐药机制少之又少。本研究初步揭示了奇异变形杆菌持留菌在Gen作用下的形成特性，为今后进一步研究持留菌抗生素耐受机制、重要致病菌奇异变形杆菌药物靶位的筛选提供科学的理论依据和实践基础，为新型、高效药物的研发，以及重大细菌性疾病的防治奠定基础。
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图 1 不同Gen浓度下鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌形成情况
Figure 1. Formation of P. mirabilis PM2658 persisters under various concentrations of Gen
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图 2 鸡源奇异变形杆菌PM2658持留菌遗传学特性检测结果
注：A为未经抗生素处理PM2658和经16×MIC和100×MIC Gen处理4 h后持留菌在不含抗生素培养基上的生长情况；B为经过16×MIC和100×MIC Gen处理4 h后持留菌在含有相应浓度Gen培养基上的生长情况。
Figure 2. Growth of P. mirabilis PM2658 persisters on culture media containing different amount of Gen
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图 3 鸡源奇异变形杆菌持留菌多重抗生素耐受性
注：A为持留菌对Gen-Cef耐受性；B为持留菌对Gen-Ofx耐受性；C为持留菌对Gen-Cef-Ofx耐受性。
Figure 3. Multi-drug tolerance of P. mirabilis PM2658 persisters
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