Evaluation on 20 Lentinula edodes Strains Using ISSR and F-MSAP Markers
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摘要: 利用简单序列重复区间扩增多态性（inter-simple sequence repeat，ISSR）和荧光标记甲基化敏感扩增多态性（fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism，F-MSAP）分子标记技术对收集到的20株香菇Lentinula edodes菌株进行遗传及甲基化多样性分析。ISSR结果表明，8对引物共可扩增出98条稳定清晰可辨的条带，其中多态性条带89条，多态性比率为90.82%，样品间的遗传相似系数范围为0.520 4~0.989 7。F-MSAP结果表明，15对引物共扩增产生13 487个CCGG位点。在全部检测位点中，半甲基化位点为1 704个，平均半甲基化率12.6%；全甲基化位点为1 865个，平均全甲基化率13.8%。进一步将MSAP数据分为甲基化敏感多态性（methylation sensitive polymorphism，MSP）和甲基化不敏感多态性（methylation insensitive polymorphism，MISP）。Mantel检测结果表明，ISSR与MISP分子标记的分析结果有显著的相关性，但ISSR与MSP分子标记的分析结果无显著相关性。说明香菇不同株系间广泛存在DNA甲基化多样性，在育种中具有重要的应用价值。Abstract: The inter-simple sequence repeat (ISSR) and fluorescence-labeled methylation-sensitive amplified polymorphism (F-MSAP) markers were used to evaluate the genetic diversity of 20 Lentinula edodes strains. Ninety-eight bands were detected by 8 ISSR primers, of which 90.82% were polymorphic. The coefficient of pairwise genetic similarity ranged from 0.520 4 to 0.989 7.A total of 13 487 CCGG sites were detected using 15 selected primer pairs. Among the sites, 1 704 were of hemi-methylation with an average rate of 12.63%, and 1 865 of full-methylation with an average rate of 13.83%. The MSAP data were further divided into methylation sensitive polymorphisms (MSP) and methylation insensitive polymorphisms (MISP) groups. A significant correlation between ISSR and MISP was found by the Mantel test, while none between ISSR and MSP. It appeared that there was a significant methylation diversity among various L. edodes which could be of value for the breeding purpose.
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Keywords:
- Lentinula edodes /
- ISSR /
- methylation /
- MSAP
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简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)是基于简单重复序列扩增多态性(simple sequence repeat, SSR)建立的一种分子标记技术[1]。与SSR技术相比，ISSR无须知道物种基因组信息即可在全基因组范围上分析物种的遗传多样性，与常用的分子标记RAPD、RFLP、AFLP和SSR相比，具有操作简便、检测成本低、稳定性好等优点，目前已广泛应用在食用菌菌株鉴定[2]、遗传分析[3]及杂交育种[4]等方面。
DNA甲基化是广泛存在于生物体中的一种DNA转录后修饰过程，是表观遗传学研究的热点之一，主要研究在DNA序列不改变的情况下通过DNA序列的甲基化修饰进而影响基因表达和生物体的表型变化，如真菌的生长发育[5]、环境胁迫[6]等现象。研究表明，甲基化在物种进化中发挥着重要作用，且基因组中单核苷酸甲基化多态性通常高于DNA序列本身的变异，由于部分甲基化变异导致的表观遗传学变化可以在后代中稳定遗传[7]，因此通过甲基化位点多样性分析进而发掘与重要农艺性状相关的基因位点，可为分子辅助育种提供帮助。甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism, MSAP)技术因其敏感度高、操作简便，成为动物、植物及微生物全基因组DNA甲基化水平与模式常用的技术手段[5-8]。而荧光标记甲基化敏感扩增多态性F-MSAP (fluorescence-labeled methylation sensitive amplified polymorphism)基于MSAP利用荧光标记选择性扩增引物，通过毛细管电泳检测，具有更高的灵敏性和检测效率。
本研究采用ISSR和F-MSAP两种分子研究方法对20株香菇菌株基因组DNA进行分析，以期为香菇表观遗传学研究及香菇高产优质新品种的选育提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
20株香菇菌株均为福建省农业科学院食用菌研究所收集保藏，其中17株为栽培菌株，3株为采自福建建瓯的野生菌株(L2016-1、L2016-2、L2016-5)。
限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司。Taq酶和dNTPs购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.2 菌丝培养与DNA提取
香菇菌丝的培养参考Möller等[9]的方法，采用改良的CTAB法进行DNA提取[10]。
1.3 引物
8个ISSR引物(P2、P4、P5、P6、P7、P8、P16、P20)[3]和15对F-MSAP引物(选择性扩增引物HM1、HM2、HM3在5′端加上FAM荧光标记)[6]由上海生工生物工程公司合成。
1.4 ISSR和F-MSAP分析
ISSR的PCR扩增体系(25 μL)为：DNA约50 ng，10 × PCR Buffer 2.5 μL，引物0.3 μmol·L-1，dNTPs 1 μmol·L-1，MgCl2 1.5 mmol·L-1，Taq DNA聚合酶1.25 U。PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s, 55~62℃ 45 s，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃ 10 min，16℃保存。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测。
F-MSAP的酶切、连接、预扩增及选择性扩增按文献[6]的方法操作。
1.5 条带统计
ISSR条带根据琼脂糖凝胶电泳结果某一相同迁移率位置上出现条带的标记为“1”，未出现条带的标记为“0”。利用GeneMarker 2.2软件对毛细管电泳结果的峰值进行扫描及数据收集，再根据无带和有带情况转化为0，1数据矩阵。根据EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双酶切产生的条带差异，参考ZHAO等[11]的方法将甲基化模式分为3种类型：Ⅰ型为非甲基化位点，即EcoRⅠ/HpaⅡ和EcoRⅠ/MspⅠ双酶切组合中均能出现的条带的位点，记作(1，1)；Ⅱ型为半甲基化位点，即EcoRⅠ/HpaⅡ组合中有条带，而EcoRⅠ/MspⅠ组合中没有条带的位点，记作(1，0)；Ⅲ型为全甲基化位点，即EcoRⅠ/HpaⅡ组合中无条带，而EcoRⅠ/MspⅠ组合中有条带的位点，记作(0，1)。
根据Cervera等[12]的方法，将F-MSAP产生的条带类型分为2个二维矩阵：甲基化非敏感多态性矩阵(methylation insensitive polymorphisms，MISP)，将条带类型为(1，1)的标记为“1”，其他类型的均标记为“0”；甲基化敏感多态性矩阵(methylation sensitive polymorphisms，MSP)，将条带类型为(1，0)和(0，1)的标记为“1”，其他类型的均标记为“0”。
1.6 数据分析
利用软件NTsys 2.10e对不同的数据矩阵进行UPGMA聚类分析，遗传相似性采用简单匹配系数(simple matching coefficient)法。不同类型相似性矩阵间的相关性采用软件NTsys 2.10e的Mantel检测法(1000次随机排列)。
2. 结果与分析
2.1 20株香菇菌株的ISSR分析
利用8对ISSR引物对20株香菇菌株的基因组DNA多态性分析显示：8对引物共可扩增出98条稳定清晰可辨的条带，其中多态性条带89条，多态性比率为90.82%。各引物扩增的条带数为8~16个，片段大小在250~3 000。样品间的遗传相似系数范围为0.520 4~0.989 7，表明野生香菇菌株与栽培菌株种间亲缘关系较远，栽培菌株间L135与L808间亲缘关系较远，其遗传相似系数为0.581 6。根据ISSR扩增数据构建的20株香菇菌株的UPMGA聚类树状图(图 1)可将其分为3大类。栽培菌株与野生菌株在相似系数约0.61处分属不同分枝。
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图 1 20株香菇ISSR分析的UPMGA聚类Figure 1. UPMGA dendrogram based on ISSR data on 20 L. edodes strains2.2 20株香菇菌株的F-MSAP分析
2.2.1 DNA甲基化水平
利用15对引物对20个香菇菌株进行甲基化多态性分析，结果见表 1。共扩增产生13 487条DNA片段，平均每个样本每对引物扩增获得约45条片段。在全部检测位点中，半甲基化位点为1 704个，平均半甲基化率12.64%，其中Zhongxiang-68和L2016-5半甲基化率最高为15.32%，Cr66最低为9.21%；全甲基化位点为1 865个，平均全甲基化率13.85%，其中L236全甲基化率最高为36.61%，L939最低为8.26%；L236总甲基化水平最高为48.41%，L26最低为22.13%，平均总甲基化率为26.49%。
表 1 20株香菇DNA甲基化水平分析Table 1. Analysis of methylation polymorphisms on 20 L. edodes strains菌株 带型 半甲基化率/% 全甲基化率/% 总甲基化率/% Ⅰ Ⅱ Ⅲ Cr04 516 101 70 14.70 10.19 24.89 Cr66 538 64 93 9.21 13.38 22.59 L01 502 78 101 11.45 14.83 26.28 L04 484 85 106 12.59 15.70 28.30 L135 490 78 78 12.07 12.07 24.15 L18 510 91 70 13.56 10.43 23.99 L20 537 76 88 10.84 12.55 23.40 L2016-1 449 77 89 12.52 14.47 26.99 L2016-2 478 100 82 15.15 12.42 27.58 L2016-5 503 108 94 15.32 13.33 28.65 L236 341 78 242 11.80 36.61 48.41 L241-4 537 77 84 11.03 12.03 23.07 L258 497 74 91 11.18 13.75 24.92 L26 549 79 77 11.21 10.92 22.13 L808 504 74 88 11.11 13.21 24.32 L9015 500 89 70 13.51 10.62 24.13 L921 479 81 91 12.44 13.98 26.42 L939 503 97 54 14.83 8.26 23.09 Wuxiang-1 498 91 114 12.94 16.22 29.16 Zhongxiang-68 503 106 83 15.32 11.99 27.31 注：总扩增位点= Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ；甲基化总位点= Ⅱ+Ⅲ；总甲基化率=(Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)；全甲基化率=Ⅲ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)；半甲基化率= Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)。 2.2.2 MISP和MSP矩阵聚类分析
进一步将MSAP矩阵拆分为MSP和MISP矩阵。根据MISP矩阵进行聚类分析(图 2)，可将野生菌株和栽培菌株分为2大组，而在栽培菌株组中L236单独聚为一枝，其他栽培菌株的聚类分析结果与ISSR类似；根据MSP矩阵进行聚类分析的结果(图 3)与ISSR和MISP矩阵分析的结果差异较大，在相似系数约0.75处，L236、Wuxiang-1和L921首先分别聚为3个不同分枝，其他的栽培菌株和野生菌株则聚为一个大的组，进一步可分为野生菌株组和栽培菌株组。进一步采用Mantel检验(1000次随机排列)分析ISSR与MSP、MISP产生的相似性系数矩阵间的相关性水平，结果表明：ISSR与MSP相似性系数矩阵间的相关系数为0.14，两者间相关性不显著(P=0.143)；ISSR与MISP相似性系数矩阵间的相关系数为0.63，且显著相关(P < 0.01)。
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图 2 20株香菇MISP分析的UPMGA聚类Figure 2. UPMGA dendrogram based on MISP data on 20 L. edodes strains![]()
图 3 20株香菇MSP分析的UPMGA聚类Figure 3. UPMGA dendrogram based on MSP data on 20 L. edodes strains3. 讨论与结论
根据ISSR和MSAP的聚类分析结果看出，ISSR分析原先聚为一枝的部分菌株通过MSAP分析进一步从原分枝中区分出来，推测表观遗传多样性相对于序列变异更具有多发性，且可以通过MSAP分析检测出来[13]。本研究发现，MSP与ISSR间的相关系数为0.14，遗传与表观遗传多样性间存在负相关性，甲基化多样性和遗传多样性是分开的，两者间可能通过不同的机制产生或维持[14]。在MSP和MISP分析中，野生香菇菌株和栽培菌株分为明显不同的分支，推测在香菇种间存在物种特异的DNA甲基化多态性，且可以稳定遗传下去，而且还可能被选择促使这物种的遗传和表观遗传分化[14]。
MSAP技术是在AFLP技术基础上建立起来的分子标记技术，是目前常用的表观遗传学研究技术之一，仅需较少的引物组合即可检测出大量的甲基化位点[15]。越来越多的研究表明DNA甲基化可以产生可遗传的变异。目前关于香菇多样性的研究大多采用ISSR、RAPD或SRAP等遗传多样性研究技术[3, 16]，但这些标记不能检测由于DNA甲基化或染色质异构等表观遗传学造成的差异。遗传和表观遗传多样性同为生物多样性的重要基础，因此本研究利用ISSR和F-MSAP技术分析了不同香菇菌株基因组甲基化多态性，为香菇种质资源鉴定、分析及遗传育种研究提供参考。
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图 1 20株香菇ISSR分析的UPMGA聚类
Figure 1. UPMGA dendrogram based on ISSR data on 20 L. edodes strains
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图 2 20株香菇MISP分析的UPMGA聚类
Figure 2. UPMGA dendrogram based on MISP data on 20 L. edodes strains
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图 3 20株香菇MSP分析的UPMGA聚类
Figure 3. UPMGA dendrogram based on MSP data on 20 L. edodes strains
表 1 20株香菇DNA甲基化水平分析
Table 1 Analysis of methylation polymorphisms on 20 L. edodes strains
菌株 带型 半甲基化率/% 全甲基化率/% 总甲基化率/% Ⅰ Ⅱ Ⅲ Cr04 516 101 70 14.70 10.19 24.89 Cr66 538 64 93 9.21 13.38 22.59 L01 502 78 101 11.45 14.83 26.28 L04 484 85 106 12.59 15.70 28.30 L135 490 78 78 12.07 12.07 24.15 L18 510 91 70 13.56 10.43 23.99 L20 537 76 88 10.84 12.55 23.40 L2016-1 449 77 89 12.52 14.47 26.99 L2016-2 478 100 82 15.15 12.42 27.58 L2016-5 503 108 94 15.32 13.33 28.65 L236 341 78 242 11.80 36.61 48.41 L241-4 537 77 84 11.03 12.03 23.07 L258 497 74 91 11.18 13.75 24.92 L26 549 79 77 11.21 10.92 22.13 L808 504 74 88 11.11 13.21 24.32 L9015 500 89 70 13.51 10.62 24.13 L921 479 81 91 12.44 13.98 26.42 L939 503 97 54 14.83 8.26 23.09 Wuxiang-1 498 91 114 12.94 16.22 29.16 Zhongxiang-68 503 106 83 15.32 11.99 27.31 注：总扩增位点= Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ；甲基化总位点= Ⅱ+Ⅲ；总甲基化率=(Ⅱ+Ⅲ)/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)；全甲基化率=Ⅲ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)；半甲基化率= Ⅱ/(Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)。 
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