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福建省玉米大斑病菌ISSR-PCR反应体系的优化和引物的筛选

代玉立, 甘林, 阮宏椿, 杨静民, 石妞妞, 杜宜新, 陈福如, 杨秀娟

代玉立, 甘林, 阮宏椿, 杨静民, 石妞妞, 杜宜新, 陈福如, 杨秀娟. 福建省玉米大斑病菌ISSR-PCR反应体系的优化和引物的筛选[J]. 福建农业学报, 2019, 34(7): 810-817. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2019.07.009
引用本文: 代玉立, 甘林, 阮宏椿, 杨静民, 石妞妞, 杜宜新, 陈福如, 杨秀娟. 福建省玉米大斑病菌ISSR-PCR反应体系的优化和引物的筛选[J]. 福建农业学报, 2019, 34(7): 810-817. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2019.07.009
DAI Yu-li, GAN Lin, RUAN Hong-chun, YANG Jing-min, SHI Niu-niu, DU Yi-xin, CHEN Fu-ru, YANG Xiu-juan. ISSR-PCR Optimization and Primer Selection for Analyzing Exserohilum turcicum Isolates Collected in Fujian[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2019, 34(7): 810-817. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2019.07.009
Citation: DAI Yu-li, GAN Lin, RUAN Hong-chun, YANG Jing-min, SHI Niu-niu, DU Yi-xin, CHEN Fu-ru, YANG Xiu-juan. ISSR-PCR Optimization and Primer Selection for Analyzing Exserohilum turcicum Isolates Collected in Fujian[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2019, 34(7): 810-817. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2019.07.009

福建省玉米大斑病菌ISSR-PCR反应体系的优化和引物的筛选

基金项目: 

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 2017R1025-3

福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 2018R1025-1

国家重点研发计划 2018YFD0200706

福建省农业科学院青年科技英才百人计划项目 YC2016-4

福建省农业科学院青年自由探索项目 AA2018-14

福建省财政专项——福建省农业科学院植物保护创新团队建设项目 STIT2017-1-8

详细信息
    作者简介:

    代玉立(1984-), 男, 博士, 助理研究员, 研究方向:真菌学及植物真菌病害(E-mail:dai841225@126.com)

    通讯作者:

    杨秀娟(1972-), 女, 硕士, 研究员, 研究方向:植物病理学(E-mail:yxjzb@126.com)

  • 中图分类号: S432.4

ISSR-PCR Optimization and Primer Selection for Analyzing Exserohilum turcicum Isolates Collected in Fujian

  • 摘要:
      目的  明确适用于福建省玉米大斑病菌ISSR分子标记的反应体系和引物。
      方法  采用单因素水平优化法对ISSR-PCR扩增反应中的Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、PCR反应循环数以及引物的最佳退火温度等重要参数进行优化。
      结果  适合福建省玉米大斑病菌群体遗传多样性分析的ISSR-PCR反应体系(25 μL)为:Taq聚合酶0.55 U、dNTPs 0.30 mmol·L-1、Mg2+ 1.30 mmol·L-1、DNA模板100 ng、引物10 pmol。ISSR-PCR扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,51.2~56.0℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;72℃延伸10 min。利用优化的反应体系从56条ISSR引物中筛选出稳定性好、多态性高的引物10条:UBC117、UBC118、UBC808、UBC835、UBC847、UBC855、UBC856、UBC857、UBC866和UBC887,其最佳退火温度分别为55.6、53.1、51.2、51.2、56.0、53.1、53.1、51.2、51.2和51.2℃。利用优化的ISSR-PCR反应体系对21株供试菌株进行PCR扩增,结果表明,相同地理来源以及不同地理来源菌株间的DNA多态性均不同,表明福建省玉米大斑病菌群体存在丰富的遗传多样性。
      结论  本研究优化的ISSR-PCR反应体系和筛选的引物可用于福建省玉米大斑病菌群体遗传多样性和遗传结构的研究。
    Abstract:
      Objective  To determine the optimal reaction conditions and primers for the inter-simple sequence repeat (ISSR) PCR in analyzing isolates of Exserohilum turcicum, a pathogen of the northern corn leaf blight in Fujian.
      Method  Conditions for the ISSR-PCR amplification including Taq polymerase dosage, concentrations of dNTPs, Mg2+ and template DNA and reaction cycle as well as annealing temperatures for selected primers were optimized using a single-factor method.
      Result  For a 25 μL ISSR-PCR genetic diversity analysis on E. turcicum, the following conditions were applied:0.55 U of Taq polymerase, 0.30 mmoL·L-1 of dNTPs, 1.30 mmoL·L-1 of Mg2+, 100 ng of template DNA, and 10 pmol of primer under 94℃ for 4 min followed by 35 cycles of 45 s at 94℃, 45 s at 51.2-56.0℃, and 1.5 min at 72℃, and finally, at 72℃ for 10 min. Ten stable, polymorphic primers, i.e., UBC117, UBC118, UBC808, UBC835, UBC847, UBC855, UBC856, UBC857, UBC866, and UBC887, were selected from 56 ISSR primers, with their optimized annealing temperatures determined to be 55.6, 53.1, 51.2, 51.2, 56.0, 53.1, 53.1, 51.2, 51.2, and 51.2℃, respectively. Regardless of their geographical origins, the 21 E. turcicum isolates differed on DNA polymorphism indicating an abundance on genetic diversity among them.
      Conclusion  The optimized ISSR-PCR reaction conditions and primers could be applied for genetic studies on E. turcicum in Fujian.
  • 【研究意义】琯溪蜜柚(Guanxi honey pomelo)又名香抛,是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus Linn)多年生木本植物,原产于福建省漳州市平和县,是我国柚类主栽良种之一,在福建省平和县种植面积达4.3万hm2 [1]。近年来,随着蜜柚单一的种植模式及品种抗病性减弱,使蜜柚炭疽病的发生逐年加重,严重影响了蜜柚的品质和产量,据统计2016年平和县蜜柚炭疽病发生面积达2.1万 hm2,对当地蜜柚产业造成极大经济损失,因此蜜柚炭疽病的有效防治已迫在眉睫[2]。【前人研究进展】本课题组曾对琯溪蜜柚炭疽病进行分离鉴定,其病原菌鉴定为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),该菌是一种世界性的植物病原菌,在适宜的环境下扩散迅速,在琯溪蜜柚的整个生长期和采后果实保鲜期均可为害[3]。目前,国内对蜜柚炭疽病的研究主要集中在炭疽病症状的识别与诊断、发生规律和简单防治措施等方面[4]。【本研究切入点】由胶孢炭疽菌引起的蜜柚炭疽病是蜜柚上的重要病害之一,但关于蜜柚炭疽病菌的生物学特性及高效安全杀菌剂筛选有待深入研究。【拟解决的关键问题】通过菌丝生长和产孢量探明蜜柚炭疽病菌胶孢炭疽菌的生物学特性,同时测定常用化学杀菌剂对该病原菌的室内毒力,以明确该菌的生长条件及安全高效杀菌剂,为蜜柚炭疽病提供有效防治措施及技术支持。

    供试药剂:96.5%咪鲜胺原药(Prochloraz,咪唑类,辉丰农化股份有限公司)、95% 苯醚甲环唑(Difenoconazole,三唑类,山东东泰农化有限公司)、96%吡唑醚菌酯原药(Pyraclostrobin,甲氧基丙烯酸酣类,江苏耘农化工有限公司)、98.1%多菌灵原药(Carbendazim,苯并咪唑类,辉丰农化股份有限公司)。

    供试菌株:蜜柚炭疽病菌(C. gloeosporioides),由漳州市农业科学研究所分离、鉴定及保藏。

    供试培养基:①马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:新鲜去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂粉16 g、去离子水1000 mL;②察氏(Czapek)培养基:硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂粉16 g、蒸馏水1000 mL。

    参考刘行风等的方法[5-6],取直径5 mm的病原菌菌饼接种于PDA平板(d=9.0 cm,下同)中央,分别置于10、15、20、25、30、35和40 ℃恒温培养箱中培养,6 d后采用十字交叉法测量菌落直径,每处理3个重复;后用 10 mL 无菌水洗下菌落表面孢子,制成孢子悬浮液,用纽鲍尔(Neubauer)血球计数板测定孢子含量,每处理3次重复。

    取直径5 mm的病原菌菌饼接种于PDA平板中央,依次置于全黑暗、全光照和12 h光照/12 h黑暗的25 ℃培养箱内培养,6 d后测定菌落直径和产孢量,测定方法同1.2.1,每处理3次重复。

    取直径为5 mm的菌饼接种于用0.1 mol·L−1 HCl和0.1 mol·L−1 NaOH调配pH为4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板中央,在25 ℃培养箱中培养,6 d后测定菌落直径和产孢量,测定方法同1.2.1,每处理3次重复。

    取直径为5 mm的菌饼置于装有5 mL 无菌水的5 mL冻存管中,分别置于45~55 ℃的恒温水浴锅中,10 min后将菌饼转接至PDA平板中央,在25 ℃培养箱中培养,每处理3次重复,6 d后观察有无菌丝生长,最终确定菌丝的致死温度。

    采用菌丝生长速率法测定4种杀菌剂对蜜柚炭疽病菌的室内毒力[7]。无菌条件下,在PDA培养基中加入咪鲜胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和多菌灵母液,将其配置成0.002、0.01、0.05、0.25、1.25 和6.25 mg·L−1的含药培养基。取直径5 mm的病原菌菌饼接种于上述含药PDA平板中央,每处理3皿,重复3次,后置于25 ℃恒温培养,6 d后采用十字交叉法测量每个培养基的菌落直径,计算抑制率,菌丝生长抑制率/%=[(对照组菌落直径−药剂处理组菌落直径)/(对照组菌落直径−菌饼直径)]×100。

    在DPS 7.05数据处理软件上,计算4种杀菌剂对供试菌株的有效抑制中浓度EC50,并利用Duncan’s新复极差法对生物学特性,如温度、光照和pH等结果进行单因素方差分析。

    图1可看出,在10~25 ℃时,菌落直径随温度的升高而增加,25 ℃时菌落直径最大,为74.66 mm,在30~40 ℃时,菌落直径随温度的升高而减少。在15~30 ℃时,病原菌产孢量随温度的升高而增加,30 ℃时产孢量最大,为16.53×105个·皿−1,温度升至35 ℃时,产孢量下降,在10 ℃和40 ℃时,病原菌无法产孢。结果表明,蜜柚炭疽病菌菌落生长最适温度为25 ℃,产孢最适温度为30 ℃。

    图  1  温度对蜜柚炭疽病菌菌丝生长和产孢量的影响
    不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图2、3同。
    Figure  1.  Effects of temperature on mycelial growth and sporulation of C. gloeosporioides
    Data with different uppercase letters indicate highly significant difference at P<0.01. Same for Figs. 2 and 3.

    图2可看出,蜜柚炭疽病菌在pH为4~10时均能产孢和生长,在pH为4~7时,菌落直径和产孢量随温度的升高而增加,在pH为7时菌落直径和产孢量最大,分别为70.67 mm和13.33×105个·皿−1 ,且差异极显著。在pH为8~10时,菌落直径和产孢量随温度的升高而减少。结果表明,蜜柚炭疽病菌菌落生长和产孢的最适pH均为7。

    图  2  pH对蜜柚炭疽病菌菌丝生长和产孢量的影响
    Figure  2.  Effects of pH on mycelial growth and sporulation of C. gloeosporioides

    图3可看出,在全黑暗、半光照和全光照 3种条件下,蜜柚炭疽病菌菌丝能正常生长,均能产孢。3个光照条件下菌丝均生长旺盛,3个处理间差异不显著。但不同光照条件下的产孢量不同,全光照条件下产孢量最高,为11.73×105个·皿−1,显著高于其他2个处理。结果表明,不同光照条件对蜜柚炭疽病菌菌丝生长影响不大,但光照有利于产孢。

    图  3  光照条件对蜜柚炭疽病菌菌丝生长和产孢量的影响
    Figure  3.  Effects of light condition on mycelial growth and sporulation of C. gloeosporioides

    蜜柚炭疽病菌菌落在45~55 ℃水浴处理10 min,再于28 ℃培养箱培养6 d后进行观察,结果表明经45~50 ℃水浴处理10 min的菌碟均能生长并形成新菌落,而51 ℃水浴处理10 min的菌碟不能生长并形成新菌落(图4),表明蜜柚炭疽病菌菌丝生长的致死温度为51 ℃、10 min。

    图  4  蜜柚炭疽病菌菌丝生长致死温度
    A为45 ℃;B为50 ℃;C为51 ℃。
    Figure  4.  Lethal temperature of C. gloeosporioides mycelia
    A: 45 ℃; B: 50 ℃; C: 51 ℃.

    室内毒力测定结果(表1)表明,供试的4种杀菌剂对蜜柚炭疽病菌菌丝生长均具有不同程度的抑制作用,其中咪鲜胺的抑菌效果最好,EC50为0.0171 mg·L−1;其次为苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯,EC50分别为0.0237 mg·L−1和0.0345 mg·L−1;多菌灵的抑菌效果最低,EC50为0.2586 mg·L−1。结果表明,相较于多菌灵,咪鲜胺、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯可能更适用于蜜柚炭疽病的防治。而多菌灵对蜜柚炭疽病菌抑制效果较弱的原因,可能与多菌灵的长期施用,病原菌抗药性的产生等原因有关。

    表  1  4种供试药剂对蜜柚炭疽病的毒力
    Table  1.  Toxicities of 4 fungicides against C. gloeosporioides
    供试药剂
    Fungicides
    毒力回归方程
    Toxicity regression equation
    EC50/(mg·L−195% 置信区间
    95% Confidence interval/(mg·L−1)
    相关系数r
    Correlation coefficient r
    咪鲜胺
    Prochloraz
    y=5.8060+0.4563x0.01710.0127~0.02320.9957
    苯醚甲环唑
    Difenoconazole
    y=5.5791+0.4206x0.02370.0173~0.03240.9949
    吡唑醚菌酯
    Pyraclostrobin
    y=5.6197+0.4238x0.03450.0228~0.05210.9902
    多菌灵
    Carbendazim
    y=5.2430+0.4136x0.25860.1705~0.39210.9892
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    炭疽病是琯溪蜜柚生产中的重要病害之一,主要为害蜜柚果实、叶片、花和枝梢等部位。笔者从福建漳州琯溪蜜柚炭疽病病株中分离到的病原菌为胶孢炭疽菌C. gloeosporioides[1],胶孢炭疽菌最早于1882年在意大利的柑橘上被发现[8],此外还在柑橘上发现尖孢炭疽菌C. acutatum和平头炭疽菌C. truncatum[9-10],说明炭疽病的致病菌具有多样性。但是福建地区蜜柚炭疽病是否还存在其他病原菌,仍需进一步扩大采集病样进行分离、鉴定。该病原菌的生物学特性研究结果表明,其菌丝生长和产孢量均受温度、pH值和光照等条件的影响,产孢最适温度为30 ℃,与胡永亮等[11]报道的铁皮石斛炭疽病菌产孢最适温度一致;菌落生长最适温度为25 ℃,与李戌清等[12]报道的三叶青炭疽病原菌的最适菌丝生长温度一致;产孢和菌落生长的最适pH均为7,其中菌丝生长最适pH与杨子祥等[13]的报道一致,但产孢量最适pH高于报道中的pH值4,存在显著差异,这可能与寄主差异有关;光照条件对蜜柚炭疽病菌菌丝生长影响不大,与程勋东等[14]报道的结果一致,但光照利于产孢,黑暗抑制产孢。菌丝生长致死温度为51 ℃,10 min。

    化学防治是防治作物病害的主要手段,因此,防治药剂的筛选十分关键,科学精准用药不仅可以提高杀菌剂的防治效果,还可以减少用药量和用药次数,延缓病原菌的抗药性[15]。目前,对药剂防控蜜柚炭疽病的研究较少。本研究测定了4种不同化学结构和作用机制的杀菌剂对琯溪蜜柚炭疽病菌的室内毒力,测定结果表明供试的4种杀菌剂对蜜柚炭疽病病原菌均具有不同程度的抑制作用,其中咪鲜胺的抑菌效果最好,EC50为0.0171 mg·L−1;其次为苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯,EC50分别为0.0237 mg·L−1和0.0345 mg·L−1;多菌灵的抑菌效果最低,EC50为0.2586 mg·L−1。本试验测得的EC50均低于郑金龙等[16]报道中柱花草胶孢炭疽病菌的EC50,这可能是因为寄主的差异性导致的。试验结果说明,咪鲜胺、苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯更适用于蜜柚炭疽病的防治,多菌灵对蜜柚炭疽病病原菌抑制效果较差,可能是由于多菌灵是常见的广谱杀菌剂,在长期的使用过程中,蜜柚炭疽病菌对其产生了一定的抗药性。本研究采用菌丝生长速率法测定4种杀菌剂对蜜柚炭疽病菌的室内毒力,但室内环境与田间存在一定差异,后续将对药剂的田间应用、药剂残留和对非靶标生物的影响等方面开展研究,为蜜柚炭疽病的防治药剂的选择提供参考,同时为合理地使用化学药剂、延缓抗药性的发展提供理论依据。

  • 图  1   引物UBC847的反应体系优化

    注:M:5-kb DNA Marker;(A) 1~8:Taq酶用量分别为0.25、0.35、0.45、0.55、0.65(推荐剂量)、0.75、0.85和0.95 U;(B) 1~8:dNTPs浓度分别为0.07、0.10、0.14、0.17、0.20(推荐剂量)、0.23、0.26和0.30 mmol·L-1;(C) 1~8:Mg2+浓度分别为0.5、0.8、1.0、1.3、1.5(推荐剂量)、1.7、2.0和2.2 mmol·L-1;(D) 50~200:DNA模板量分别为50、100、150和200 ng;(E) 25~40:循环数分别为25、30、35和40次;CK:空白对照。

    Figure  1.   Reaction condition optimization for primer UBC847

    Note:M:5-kb DNA Marker; (A) 1-8:the amount of Taq polymerase 0.25, 0.35, 0.45, 0.55, 0.65 (recommended dosages), 0.75, 0.85 and 0.95 U, respectively; (B) 1-8:the concentration of dNTPs 0.07, 0.10, 0.14, 0.17, 0.20 (recommended dosages), 0.23, 0.26 and 0.30 mmol·L-1, respectively; (C) 1-8:the concentration of Mg2+ 0.5, 0.8, 1.0, 1.3, 1.5 (recommended dosages), 1.7, 2.0 and 2.2 mmol·L-1, respectively; (D) 50-200:the concentration of template DNA 50, 100, 150 and 200 ng, respectively; (E) 25-40:the cycle number 25, 30, 35 and 40, respectively; CK:blank control.

    图  2   引物UBC847的最佳退火温度筛选

    注:M:5-kb DNA Marker;1~8:退火温度梯度依次为56.0、55.6、54.7、53.1、51.2、49.6、48.5和48.0℃;CK:空白对照。

    Figure  2.   Selection of annealing temperature for primer UBC847

    Note:M:5-kb DNA Marker; 1-8:the annealing temperature 56.0, 55.6, 54.7, 53.1, 51.2, 49.6, 48.5 and 48.0℃, respectively; CK:blank control.

    图  3   使用引物UBC847和UBC887对福建省21个玉米大斑病菌株进行ISSR-PCR扩增

    注:M:5-kb DNA Marker;1~21:福建省玉米大斑病菌的菌株序号与表 1对应;(A)和(B):引物UBC847和UBC887分别对21株玉米大斑病菌的ISSR-PCR扩增结果;CK:空白对照。

    Figure  3.   ISSR-PCR amplification of 21 E. turcicum isolates using primer UBC847 and UBC887

    Note:M:5-kb DNA Marker; 1-21:isolates of E. turcicum in Fujian Province corresponding with Table 1; (A) and (B):ISSR-PCR amplification results of 21 E. turcicum isolates in Fujian Province using primer UBC847 and UBC887, respectively; CK:blank control.

    表  1   供试的福建省玉米大斑病菌菌株

    Table  1   E. turcicum isolates collected in Fujian

    序号
    Number
    菌株编号
    Isolate code
    采集地
    Location
    年份
    Year
    1 JO1801 建瓯市东游镇Dongyou town of Jian′ou city 2018
    2 JO1809 建瓯市东游镇Dongyou town of Jian′ou city 2018
    3 JODB1701 建瓯市东游镇Dongyou town of Jian′ou city 2017
    4 JODB1702 建瓯市东游镇Dongyou town of Jian′ou city 2017
    5 DFDB1901 建瓯市东峰镇Dongfeng town of Jian′ou city 2019
    6 DFDB1902 建瓯市东峰镇Dongfeng town of Jian′ou city 2019
    7 DFDB1903 建瓯市东峰镇Dongfeng town of Jian′ou city 2019
    8 DFDB1905 建瓯市东峰镇Dongfeng town of Jian′ou city 2019
    9 SX1801 松溪县Songxi county 2018
    10 SX1802 松溪县Songxi county 2018
    11 SX1804 松溪县Songxi county 2018
    12 PNDB1602a 屏南县Pingnan county 2016
    13 PNDB1604b 屏南县Pingnan county 2016
    14 PNDB1606a 屏南县Pingnan county 2016
    15 PNDB1608a 屏南县Pingnan county 2016
    16 PNDB1609a 屏南县Pingnan county 2016
    17 NJDB1805 南靖县Nanjing county 2018
    18 NJDB1809 南靖县Nanjing county 2018
    19 NJDB1810 南靖县Nanjing county 2018
    20 NJDB1816 南靖县Nanjing county 2018
    21 NJDB1830 南靖县Nanjing county 2018
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    表  2   适宜福建省玉米大斑病菌ISSR分子标记的引物及最佳退火温度

    Table  2   Primers and annealing temperatures for ISSR molecular marker of E. turcicum isolates

    引物名称
    Primer name
    引物序列(5′-3′)
    Primer sequence
    最适退火温度(℃)
    Optimal Tm
    引物来源
    Primer origin
    是否适合福建种群
    Whether suitable for Fujian population
    UBC112 (AG)8TA (52) UBC, [15] 不适合unsuitability
    UBC113 (AG)8TC (54) (52.7) UBC, [15], [16] 不适合unsuitability
    UBC117 (AGA)7 55.6 (56) (52.7) UBC, [15], [16] 适合suitability
    UBC118 (GTC)6 53.1 (59.5) (53) UBC, [15], [16] 适合suitability
    UBC121 (GTGC)4 (61.8) (49) UBC, [15], [16] 不适合unsuitability
    UBC808 (AG)8C 51.2 (52.7) UBC, [16] 适合suitability
    UBC835 (AG)8YC 51.2 (53) UBC, [16] 适合suitability
    UBC847 (CA)8RT 56.0 (49.1) UBC, [16] 适合suitability
    UBC855 (AC)8YT 53.1 (49.4) UBC, [16] 适合suitability
    UBC856 (AC)8YA 53.1 UBC 适合suitability
    UBC857 (AC)8YG 51.2 UBC 适合suitability
    UBC866 (CTC)6 51.2 UBC 适合suitability
    UBC887 DVD(TC)7 51.2 UBC 适合suitability
    注:① Tm:退火温度,小括弧内的数字为文献中报道的引物最佳退火温度;② UBC:加拿大哥伦比亚大学植物病原真菌基因组DNA重复序列ISSR引物库(http:/www.michaelsmith.ubc.ca)。
    Note:①Tm:annealing temperature, numbers in parenthesis are the optimal annealing temperatures for primers reported in the literatures; ② UBC:Primer database for genomic DNA repeat sequence of phytopathogenic fungi established by University of Columbia, Canada (http:/www.michaelsmith.ubc.ca).
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-08
  • 修回日期:  2019-07-02
  • 刊出日期:  2019-07-19

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