Remediation Effect of Biological Agents on Rhizosphere Soil on Land of Continuously Cropped Panax notoginseng
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摘要: 本研究探讨有益微生物复合菌剂（Effective Micoorganisms，EM）与木霉菌剂（Trichoderma，TRI）对三七连作障碍的消减作用及其作用机理。结果表明：EM和TRI处理的重茬三七出苗率、保苗率、产量均显著提高；EM处理的重茬土壤中的各营养指标均有所提高，TRI处理的重茬土壤中的速效钾等营养指标显著提高；HPLC分析发现，重茬三七根际土壤的酚酸含量未出现累积效应，可见三七连作障碍的发生并非是由化感物质的直接作用造成的，可能与化感物质对根际环境的间接作用有关；变性梯度凝胶电泳（DGGE）、荧光定量PCR（qRT-PCR）原位分析验证结果发现两种菌剂处理均能使连作土壤中的有益菌含量增加，有害菌含量减少，其中TRI的处理效果更为显著。说明这两种菌剂处理均可有效修复三七根际土壤，缓解连作障碍，同时显著提高三七产量，达到了预期效果。Abstract: Two biological agents, EM and TRI, were applied in soil on a continuous cropping field of Panax notoginseng to study the remediating effect on the soil and the mechanism associated with the application. Treatments with the agents were found significantly increased the seedling emergence rate and survival rate as well as the root yield. All nutrients in the soil treated with EM were increased, while the available potassium in the soil treated with TRI significantly improved. The HPLC analysis showed no accumulation of phenolic acids in the rhizosphere soil by these treatments indicating that allelochemicals were not directly, but might indirectly, involved in the detrimental effect on P. notoginseng caused by continuous cropping. The DGGE and qRT-PCR test results showed that both EM and TRI, especially TRI, could increase the population of beneficial, while depressed the harmful, bacteria in the soil. Thereby, the rhizosphere soil was effectively repaired by alleviating the deficiency brought about by the continuous cropping practice, and consequently, the growth and yield of P. notoginseng was significantly recovered or improved.
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三七Panax notoginseng又名田七，享有“金不换”、“南国神草”之美誉，是一种具有活血化瘀、消肿止疼等疗效的传统中药材[1-2]。由于三七对环境要求较高，故其生长的适宜地区狭窄，主要集中于云南省文山、砚山、建水等地及广西壮族自治区的部分县市[3]。此外，三七与太子参、地黄等多种药用植物一样，存在严重的连作障碍问题，即正常的田间经营管理下，长期在同一区域种植的同类中药材会出现抵抗力下降、产量品质恶劣，易受病虫害侵袭等现象，主要表现为烂根、萎蔫、产量低、药效差。三七种植一茬后的田地需要轮作玉米、旱稻等作物至少10年，有些学者认为轮作间隔甚至需要长达30年[4]，这就严重制约了三七产业和区域经济的可持续发展。
关于连作障碍形成的原因主要集中于以下三方面：土壤理化性质恶劣，根系分泌物的化感自毒作用，病原微生物及土传病害增加[5-6]。刘莉等[7]研究中提到相同作物在生长过程中对土壤养分的吸收情况是有规律的，一种作物长期连作，会按一定比例吸收和释放某些元素及营养物质，这会导致土壤中某些元素或物质的亏缺而另一些元素或物质的增加，进而影响连作植物的健康生长，使萎蔫率增加，产量和质量下降。有报道指出，植物在生长发育过程中会向土壤中释放大量代谢物质，同一种植物在同一地块连续种植，其根部分泌物不断积累，达到一定浓度后，会对植物的生长产生抑制作用[8]。同时，连作还使土壤中的某些病原微生物连年繁殖并积累，造成土传病害[9]。微生物菌剂是一种含有活菌的生物制剂，具有增加土壤肥力，提高植株抵抗力等多种功能。大量研究表明，微生物菌剂通过向土壤中引入有益微生物，改善土壤环境，调节微生物区系失衡，在缓解连作障碍问题上有着良好的发展前景[10-13]。本研究从连作障碍形成的原因入手，探讨两种微生物菌剂(EM和TRI)的添加对连作三七土壤理化性质和根际微生物群落的影响，以期缓解连作障碍，为三七产业的可持续发展及其他同样存在连作障碍问题的作物的研究提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验地概况与供试材料
试验地位于云南省文山州文山市苗乡三七实业有限公司的三七种植基地内，供试土壤为砂质壤土，土壤肥力中等。供试品种为“云南三七”。供试微生物菌剂：EM菌剂(乳酸杆菌、光合细菌、酵母与放线菌等微生物的复合群体)、TRI菌剂(哈茨木霉菌)。
1.2 田间试验及取样
试验设置以未种植三七土壤为对照(CK)、设头茬三七(New planted，NP)、重茬未处理三七(Second planted，SP)、重茬EM处理三七(Effective microbe，EM)、重茬TRI处理三七(Trichoderma，TRI)土壤4种处理，每个处理设置3个重复。同时，取头茬发病(Disease plant in new planted，DP-NP)三七植株的根际土壤，与重茬三七的根际土壤进行对比，以探究两者之间是否具有相同的灾变机制。三七种植前，不同处理均用适量农家肥加复合肥作为基肥。EM菌剂处理过程为：在第二茬三七移栽前1个月，将EM菌剂按剂量配置，浇灌土壤，盖膜密封，20 d后，掀膜翻耕，移栽三七，在三七出苗后，每隔1个月，配置EM菌剂溶液浇灌土壤。TRI菌剂处理过程为：在第二茬三七移栽前1个月，将TRI菌剂按剂量配置，撒施土壤，利用拖拉机翻耕入土拌匀，移栽三七，在三七出苗后，每隔1个月浇灌1次。
移栽4个月后，对三七出苗率进行田间统计；在三七收获时，对三七保苗率进行田间统计。三七收获后，对产量进行统计。采集三七根际土壤样品时，首先用五点交叉取样法采集同一地块的植株，将其连根整个挖出后去除表层0~5 cm的土壤，抖落根部疏松土壤，用刷子刷掉根部附着土，将各处理的3个重复根际土混合均匀后装入无菌取样袋。采集回来的土样一部分自然风干，过2 mm筛，用于土壤理化性质的测定，另一部分存放在4℃冰箱，用于土壤酚酸提取及微生物分析。
1.3 土壤重要营养化学性质的测定
土壤中全氮和碱解氮分别用凯氏定氮法和碱解扩散法测定；全磷和速效磷分别用NaOH-钼锑抗比色法和0.5 mol·L-1 NaHCO3浸提-钼锑抗显色法测定；全钾和速效钾均用火焰光度法测定[14]；用pHS-3C酸度计检测土样的pH值，其中土与水之比为2.5:1。
1.4 土壤酚酸提取与HPLC分析
以土:NaOH=1:5的比例配制土与1 mol·L-1 NaOH的混合体系，置于25℃、200 r·min-1摇床，振荡12 h。取出后涡旋振荡30 min，10℃、12 000 r·min-1离心10 min。收集上清液，用4 mol·L-1 HCl调上清液，pH为2.5。再次10℃、12 000 r·min-1离心10 min，收集上清液。用与上清液等体积的乙酸乙酯萃取4~5次，留上层有机相。将萃取液45℃旋转蒸发至全干，后用100%色谱级甲醇超声溶解，在超净台将溶解液用0.22 μm有机相滤膜过滤，-20℃避光保存。
以时间为横坐标，峰面积为纵坐标，制作单一酚酸标准曲线，根据标准曲线得出线性方程及相关系数，选择最适宜浓度混合酚酸标准出峰图与土样HPLC出峰图分析定位土样中的酚酸种类，运用公式计算不同处理下的土壤样品中的酚酸含量。本试验检测的酚酸为以下6种(图 1)：没食子酸、香豆酸、丁香酸、香兰素、阿魏酸、苯甲酸。HPLC色谱条件：C18柱子(Inertsil ODS-SP，4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30℃，波长为280 nm；A相：2‰磷酸水溶液，B相：100%色谱级甲醇，流速为0.8 mL·min-1。色谱程序：0~4 min，B相40%；4~6 min，B相35%；6~20 min，B相35%~50%；20~25 min，B相50%[15-17]。
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图 1 混合酚酸与土样酚酸HPLC出峰注：1为没食子酸；2为香豆酸；3为丁香酸；4为香兰素；5为阿魏酸；6为苯甲酸。Figure 1. HPLC on mixed and soil phenolic acids samples1.5 DGGE指纹图谱分析
称取0.5 g土壤样品，利用Bio Flux土壤基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取方法按试剂盒所示。设计特异引物对提取的总DNA进行PCR扩增，为了确保基因的完整性及更好地分离条带，共进行两轮PCR扩增。第一轮PCR使用真菌扩增引物ITS1-F、ITS4对真菌的18S rDNA基因中的ITS区扩增[18-20]，反应体系：总体积为25 μL，即Mix12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，模板DNA1 μL，无菌水9.5 μL。反应程序：94℃预变性4 min；94℃变性30 s；55℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，72℃延伸10 min，10℃保存。1.2%琼脂糖核酸凝胶跑胶纯化后，用OMEGA Bio-ter试剂盒回收纯化产物，并测定回收产物的浓度。将纯化产物使用GC夹子进行第二轮PCR扩增，与第一轮不同的是，引物是GC-FR1和ITS2-D。结束后，将回收产物保存于-20℃。将含有约250 ng DNA的PCR产物与Loading buffer混合均匀后加入DGGE变性胶胶孔中进行DGGE电泳分析。电泳运行条件为：1×TAE缓冲液，电压80 V，温度60℃，电泳时间为11~14 h。电泳结束后，用硝酸银银染，氢氧化钠显色，经扫描仪扫描得DGGE图片。利用Quantity One软件对DGGE结果进行分析[21-24]。
1.6 特异条带鉴定
对特异条带进行切胶回收，获得DGGE回收产物。将DGGE回收产物用第二轮的引物GC-FR1、ITS2-D进行PCR，体系程序同上，结束后切胶回收，得PCR回收产物。取4 μL PCR回收产物与0.6 μL pEASY-T1载体连接，PCR仪上25℃反应7 min，得连接产物后转化到Trans-T1 Phage Resistant感受态细胞中，涂布到LB固体培养基(含氨苄青霉素50 μg·mL-1、X-gal 50 μg·mL-1、IPTG 20 μg·mL-1)上，置于37℃恒温培养箱培养14 h，这时有蓝白斑出现，挑选带有Amp+抗性的白色单菌落，加入到带有相应抗性的LB液体培养基(5 mL LB+5 μL Amp+)中，37℃，180 r·min-1，培养6~8 h。
取阳性克隆的菌液送往铂尚生物技术有限公司测定DNA序列，测序结果在GenBank上进行BLAST同源性比对分析，选择同源性最近(98%~100%)的序列数据，初步确定特异条带的菌属。
1.7 荧光定量qRT-PCR原位分析
对特异菌群设计特异引物，用于荧光定量qRT-PCR。用无菌水将各土壤样品总DNA质量浓度稀释至20 ng·mL-1，进行qRT-PCR分析。根据位小丫等[20]的方法，计算各个关键真菌菌落在不同处理下三七根际土壤中的丰度。
1.8 数据处理
采用Quantity One-4.6.2、DPS v7.05及EXCEL等软件对数据进行统计分析和作图。
2. 结果与分析
2.1 不同菌剂处理对连作三七生长的影响
由图 2可知，头茬(NP)三七与重茬(SP)三七的生长状况及产量存在显著差异(P＜0.05)，头茬出苗率、保苗率及产量均居于首位，重茬则反之，其中重茬保苗率及产量极低，达到几乎绝收的状态。而经EM处理的三七，出苗率、保苗率分别比重茬增加49.76%、16.13%；经TRI处理的三七，出苗率、保苗率分别比重茬增加47.63%、32.47%。同时，两种菌剂处理均能显著提高重茬三七的产量。
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图 2 不同处理下的三七出苗率、保苗率及产量Figure 2. Seedling emergence and survival rate and root yield of P. notoginseng under treatments2.2 不同菌剂处理对连作三七根际土壤中营养元素含量的影响
由表 1可知，与对照和头茬相比，重茬土壤中的各项营养元素含量均显著降低(全钾除外)，速效钾含量锐减，降为头茬的1/4；EM处理的重茬土壤中的各营养指标与重茬相比均有所提高，其中碱解氮、速效磷、速效钾分别比重茬增加11%、5%、39%；TRI处理的重茬土壤中的各营养指标与重茬相比显著提高，其中碱解氮、速效磷、速效钾分别比重茬增加78%、18%、166%。NP-DP的各项营养指标与CK相差不大。
表 1 不同处理对连作三七根际土壤中营养元素含量的影响Table 1. Effect of treatments on soil nutrient content in monocultured P. notoginseng rhizosphere soil处理 全氮/(g·kg-1) 全磷/(g·kg-1) 全钾/(g·kg-1) 碱解氮/(mg·kg-1) 速效磷/(mg·kg-1) 速效钾/(mg·kg-1) pH CK 1.29±0.80a 0.22±0.01c 0.75±0.06e 112.58±4.40a 29.54±0.32b 140.83±2.55b 6.49±0.03b NP 0.66±0.83c 0.22±0.01c 3.66±0.06c 42.58±11.65b 24.84±0.12d 155.87±2.55a 6.72±0.11a NP-DP 1.01±0.89b 0.25±0.02b 0.95±0.09d 109.67±9.95a 34.65±0.11a 125.25±1.67c 6.43±0.05b SP 0.22±0.84d 0.12±0.01d 3.57±0.07c 18.08±1.01d 22.70±0.21f 41.75±1.67f 6.03±0.05c EM 0.29±0.90d 0.14±0.01d 4.07±0.08a 20.42±2.02cd 23.72±0.18e 57.34±0.96e 5.95±0.02c TRI 0.58±0.35c 0.37±0.01a 3.83±0.10b 32.67±9.63bc 26.80±0.64c 109.11±0.96d 6.72±0.15a 注：①CK为空白对照；NP为头茬；NP-DP为头茬发病；SP为重茬未处理；EM为有益微生物处理；TRI为木霉菌剂处理。②同列数据后不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。表 2同。 2.3 不同菌剂处理对连作三七根际土壤酚酸含量的影响
根际土壤中的6种酚酸总量按大小顺序排列为：TRI＞CK＞NP-DP>NP>SP>EM，酚酸总量分别为：101.65、91.16、32.87、12.16、9.75、2.13 mg·kg-1。研究发现，除没食子酸外，头茬中大部分酚酸的含量都略高于重茬，其中头茬中检测到的苯甲酸在重茬中的含量几乎为零；EM处理下的重茬土壤中的各种酚酸含量均低于重茬土壤，而木霉菌剂处理下的重茬土壤中，除阿魏酸外，其他5种酚酸含量均大幅度增加，特别是香兰素。此外，头茬发病植株土壤中的各种酚酸含量均高于头茬正常生长植株的土壤，其苯甲酸含量与所有土样相比居于首位(图 3)。
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图 3 不同处理下连作三七根际土壤酚酸含量Figure 3. Phenolic acids in rhizosphere soil of P. notoginseng under monoculture regime2.4 不同处理下的三七根际土壤DGGE图谱分析
如图 4所示，相邻的3个泳道是1个样品的3个重复，共18条泳道。可以看出，各土壤样品的电泳分离条带皆密集繁多，条带亮暗程度存在差异。根据DGGE指纹图谱中的条带信息，对各样品的丰富度、均匀度等指标进行分析，结果如表 2所示。分析发现，与对照和头茬相比，重茬的SIMPSON(J)、SHANNON(H)等指数均下降，而经EM处理的重茬土壤中的这两项指数有所提高；各土壤样品的均匀度相差不大，其中EM处理的土壤样品的均匀度最大，为0.993，重茬的均匀度最低，为0.988；NP-DP的SIMPSON(J)、SHANNON(H)指数最高，分别为1.06、4.482；TRI的SIMPSON(J)、SHANNON(H)指数最低，分别为1.042、4.056。
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图 4 不同处理三七根际土壤DGGE图谱注：A为TRI；B为CK；C为NP-DP；D为NP；E为SP；F为EM。Figure 4. DGGE profile of rhizosphere soil of P. notoginseng under treatment表 2 不同根际土壤微生物多样性指数Table 2. Microbial diversity index of rhizosphere soil under treatments处理 SIMPSON(J) SHANNON(H) 均匀度 BRILLOUIN McIntosh(Dmc) CK 1.0540c 4.313c 0.992a 3.014a 1.131c NP 1.056b 4.407b 0.988b 2.615bc 1.138b NP-DP 1.060a 4.482a 0.990ab 2.740ab 1.149a SP 1.049d 4.221d 0.988b 2.896bc 1.118d EM 1.056bc 4.362b 0.993a 2.699bc 1.136bc TRI 1.042e 4.056e 0.992a 3.010a 1.100e 进一步对DGGE数据进行主成分分析、聚类分析(图 5)。由主成分分析图(图 5-A)可知，主成分1(PC1)与主成分2(PC2)方差贡献率分别为21.34%、30.15%。TRI、EM、CK、NP均位于PC2正轴，SP、NP-DP位于负轴，说明CK、NP中真菌群落与SP、NP-DP相差较大，而经EM和TRI处理后的重茬土壤真菌群落结构与CK、NP较为相似，其中EM处理的真菌群落结构更为接近CK、NP。由聚类分析图(图 5-B)可看出EM和TRI处理的根际土壤中真菌群落结构与NP接近，其中EM与NP更为接近，这与主成分分析结果一致。
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图 5 DGGE数据主成分分析(PCA)及聚类分析Figure 5. Principal component and clustering analyses on DGGE data2.5 菌种鉴定结果分析
对特异条带进行鉴定，BLAST比对结果如表 3所示，其中TRI处理下的优势条带：A2、A3、A7、A8，进行数据库比对发现它们分别是：Trichoderma harzianum哈茨木霉菌、Scutellospora savannicola盾巨孢囊霉丛枝菌根、Anteholosticha manca，大量报道证实这些菌种均对植物有益[25-26]。另外，EM处理下的相对优势条带：F2、F4、F5、F6、F7，鉴定比对结果是：Monacrosporium janus两栖单顶孢菌、Paraphaeosphaeria verruculosa、Ignatius tetrasporus伊格内修斯子囊菌、Geminibasidium donsium、Scutellospora savannicola盾巨孢囊霉丛枝菌根，查阅文献发现这些也都是有益菌[27-28]。在CK、NP-DP、SP、TRI土壤中均分离出Pleosperales格孢腔菌目，据报道得知此菌对植物存在致病性[29]。
表 3 部分特异条带BLAST比对结果Table 3. BLAST on specific bands编号 真菌拉丁名 中文名 A1 Anteholosticha gracilis A2 Trichoderma harzianum 哈茨木霉菌 A3 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A4 Anteholosticha manca A6 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A9 Pleosperales 格孢腔菌目 B1 Bryum arcticum 极地真藓 B2 Pleosporales 格孢腔菌目 B3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 C1 Anteholosticha gracilis C2 Pleosperales 格孢腔菌目 C4 Bryum arcticum 极地真藓 D1 Bryum arcticum 极地真藓 D2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 D3 Entrophospora 稀有内养囊霉 E1 Pleosperales 格孢腔菌目 E2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 E4 Sphaerobolus iowensis 弹球菌属 E5 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F1 Thermococcus barophilus 嗜热球菌属 F2 Monacrosporium janus 两栖单顶孢菌 F3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F4 Paraphaeosphaeria verruculosa F6 Geminibasidium donsium F7 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 注：每个菌种比对结果同源性均在98%以上。 2.6 关键微生物的荧光定量PCR(qRT-PCR)
在特异条带菌种鉴定的基础上，锁定了有益菌：Anteholosticha gracilis、Scutellospora savannicola、Anteholosticha manca、Trichoderma harzianum、Thermococcus barophilus、Monacrosporium janus、Paraphaeosphaeria verruculosa、Geminibasidium donsium，以及有害菌Pleosperales和Sphaerobolus iowensis，进而通过qRT-PCR技术绝对定量还原分析特异菌种在不同土壤中的含量。结果显示(图 6)，不同处理的根际土壤中的有益菌及有害菌含量有显著差异，其中，大部分有益菌在头茬土壤中的含量高于重茬(P＜0.05)(图 6-A~G)，而2株病原菌在头茬中的含量显著低于重茬(P＜0.05)(图 6~I、J)，特别是病原菌Sphaerobolus iowensis的含量在重茬中含量最高。经EM处理的土壤中Trichoderma harzianum、Thermococcus barophilus、Monacrosporium janus、Paraphaeosphaeria verruculosa等有益菌的含量有所上升。TRI处理使有益菌Scutellospora savannicola、Trichoderma harzianum、Monacrosporium janus、Paraphaeosphaeria verruculosa的含量显著增加。EM和TRI处理均能显著降低病原菌的含量(图 6-I、J)。而在NP-DP中，有益菌含量并未显著降低，但有害菌Pleosperales的含量是所有土壤中最高的。
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图 6 不同处理下连作三七根际土壤中部分特异菌群含量的原位qRT-PCR分析注：①A为Anteholosticha gracilis，B为Scutellospora savannicola，C为Anteholosticha manca，D为Trichoderma harzianum，E为Thermococcus barophilus，F为Monacrosporium janus，G为Paraphaeosphaeria verruculosa，H为Geminibasidium donsium，I为Pleosperales，J为Sphaerobolus iowensis。②图中数据为每克鲜土中的特异菌含量。Figure 6. In situ qRT-PCR analysis on population of specific microbial flora in rhizosphere soil of monocultured P. notoginseng under different treatments3. 讨论与结论
本研究结果表明，与头茬相比，重茬三七的产量大大降低，而菌剂EM和TRI处理均可在一定程度上提高重茬三七的出苗率、保苗率、产量。同时，经菌剂处理的重茬土壤中的各营养指标与重茬相比均有所提高。祝英等的研究也证实在当归育苗新茬地加入微生物菌剂，能显著提高一等当归苗的比例，同时降低废弃苗的比例[30]；董占梅等在研究4种微生物菌剂对老参地人参产量和品质的影响时发现，不同微生物菌剂均能提高人参的产量和品质[31]。罗玉兰等发现与单施有机肥相比，有机肥与菌剂混合施用能大大提高废弃大棚土壤中的有机质，有效磷含量[32]。可见微生物菌剂的施用可显著改善土壤营养状况，并提高作物产量。这可能是因为微生物菌剂的施用会显著增强土壤酶活性，促进固态养分转化为有效养分，从而促进植物生长[33-34]。
作为连作障碍形成的三大原因之一，根系分泌物的化感自毒作用一直是研究的热点，化感自毒物质种类繁多，根据化学结构与性质的不同，可将其分为10类[35]，其中酚酸是一种常见的化感物质。本研究运用HPLC对土壤根际酚酸进行分析，结果显示，头茬土壤中大部分酚酸含量都略高于重茬(没食子酸除外)，甚至在重茬土壤中未检测到头茬所含有的苯甲酸，可见酚酸并未随着连作年限的增加呈现累积效应，这与吴林坤等[10]的研究结论一致。还有一些学者认为，目前大多数研究都是将提取的次生代谢产物稀释后处理种子或幼苗，来观察其影响，这种做法并不符合实际生产情况[36]，忽略了土壤中复杂的吸附与转化过程。Harleen Kaur等[37]提出前茬植物产生的化感物质并非直接影响后茬植物的生长，化感物质分泌到土壤后，会受到土壤微生物的一系列转化分解，进而改变土壤中的微生物区系，两者相互作用，影响植物生长。此外，本试验的两种菌剂处理对土壤中酚酸总量有着不一样的影响：EM处理使土壤酚酸总量下降，TRI处理使土壤酚酸总量上升。但两者对于重茬三七的生长都有促进作用，进一步说明了酚酸含量与重茬三七产量下降无直接关系。
土壤微生物对于土壤和植物之间的交流起着至关重要的作用，其群落结构和组成的稳定、均匀与植物的健康生长密切相关。随着研究的深入，越来越多的学者认为连作障碍问题与微生物区系失衡密切相关。吴凤芝等[38]在研究番茄连作障碍问题时发现，随着连作年限增加，有害真菌的数量增加。本试验运用DGGE、qRT-PCR等技术对连作三七土壤根际真菌群落进行分析，结果表明：三七连作后其根际真菌群落发生了较大变化，Scutellospora savannicola、Scutellospora savannicola等有益真菌的含量大大下降，有害真菌Pleosperales和Sphaerobolus iowensis的含量显著上升。结合连作土壤根际酚酸含量下降的结果，推测酚酸的释放促进有害菌的生长繁殖，使得有害菌越来越多，进而消耗更多的酚酸。由于土壤资源有限，有害菌的过量繁殖使得土壤环境愈发不适宜有益菌生长，故有益菌大量减少，土壤中原有微生物区系的平衡状态被打破，从而影响植物生长。本研究采用的EM和TRI菌剂均能在一定程度上改善土壤微生物群落失衡的状态，EM处理使土壤真菌群落结构更接近NP，TRI处理使土壤中有益菌含量显著增加。祝英等[30]用微生物菌剂处理当归苗生长地时同样发现，菌剂处理对当归根际微生物区系有显著影响。可见，菌剂处理通过向土壤中引入有益微生物，在一定程度上抑制了有害菌的生长，促进土壤微生物区系朝着健康、协调的方向发展，从而适宜植物生长。此外，通过对比发现头茬发病三七与重茬三七的灾变机制并不一致，前者更倾向于与某种病原菌的爆发有关。
综上所述，三七连作障碍问题是土壤肥力下降，根际土壤微生物区系紊乱等多种原因综合作用的结果。微生物菌剂EM和TRI的添加均能在不同程度上缓解土壤养分流失，改善土壤微生物群落结构，提高三七产量。因此，找出关键菌种，以菌剂的方式使其在土壤中定殖是缓解连作障碍问题的一个有效手段，也是未来研究的方向。同时，植物-根系分泌物-微生物三者之间的关系是接下来研究的重点。
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图 1 混合酚酸与土样酚酸HPLC出峰
注：1为没食子酸；2为香豆酸；3为丁香酸；4为香兰素；5为阿魏酸；6为苯甲酸。
Figure 1. HPLC on mixed and soil phenolic acids samples
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图 2 不同处理下的三七出苗率、保苗率及产量
Figure 2. Seedling emergence and survival rate and root yield of P. notoginseng under treatments
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图 3 不同处理下连作三七根际土壤酚酸含量
Figure 3. Phenolic acids in rhizosphere soil of P. notoginseng under monoculture regime
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图 4 不同处理三七根际土壤DGGE图谱
注：A为TRI；B为CK；C为NP-DP；D为NP；E为SP；F为EM。
Figure 4. DGGE profile of rhizosphere soil of P. notoginseng under treatment
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图 5 DGGE数据主成分分析(PCA)及聚类分析
Figure 5. Principal component and clustering analyses on DGGE data
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图 6 不同处理下连作三七根际土壤中部分特异菌群含量的原位qRT-PCR分析
注：①A为Anteholosticha gracilis，B为Scutellospora savannicola，C为Anteholosticha manca，D为Trichoderma harzianum，E为Thermococcus barophilus，F为Monacrosporium janus，G为Paraphaeosphaeria verruculosa，H为Geminibasidium donsium，I为Pleosperales，J为Sphaerobolus iowensis。②图中数据为每克鲜土中的特异菌含量。
Figure 6. In situ qRT-PCR analysis on population of specific microbial flora in rhizosphere soil of monocultured P. notoginseng under different treatments
表 1 不同处理对连作三七根际土壤中营养元素含量的影响
Table 1 Effect of treatments on soil nutrient content in monocultured P. notoginseng rhizosphere soil
处理 全氮/(g·kg-1) 全磷/(g·kg-1) 全钾/(g·kg-1) 碱解氮/(mg·kg-1) 速效磷/(mg·kg-1) 速效钾/(mg·kg-1) pH CK 1.29±0.80a 0.22±0.01c 0.75±0.06e 112.58±4.40a 29.54±0.32b 140.83±2.55b 6.49±0.03b NP 0.66±0.83c 0.22±0.01c 3.66±0.06c 42.58±11.65b 24.84±0.12d 155.87±2.55a 6.72±0.11a NP-DP 1.01±0.89b 0.25±0.02b 0.95±0.09d 109.67±9.95a 34.65±0.11a 125.25±1.67c 6.43±0.05b SP 0.22±0.84d 0.12±0.01d 3.57±0.07c 18.08±1.01d 22.70±0.21f 41.75±1.67f 6.03±0.05c EM 0.29±0.90d 0.14±0.01d 4.07±0.08a 20.42±2.02cd 23.72±0.18e 57.34±0.96e 5.95±0.02c TRI 0.58±0.35c 0.37±0.01a 3.83±0.10b 32.67±9.63bc 26.80±0.64c 109.11±0.96d 6.72±0.15a 注：①CK为空白对照；NP为头茬；NP-DP为头茬发病；SP为重茬未处理；EM为有益微生物处理；TRI为木霉菌剂处理。②同列数据后不同字母表示处理间差异显著(P < 0.05)。表 2同。 
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表 2 不同根际土壤微生物多样性指数
Table 2 Microbial diversity index of rhizosphere soil under treatments
处理 SIMPSON(J) SHANNON(H) 均匀度 BRILLOUIN McIntosh(Dmc) CK 1.0540c 4.313c 0.992a 3.014a 1.131c NP 1.056b 4.407b 0.988b 2.615bc 1.138b NP-DP 1.060a 4.482a 0.990ab 2.740ab 1.149a SP 1.049d 4.221d 0.988b 2.896bc 1.118d EM 1.056bc 4.362b 0.993a 2.699bc 1.136bc TRI 1.042e 4.056e 0.992a 3.010a 1.100e
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表 3 部分特异条带BLAST比对结果
Table 3 BLAST on specific bands
编号 真菌拉丁名 中文名 A1 Anteholosticha gracilis A2 Trichoderma harzianum 哈茨木霉菌 A3 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A4 Anteholosticha manca A6 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 A9 Pleosperales 格孢腔菌目 B1 Bryum arcticum 极地真藓 B2 Pleosporales 格孢腔菌目 B3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 C1 Anteholosticha gracilis C2 Pleosperales 格孢腔菌目 C4 Bryum arcticum 极地真藓 D1 Bryum arcticum 极地真藓 D2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 D3 Entrophospora 稀有内养囊霉 E1 Pleosperales 格孢腔菌目 E2 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 E4 Sphaerobolus iowensis 弹球菌属 E5 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F1 Thermococcus barophilus 嗜热球菌属 F2 Monacrosporium janus 两栖单顶孢菌 F3 Ignatius tetrasporus 伊格内修斯子囊菌 F4 Paraphaeosphaeria verruculosa F6 Geminibasidium donsium F7 Scutellospora savannicola 盾巨孢囊霉丛枝菌根 注：每个菌种比对结果同源性均在98%以上。
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