猪流行性腹泻(Porcine epidemc diarrhea，PED)由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起猪群发生呕吐、腹泻、脱水以及哺乳仔猪高死亡率为特征^[1]的高度传染性疾病。所有不同阶段的猪均可感染。该病在许多养猪业发达的国家都已有爆发的报道, 并导致造成了重大的经济损失^[2]。

PED首次是在1971年于英国报道^[3]，1978年在比利时和英国首次得到鉴定^[4]，我国于1984年证实该疾病的存在^[5]。近年来，由于PEDV发生了变异，导致广泛流行，尤其以韩国、日本、中国、泰国和越南等国家发病严重^[6-9]。自2010年秋以来, 首先我国部分省份出现了严重的仔猪流行性腹泻, 后蔓延至全国，发病情况比先前更为凶猛，造成仔大量的哺乳仔猪死亡，尤其是7日龄以内的仔猪死亡率高达100%，给养殖户造成了巨大的经济损失，并已成为影响我国养猪业健康发展的重要疫病之一。由于PED与猪传染性胃肠炎(TGE)等其他腹泻疾病在流行病学、临床症状等变化上非常相似，加上病毒变异，这给该病的快速诊断与防治都带来了一定困难。本研究通过采用单克隆抗体制备技术，制备获得特异性强和滴度高的PEDV单克隆抗体，对建立该病的快速诊断与防控技术具有重要意义, 更为今后开展PEDV抗原表位识别及病毒蛋白研究奠定良好基础。

1.   材料与方法

1.1   试验动物、细胞和病毒

6~8周龄SPF级Babl/C小鼠，购自吴氏实验动物有限责任公司，Vero细胞、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0) 由本实验室保存，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均由本实验室分离保存，猪流行性腹泻病毒(PEDV)由本实验室通过空斑纯化技术获得保存。

1.2   试剂与培养液

DMEM、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶、HAT、HT选择培养基均购自Sigma公司；羊抗鼠FITC购自武汉博士德生物工程有限公司；新生牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。NAb^TMSpin Kits试剂盒和单克隆抗体亚级份检测试剂盒购自Thermo公司。

1.3   PEDV培养与纯化

将PEDV接种于Vero细胞单层，于37℃感作45 min，加维持液，培养2~3 d，当细胞病变达85%以上时，收集冻融3次，收获细胞毒。细胞毒经超声裂解后，10 000 r·min^-1离心60 min，取上清液，45 000 r·min^-1离心180 min，用0.01 mol·L^-1PBS(pH 7.2) 悬浮沉淀，即为粗提病毒；取粗提病毒铺依次垫于30%~60%蔗糖-PBS，33 000 r·min^-1离心180 min，收集条带病毒，PBS重悬，40 000 r·min^-1离心180 min洗脱蔗糖，PBS重悬沉淀即为纯化的病毒抗原。同时以未接种病毒的Vero细胞同样处理，作为阴性抗原。

1.4   蛋白浓度的测定

蛋白浓度测定采用NaNodrop2000仪器, 其方法按说明书进行。

1.5   间接ELISA方法

病毒抗原用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释，包被于ELISA板条，100 μL·孔^-1，置37℃孵育2 h或4℃过夜，0.01 mmol·L^-1 PBST洗涤液洗涤3次，用1.5%BSA-PBST封闭，300 μL·孔^-1，37℃ 2 h，洗涤同上，加入杂交瘤细胞培养上清液，100 μL·孔^-1，37℃反应60 min，同上洗涤，加1：40000稀释的羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶，100 μL·孔^-1，37℃反应45 min，同上洗涤后，加入OPD 100 μL·孔^-1，37℃避光显色15 min，2 mol·L^-1 H₂SO₄终止反应，在自动酶联检测仪上测定各孔的OD₄₉₀值，以P：N≥2.1时，判断为杂交瘤细胞分泌抗体阳性。

1.6   杂交瘤细胞株的建立

1.6.1   Balb/c小鼠的免疫

将纯化PEDV抗原(4 mg·mL^-1)与等体积弗氏完全佐剂乳化后，皮下多点注射6周龄Babl/C鼠4只，0.2 mL·只^-1。于初次免疫后第14、28、42 d，取病毒抗原与弗氏不完全佐剂等量混匀乳化，进行二免、三免和四免，于融合前3 d用等量病毒经尾静脉加强免疫。

1.6.2   细胞融合

无菌取免疫小鼠脾脏，分散脾淋巴细胞，1 000 r·mim^-1离心10 min, 将细胞疏松后加10 mL 0.17 mmol·L^-1 NH₄CL，冰浴10 min，同上离心，疏松、重悬于10 mL DMEM, 同时收集SP2/0细胞，按脾细胞和SP2/O细胞按8：1的比例混合，1 000 r·min^-1离心5 min，疏松后1 min内缓缓加入1 mL 37℃预热的PEG进行细胞融合，缓慢加入DMEM 20 mL，同上离心，疏松细胞后，重悬杂交瘤细胞于含20%牛血清的HAT-DMEM培养基中，调节脾细胞数量，加到96孔细胞培养板，0.1 mL·孔^-1，置37℃，5%CO₂培养箱中培养，第5 d补加0.1 mL含15%牛血清的HT-DMEM，观察生长情况，待细胞长至孔底的1/3，或培养液变黄时，上清进行抗体检测。

1.6.3   阳性杂交瘤细胞的筛选

用间接ELISA筛选杂交瘤细胞生长孔特异性抗体，从检出的阳性孔中，挑选OD值高、细胞形态好生长旺盛且不与正常细胞培养物交叉的阳性孔，进行有限稀释法克隆。

1.6.4   饲养层细胞的制备

取8周龄左右的Babl/C小鼠，腹腔注射10 mL DMEM，轻揉小鼠腹腔数次，用灭菌针头在超净台内引出注入的DMEM。计数后调整细胞浓度加入96孔细胞培养板，100 μL·孔^-1，置37℃，5%CO₂培养箱中。

1.6.5   阳性细胞的克隆

采用有限稀释法，取经ELISA初筛为阳性细胞，用含20%牛血清的HT-DMEM逐步稀释至每毫升20个细胞，加到含饲养层细胞的96孔培养板中，每孔滴加1滴，置37℃，5%CO₂培养箱中培养。5 d后观察克隆细胞生长情况，挑选只含一个细胞克隆的孔待细胞克隆生长至1/3孔底或上清液变黄时，取上清用间接ELISA检测。连续克隆直至克隆孔阳性率达100.0%。

1.7   腹水制备

1.7.1   Babl/C小鼠诱导

8周龄Balb/c小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡进行诱导，分笼饲养7 d。取对数生长期的杂交瘤细胞，经1 500 r·min^-1离心5 min沉淀细胞，用不含血清的DMEM约1 mL重悬，腹腔注射石蜡诱导的Babl/C鼠，每只小鼠注射0.8×10⁶杂交瘤细胞。

1.7.2   收集腹水

约7~10 d后观察小鼠腹部，有产生腹水的小鼠腹部会明显膨大。此时采用引流收集腹水，1 000 r·min^-1，离心15 min，收集上层淡黄色腹水，用Thermo公司生产的NAb^TMSpin Kits试剂盒进行纯化，测定效价，做好标记，冻于-70℃备用。

1.8   PEDV感染细胞的制备及免疫荧光试验(IFA)

将PEDV接种于已长成单层的Vero 96孔细胞板，培养至30%细胞出现病变时，弃上清，PBS洗涤1次，每孔加入预冷甲醇100 μL，4℃固定30 min，弃甲醇，PBS洗涤1次，晾干后，-30℃冻存备用。同样处理不接毒的Vero细胞用于阴性对照。IFA检测时，于上述细胞板中每孔加入30 μL杂交瘤细胞培养上清液于37℃作用30 min，用生理盐水洗涤3次，每次5 min，加FITC每孔50 μL，37℃作用30 min，洗涤同上，甩干，加50%PBS-甘油，每孔30 μL。于倒置荧光显微镜下观察。

1.9   单克隆抗体特性分析

1.9.1   单克隆抗体亚级份的测定

按照单克隆抗体分型试剂盒说明书进行。

1.9.2   单克隆抗体中和能力测定

参考文献^[10]进行。采用固定病毒稀释抗体的方法测定各株单抗对PEDV的中和能力。将克隆抗体腹水10^-1开始进行10倍比稀释至10^-6，取各稀释度的单克隆抗体与等体积病毒液混合，37℃感作45 min，然后接种单层Vero细胞。试验设正常细胞对照、阴性腹水对照和病毒对照。接种24 h后观察细胞病变(CPE)，连续观察96 h，按Karber法计算中和效价。

1.9.3   细胞株稳定性试验

将具有分泌特性的杂交瘤细胞体外连续培养2个月，每2周检测其上清液的抗体效价；将液氮冻存的阳性杂交瘤细胞每个月复苏1次，连续2个月，测定上清抗体效价。

1.9.4   单克隆抗体特异性的测定

应用间接ELISA和IFA方法检测腹水与Vero细胞、PRRSV、TGEV和CSFV的交叉反应性。

1.9.5   单克隆抗体ELISA效价测定

应用间接ELISA检测杂交瘤培养上清液和腹水抗体的效价，腹水用抗体稀释液按10倍稀释成10^-8~10^-1，杂交瘤细胞上清液用抗体稀释液稀释成2^-10~2^-1 ，测定OD₄₉₀值，以P：N≥2.1时的最高稀释度为抗体的ELISA效价。

1.9.6   单克隆抗体荧光效价测定

应用间接免疫荧光法测定杂交瘤培养上清液和腹水的荧光特性，杂交瘤细胞上清液用抗体稀释液稀释成2^-10~2^-1 ，腹水用抗体稀释液按10倍稀释成10^-8~10^-2，以出现特异荧光的最高稀释度为单抗的IFA效价。

1.9.7   Western bloting试验

参照文献^[10]方法, 分别以PEDV抗原和Vero细胞抗原进行SDS-PAGE电泳。转印至NC膜用TBS-T封闭, 4℃过夜, TBS-T洗膜3次, 加1：100倍稀释的腹水单克隆抗体, 37℃作用2 h，洗涤, 加入羊抗鼠IgG碱性磷酸酶标记抗体(1：10 000), 室温反应2 h, 同上洗涤, 显色。

2.   结果与分析

2.1   PEDV的培养、纯化及浓度测定

将PEDV接种于Vero细胞单层3 d后细胞病变达85%(图 1、2)，经冻融、裂解及蔗糖-PBS梯度离心后，收集30%~40%病毒条带，经鉴定为PEDV后，测定蛋白质量浓度为4 mg·mL^-1。

图  1  病变Vero细胞

Figure  1.  Cytopathic effect on Vero cells

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图  2  正常Vero细胞

Figure  2.  Normal Vero cells

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2.2   PEDV单克隆抗体的制备

2.2.1   ELISA筛选方法的建立

经方阵滴定法测定，当每孔抗原包被质量浓度为25 μg·mL^-1、血清稀释度为1：2 000或每孔抗原包被质量浓度为35 μg·mL^-1、血清稀释度为1：4 000时，阳性血清OD₄₉₀值均达1.0，阴性血清的OD₄₉₀ 值较小，在0.08以下，最终确定最佳每孔抗原包被质量浓度为25~35 μg·mL^-1。

2.2.2   杂交瘤细胞株的建立

融合8块96孔细胞板，获得256个融合阳性孔, 阳性率为33.3%，其中抗体分泌较强阳性的细胞孔36株。经多次有限稀释后，获得2株能稳定分泌抗PEDV抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为E1和H6。这2株细胞在体外连续培2个月，能稳定分泌抗体，经液氮冻存、复苏后，细胞生长良好，且上清液抗体效价不变。

2.3   单克隆抗体特性分析

2.3.1   单克隆抗体Ig类别和亚类

经过抗体亚型试剂盒鉴定，2株单克隆抗体在亚类鉴定中E1属于IgG2a，H6株属于IgM。

2.3.2   单克隆抗体的中和活性

E1株和H6株单克隆抗体都不能抑制病毒的增殖，说明2株单克隆抗体无中和病毒的活性。

2.3.3   单克隆抗体ELISA和IFA效价

E1和H6单克隆抗体的培养上清液的ELISA效价分别为2⁶和2⁴，腹水抗体效价分别为10⁵和10⁴(图 3)。

图  3  PEDV单克隆抗体IFA染色结果

注：A为E1单克隆抗体，B为H6单克隆抗体，C为阴性对照。

Figure  3.  IFA of two McAbs on Vero cellsinfected by PEDV

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2.3.4   单克隆抗体特异性鉴定

ELISA结果表明：2株单抗均能识别PEDV毒株；间接免疫荧光试验(IFA)结果表明：单抗都不与Vero细胞、TGEV、PRRSV和CSFV发生反应，说明单克隆抗体的特异性好。

2.3.5   Western bloting试验

本试验获得的2株单克隆抗体，其中E1株能识别PEDV中约31 ku蛋白(M蛋白)，H6株能识别PEDV中约56 ku蛋白(N蛋白), 而不识别其他蛋白, 说明1株是针对M蛋白，另外1株是针对N蛋白。

3.   讨论

猪流行性腹泻病毒属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属^[11]，主要的结构蛋白包括：纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中M蛋白在PEDV毒株间具有高度的保守性^[12]，在补体存在的条件下, 它可诱导机体产生中和抗体。N蛋白位于病毒粒子的内部，与病毒基因组RNA相互缠绕构成病毒的核衣壳，在同种病毒间也具有高度的保守性，参与病毒的复制, 其介导的特异性细胞免疫对于病毒的感染十分重要^[13]。另外，PEDV的细胞培养与其他冠状病毒比, 在体外培养难, 细胞病变不明显, 抗体滴度也不高，这给抗原分离培养带来较大困难。基于PEDV的较难培养特性，丁壮^[14]等通过PEDV猪体内的传代毒和人工感染猪的粪便中纯化出病毒，制备了抗PEDV的杂交瘤细胞株，另外，还有许多学者^[15-16]利用体外表达病毒结构蛋白作为抗原，制备抗猪流行性腹泻病毒克隆抗体。

本研究利用从猪传染性胃肠炎-猪流行性腹泻-轮状病毒的三联弱毒疫苗中，通过空斑纯化技术，纯化获得PEDV弱毒，该病毒能在Vero细胞中稳定高效增殖，其TCID₅₀/100 μL达到10^-6.0；通过蔗糖梯度差速离心纯化，利用纯化抗原免疫小鼠，脾细胞与SP2/0细胞进行杂交融合，获得2株抗体效价高、特异性强、稳定性好的抗PEDV单克隆抗体，其中1株为IgG2a亚型，能识别PEDV的M蛋白, 另外1株为IgM，能识别PEDV的N蛋白。研究表明，PEDV的M蛋白和N蛋白在病毒的进化过程中都是比较保守稳定的蛋白，研制出相应的单克隆抗体，能为PEDV的早期诊断、防控、病毒免疫靶标识别及蛋白质组学的研究奠定良好基础。

本试验在单克隆抗体的制备过程中，曾疑使用PEDV弱毒株能否制备出效价高的单克隆抗体，但经过实践表明，SPF级Balb/c小鼠经过多次免疫，在杂交瘤细胞制备过程中注重无菌操作，把握融合时间，能获得高效价的单克隆抗体。本研究虽然筛选到能分泌阳性抗体的杂交瘤细胞数量较少，阳性率不是很高，但经过多次有限稀释克隆和特异性筛选，最终获得2株抗体效价高的单克隆抗体E1和H6株，这说明PEDV弱毒株经高度浓缩纯化后，仍具有很好的免疫原性，能刺激小鼠产生高效免疫应答，这为今后制备单克隆抗体的过程中，选择抗原方面提供了一个新思路。