Tissue Culture for Rapid Propagation of A Cymbidium goeringii Hybrid
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摘要:目的 筛选春兰组培各阶段的最佳培养条件，建立优良的春兰快繁体系，为春兰大规模生产开发提供科学依据。方法 以春兰‘黄梅’ב黄荷’F1无菌播种形成的根状茎为试验材料，通过基本培养基（1/2MS、改良1/2MS、HyponexⅡ）和植物生长调节剂（6-BA、NAA、TDZ、IBA）等因子不同组合，围绕增殖、分化、生根等阶段建立其再生体系，并对培育出的组培苗进行移栽练苗。结果 增殖最适培养基为3.0 g·L−1 HyponexⅡ+0.5 mg·L−1 6-BA+3.0 mg·L−1 NAA+1.0 g·L−1 活性炭（AC）+30.0 g·L−1 白砂糖（Su）+7.0 g·L−1 琼脂（Ag），生长速度和增殖系数分别为7.31和6.02；分化最适培养基为2.0 mg·L−1 6-BA+0.3 mg·L−1 NAA+30.0 g·L−1 Su+7.0 g·L−1 Ag，分化率、芽诱导个数和株高分别为90.00%、5.44个和2.53 cm；生根最适培养基为1.5 mg·L−1 IBA+2.0 g·L−1蛋白胨+1.0 g·L−1 AC+25.0 g·L−1 Su+7.0 g·L−1 Ag，生根率、生根数和平均根长分别为100.00%、8.03条和3.00 cm；春兰组培苗练苗移栽60 d后存活率达96.53%。结论 新型基本培养基HyponexⅡ（3.0 g·L−1）对春兰增殖培养有高效促进作用，高水平的IBA（1.5 mg·L−1）有利于春兰组培苗生根壮苗。Abstract:Objective Optimum conditions for an efficient, rapid propagation from rhizomes of a Cymbidium goeringii hybrid were investigated.Method Rhizomes of the aseptically seeded F1 hybrid between two C. goeringii cultivars, Huang-mei and Huang-he, were cultivated on various media (i.e., 1/2MS、modified 1/2MS, and HyponexⅡ) with added plant growth regulators (i.e., 6-BA, NAA, TDZ, and/or IBA) to monitor the plant growth throughout propagation, differentiation, and rooting of the regeneration process. The seedlings were subsequently transplanted outdoor to determine their survival rate.Result In the propagation stage, the optimal medium was 3.0 g HyponexⅡ·L−1 + 0.5 mg 6-BA·L−1 + 3.0 mg NAA·L−1 + 1.0 g activated carbon (AC)·L−1 + 30.0 g sugar (Su)·L−1 + 7.0 g agar (Ag)·L−1 to achieve a growing rate of 7.31 and a multiplication coefficient of 6.02. The optimal medium for differentiation was 2.0 mg 6-BA·L−1 + 0.3 mg NAA·L−1 + 30.0 g Su·L−1 + 7.0 g Ag·L−1 to deliver an averaged 90.00% differentiation, 5.44 buds per rhizome segment, and 2.53 cm height of seedling. For optimum rooting, the medium was 1.5 mg IBA·L−1 + 2.0 g peptone·L−1 + 1.0 g AC·L−1 + 25.0 g Su·L−1 + 7.0 g Ag·L−1 to result in 100.00% root-generation with an averaged 8.03 roots at 3.00 cm long per plant. The survival rate of plantlets 60 d after transplantation was up to 96.53%.Conclusion HyponexⅡ applied at 3.0 g·L−1 was found highly efficient for the C. goeringii rhizome regeneration; and, the addition of 1.5 mg·L−1 of IBA in the medium significantly enhanced the rooting for the seedlings.
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Keywords:
- Cymbidium goeringii /
- propagation culture /
- differentiation culture /
- rooting culture
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断奶是仔猪生长发育过程中的一个重要环节，母仔分离、营养和环境等的改变等对仔猪造成极大应激。断奶应激会造成仔猪胃肠道黏膜损伤[1]，引起消化吸收障碍和腹泻，是现代养猪生产中面临的主要问题。目前添加抗生素仍是缓解断奶应激的主要技术手段，但抗生素的弊病已日益明显，动物食品中药物残留和细菌耐药性等问题影响到食品安全和公共卫生安全。因此，近年来我国政策限制畜牧业中抗生素的使用，加之消费者的消费升级，抗生素替代产品研究备受关注。中药以天然性、多功能性、来源广泛、毒副作用低、不易产生耐药性等优点得到医学界的普遍认可，在饲料添加剂领域具有巨大的潜力。本课题组前期在中兽医学辨证施治理论基础上，结合工厂化养猪生产实践，以健脾和胃、补气安神、抗应激、增强免疫力为组方原则，用鱼腥草、金银花、黄芪和茯苓等中药材组成配方，经加工制成中药饲料添加剂，在断奶仔猪基础日粮中添加，发现该中药饲料添加剂能防止早期断奶仔猪发生腹泻，缓解应激，改善仔猪的生长性能[2]；能增强断奶仔猪免疫功能[3]；能提高仔猪自由基清除酶类的活性，增强机体的抗氧化能力[4]，表现出较好的保健作用。但具体的作用机制还不明确。一氧化氮(NO)是胃肠道非胆碱能神经递质之一，在消化系统中有广泛的调节作用[5]。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)催化相关底物产生体内的NO，而诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)只有当细胞受到内毒素、炎性细胞因子和氧化应激等刺激才表达。很多中药通过调控NOS-NO系统促进或抑制机体内NO的生成来防治心血管疾病和炎症[6]。中药对NO的含量和NOS的活性影响的研究在鼠类动物上最多，水产动物次之，其他动物很少。本研究通过检测仔猪血清中NO含量、NOS和iNOS的活性，探讨中药饲料添加剂对断奶仔猪血清中NO含量、NOS和iNOS活性的影响，以期揭示该中药饲料添加剂抗应激的可能作用机理，为该中药饲料添加剂的临床推广提供科学依据。
1. 材料和方法
1.1 试验材料
鱼腥草、黄芪、茯苓、刺五加、厚朴、金银花、山楂等中药材均购于福建同春药业股份有限公司。三元杂交仔猪(杜×长×大)来源于宁德市新科科技开发有限公司。中药多功能提取器、回流、浓缩机组由湖南衡阳市制药设备厂提供；VIS-7220型可见光分光光度计购于天美有限公司。一氧化氮测定试剂盒和一氧化氮合酶分型测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.2 试验方法
1.2.1 中药饲料添加剂的制备
中药饲料添加剂方Ⅰ由鱼腥草10%、黄芪20%、茯苓15%、刺五加10%、山楂15%、当归10%、厚朴10%和瞿麦10%等组成，中药饲料添加剂方Ⅱ由金银花10%、黄芪20%、茯苓15%、刺五加10%、山楂15%、当归10%、厚朴10%和瞿麦10%等组成。中药材按相应配比混合后，在控温减压(55~60℃，-0.05 MPa)条件下，经中药多功能提取机组提取浸膏，加淀粉，干燥粉碎，加广东溢多利生物科技股份有限公司生产的乳香素A香味剂混匀，分别得到中药饲料添加剂Ⅰ和中药饲料添加剂Ⅱ。
1.2.2 试验动物分组设置
选取16窝胎次相近(3~5胎)、日龄相同的杜长大三元仔猪，随机分成4组，每组4窝，每窝9头左右。设置4个处理组：中药Ⅰ组、中药Ⅱ组、抗生素组和对照组。各组仔猪从7日龄开始诱食试验粮，25日龄断奶后，依据公母各半、体重相近[(7.16±0.41)kg]、临床检查健康的原则，每个处理组各选取18头仔猪。在基础日粮基础上，中药Ⅰ组添加中药饲料添加剂Ⅰ4 kg·t-1，中药Ⅱ组添加中药饲料添加剂Ⅱ4 kg·t-1，抗生素组添加15%的金霉素70 g·t-1和15%杆菌肽锌30 g·t-1，对照组直接饲喂基础日粮。各组试验粮均制成颗粒性饲料。根据断奶仔猪的营养需求和生理特点，并参照中国农业行业标准猪饲养标准(NY/T65-2004)配制基础日粮，基础日粮配方及营养水平详见表 1。试验猪舍为高床半漏缝水泥地，钢筋护栏，通风良好。试验猪采取组内群饲，自由采食，自由饮水，其他饲养管理按猪场管理正常进行。
表 1 基础日粮配方及营养水平Table 1. Compositions and nutrient levels of basal diet原料 含量 营养水平 含量 玉米/% 56 代谢能/(MJ·kg-1) 12.59 豆粕/% 12 粗蛋白/% 19.89 膨化大豆/% 16 赖氨酸/% 1.15 乳清粉/% 4 蛋氨酸+胱氨酸/% 0.68 鱼粉/% 5 钙/% 0.58 脂肪粉/% 1.5 磷/% 0.45 柠檬酸/% 0.5 大豆油/% 1 预混料/% 4 注：预混料由硫酸铜、硫酸锰、硫酸亚铁、氧化锌、亚硒酸钠、磷酸氢钙、碘酸钙、氯化胆碱、多维、蛋氨酸、赖氨酸、复合酶等组成。 1.2.3 指标测定方法
于仔猪断奶后1、4、7、14、28 d上午7：00~9：00进行采血，采血前一天19：00开始对试验猪只禁食，直到采血操作结束。每组随机选取空腹仔猪6头，试验期采血的猪只保持一致，仰卧保定，前腔静脉采血8 mL左右，静置至析出血清，3 000 r·min-1离心10 min，将分离出的上清液4℃保存，待测。NO含量测定采用硝酸还原酶法[7]，NOS和iNOS活性测定采用化学比色法[8]。操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。
1.3 数据处理
用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析和DUNCAN多重比较，试验数据用平均值±标准差表示。
2. 结果与分析
2.1 断奶仔猪血清NO含量的变化
由表 2可知，在断奶1 d，两个中药组仔猪血清中NO含量均高于抗生素组和对照组，中药Ⅰ组和中药Ⅱ组分别比对照组高22.23%和21.72%，但差异均不显著。断奶14 d，中药Ⅰ组、中药Ⅱ组和抗生素组的NO含量均高于对照组，分别提高了65.75%(P＜0.05)、56.05%(P＜0.05)和47.62%(P＜0.05)。断奶28 d时，中药Ⅰ组和中药Ⅱ组的NO含量分别比对照组提高了41.3%(P＜0.05)和40.15%(P＜0.05)，但抗生素组仅比对照组提高了18.05%(P＞0.05)，表明中药组比抗生素组更显著地提高了断奶仔猪血清中NO的含量。
表 2 断奶仔猪血清NO含量Table 2. Serum NO in weaned piglets[单位/(μmol·L-1)] 组别 断奶1 d 断奶4 d 断奶7 d 断奶14 d 断奶28 d 中药Ⅰ组 91.80±16.46 94.42±23.76 105.22±10.73 94.75±20.21b 105.13±11.95b 中药Ⅱ组 91.41±34.05 98.04±32.72 100.50±45.44 89.20±23.07b 104.27±21.59b 抗生素组 86.74±29.92 90.58±21.66 100.47±24.20 84.38±25.00b 87.83±23.33ab 对照组 75.10±11.44 74.53±22.60 90.82±25.30 57.16±12.88a 74.40±22.35a 注：同列数字后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，表 3、4同。 表 3 断奶仔猪血清NOS活性Table 3. Serum NOS activity in weaned piglets[单位/(U·mL-1)] 组别 断奶1 d 断奶4 d 断奶7 d 断奶14 d 断奶28 d 中药Ⅰ组 21.93±2.79 20.41±1.05ab 21.61±6.08 21.59±2.69 22.30±2.84b 中药Ⅱ组 23.48±4.39 21.52±0.67b 21.07±1.88 22.06±2.06 22.28±1.62b 抗生素组 22.52±2.93 19.77±0.86ab 20.39±2.48 20.48±3.59 20.58±2.67ab 对照组 21.49±2.89 18.96±2.23a 19.58±2.54 19.85±1.45 19.06±2.74a 表 4 断奶仔猪血清iNOS活性Table 4. Serum iNOS activity in weaned piglets[单位/(U·mL-1)] 组别 断奶1 d 断奶4 d 断奶7 d 断奶14 d 断奶28 d 中药Ⅰ组 17.44±2.32 14.02±3.94 14.93±3.31 15.74±2.65 15.06±1.47 中药Ⅱ组 18.12±3.33 14.84±2.56 15.06±1.57 15.25±1.53 15.33±4.03 抗生素组 18.64±4.35 15.33±1.96 15.52±4.53 15.84±1.78 15.77±3.77 对照组 19.38±5.91 15.67±3.99 15.82±4.76 15.74±2.56 15.94±2.28 2.2 断奶仔猪血清NOS活性的变化
如表 3所示，断奶4 d时，中药Ⅰ组的NOS活性跟抗生素组、对照组差异不显著，而中药Ⅱ组比抗生素组提高8.85%(P＞0.05)，比对照组提高13.5%(P＜0.05)。断奶7 d时，中药Ⅰ组和中药Ⅱ组的NOS活性分别比对照组提高10.37%(P＞0.05)和7.61%(P＞0.05)。断奶28 d时，中药Ⅰ组和中药Ⅱ组的NOS活性分别比对照组提高17%(P＜0.05)和16.89%(P＜0.05)。
2.3 断奶仔猪血清iNOS活性的变化
由表 4可知，断奶1 d时，中药Ⅰ组和中药Ⅱ组的iNOS活性分别比对照组降低10%(P＞0.05)和6.5%(P＞0.05)。断奶4 d时，中药Ⅰ组的iNOS活性分别比抗生素组和对照组降低8.55%(P＞0.05)和10.53%(P＞0.05)，中药Ⅱ组比对照组也有所降低，但差异均不显著。断奶7 d后，各组血清中iNOS的活性逐渐接近，各处理间没有显著差异。
3. 讨论
Funderburke等[9]研究了心理、温度和营养因素对断奶仔猪生理和生长的影响，结果表明断奶应激主要是营养应激。因此，保护猪胃肠道，促进其对营养物质的消化吸收是缓解断奶应激的手段之一。NO作为细胞内及细胞之间的重要信号分子，广泛分布于机体的各组织系统中，在机体的生理和病理过程中起着重要作用[10-11]。体内NO是由一氧化氮合酶催化L-精氨酸转变为L-瓜氨酸时产生的，NOS是NO反应通路的限速酶[12]。有3种不同形式的NOS，即内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、神经元型一氧化氮合成酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)。eNOS存在于多种类型的细胞中，负责正常血管内皮中NO的产生；nNOS主要分布于神经系统；iNOS分布于巨噬细胞和内皮细胞，生理状态下不表达，当细胞受到内毒素、炎性细胞因子和氧化应激等刺激，细胞内iNOS基因被诱导表达，产生大量的NO，和超氧阴离子自由基迅速反应生成具有强氧化性的过氧化亚硝基，导致组织损伤，加剧炎症进程[13]。eNOS和nNOS产生的NO保护胃肠黏膜完整性，而iNOS产生的NO与胃肠道组织损伤有关[14-17]。临床上治疗胃溃疡的药物生胃酮，就是通过释放NO而发挥对胃黏膜的保护作用[11]。孔祥峰等[18]研究表明刺五加提取物能减轻断奶仔猪的应激反应，其中能提高仔猪断奶后14 d和28 d的NO含量，提示适宜浓度的NO对胃黏膜有保护作用。在本试验中，两个中药组仔猪血清中NO含量比抗生素组和对照组都有所提高。中药组仔猪NOS活性高于其他组，而iNOS活性还有所降低。中药饲料添加剂提高了断奶仔猪血清中NO含量和NOS的活性，却降低了iNOS的活性，产生的NO对仔猪的胃肠道黏膜产生保护作用，缓解断奶应激。中兽医学理论认为仔猪腑脏娇嫩，形气未充，卫外机能不固，容易发病，温邪上受，首先犯肺。脾常不足，宜补脾健胃，消食导滞，清热解毒。鱼腥草、金银花等具有清热解毒、增强免疫等功效，茯苓有渗湿利尿之功，黄芪具有补中益气、固表止汗的功效，刺五加补肾健脾，山楂行气消食，当归补血活血，厚朴益气健脾，瞿麦利水通淋, 诸药联用，组成了具有健脾和胃、补气安神、抗应激、增强免疫力作用的中药饲料添加剂。该中药饲料添加剂能很好地缓解断奶应激，达到组方设计的效果。
断奶应激给仔猪机体造成很大的影响，特别是消化系统。本试验从一氧化氮的角度初步阐明中药饲料添加剂抗应激的可能作用机理之一，说明中药材按中兽医学理论配制基础组方饲喂仔猪，可缓解断奶应激，提高生长性能，具有替代抗生素的潜能，有广阔的应用前景。
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图 1 离体培养各个阶段
注：A为增殖培养第1 d；B为增殖培养第15 d；C为增殖培养120 d；D为分化培养第1 d；E为分化培养第15 d；F为分化培养120 d；G为生根培养120 d；H为组培苗练苗移栽60 d。
Figure 1. Tissue cultures at various development stages
Note: A is multiplication culture on 1st day; B, 15th day; and, C, 120th day. D is differentiation culture on 1st day; E, 15th day; and, F, 120th day. G is rooting culture on 120th day. H indicates plantlets on 60th day after transplantation.
表 1 根状茎增殖培养配方正交设计L9（34）
Table 1 Orthogonal design L9 (34) on culture media for rhizome propagation
水平
Level因素 Factor 基本培养基 Basic medium 6-BA/(mg·L−1) NAA/(mg·L−1) 1 1/2MS 0.1 2.0 2 Revised 1/2MS 0.3 3.0 3 Hyponex Ⅱ3.0 g·L−1 0.5 5.0 注：改良1/2MS为不含有微量元素的1/2MS培养基。
Note: Modified ½ MS was regular ½ MS without added microelements.
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表 2 根状茎分化培养试验设计
Table 2 Experimental design on culture media for rhizome differentiation
处理号 Number NAA/(mg·L−1) 6-BA/(mg·L−1) TDZ/(mg·L−1) 1 0.3 1.0 0.0 2 0.3 2.0 0.0 3 0.3 3.0 0.0 4 0.3 0.0 0.5 5 0.3 0.0 1.0 6 0.3 0.0 1.5 7 0.5 1.0 0.0 8 0.5 2.0 0.0 9 0.5 3.0 0.0 10 0.5 0.0 0.5 11 0.5 0.0 1.0 12 0.5 0.0 1.5
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表 3 组培苗生根培养全因素设计
Table 3 All factor design on culture media for plantlet rooting
处理号 Number IBA/(mg·L−1) 蛋白胨 Peptone/(g·L−1) 1 0.5 1.0 2 0.5 2.0 3 0.5 3.0 4 1.0 1.0 5 1.0 2.0 6 1.0 3.0 7 1.5 1.0 8 1.5 2.0 9 1.5 3.0
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表 4 不同处理对根状茎增殖培养的影响
Table 4 Effects of medium composition on rhizome propagation
处理号
NumberA：基本培养基
Basic mediumB：6-BA/(mg·L−1) C：NAA/(mg·L−1) 生长速度
Speed of growth增殖系数
Proliferation coefficient1 1 1 1 2.53±0.35 Bd 7.40±0.42 Aa 2 1 2 2 4.19±0.14 Bbcdd 6.69±0.0 5 Aab 3 1 3 3 4.76±0.31 ABbc 7.46±0.66 Aa 4 2 1 2 2.91±0.18 Bcd 6.27±0.31 Aab 5 2 2 3 3.46±0.15 Bbcd 7.20±0.30 Aa 6 2 3 1 4.19±0.47 Bbcd 5.85±0.07 Aab 7 3 1 3 5.21±0.41 ABb 5.41±0.54 Ab 8 3 2 1 5.10±0.53 ABbc 5.93±0.10 Aab 9 3 3 2 7.31±0.27 Aa 6.02±0.82 Aab ka1 3.83 3.55 3.94 Ra值排序：A＞B＞C
最优水平：A3B3C2
Rb值排序：A＞C＞B
最优水平：A1B2C3ka2 3.52 4.25 4.80 ka3 5.87 5.42 4.48 Ra 2.35 1.87 0.87 kb1 7.18 6.36 6.39 kb2 6.44 6.61 6.33 kb3 5.79 6.45 6.69 Rb 1.39 0.25 0.37 注：ka表示生长速度；Ra表示生长速度的极差；kb表示增殖系数；Rb表示增殖系数的极差。大写字母表示在0.01水平下的差异，小写字母表示0.05水平下的差异，下同。
Note: ka stands for speed of growth; Ra, variance of ka; kb, multiplication coefficient; and, Rb, variance of kb. Capital letters indicate significantly different at P＜0.01, lowercase significantly different at P＜0.05. Same for Table 5&6.
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表 5 NAA、6-BA和TDZ对根状茎芽分化的影响
Table 5 Effects of varied concentrations of NAA, 6-BA, and TDZ on rhizome differentiation
处理号 Number 分化率 Differentiation rate /% 芽诱导个数 Number of Induced bud /个 株高 Plant height/cm 1 98.00±6.32 Aa 4.07±0.53 BCDEbcde 2.70±0.81 Aa 2 90.00±10.44 ABabcd 5.44±0.78 Aa 2.53±0.75 Aa 3 94.55±12.93 ABab 4.90±0.52 ABab 1.51±0.42 DEFcd 4 78.08±19.10 Bcd 4.48±0.71 ABCDbc 1.70±0.36 CDEc 5 91.67±13.37 ABabc 4.78±0.63 ABCab 1.26±0.27 EFde 6 77.14±15.41 Bd 4.07±0.50 BCDEbcde 1.06±0.16 Fe 7 94.00±13.50 ABab 3.55±0.36 CDEcde 2.77±0.90 Aa 8 87.27±13.48 ABabcd 3.31±0.33 DEde 2.49±0.79 ABa 9 80.00±16.33 ABcd 3.09±0.33 Ee 2.07±0.55 BCb 10 46.00±9.66 Ce 3.15±0.48 Ee 1.77±0.47 CDbc 11 88.33±10.30 ABabcd 4.18±0.47 BCDEbcd 1.51±0.30 DEFcd 12 81.43±11.43 ABbcd 3.80±0.45 BCDEcde 1.47±0.33 DEFcd
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表 6 不同IBA和蛋白胨对组培苗生根的影响
Table 6 Effects of varied concentrations of IBA and peptone on rooting of seedlings
处理号 Number 生根率 Rooting rate/% 生根数 Number of roots/条 平均根长 Average root length /cm 1 72.73±16.61 Aa 5.25±0.76 ABb 2.65±1.19 Bc 2 82.86±12.87 Aa 5.89±1.16 ABab 2.80±1.20 ABbc 3 83.33±18.25 Aa 4.53±0.61 Bb 2.77±1.13 Bbc 4 89.47±15.29 Aa 5.25±1.00 ABb 2.75±1.30 Bbc 5 88.24±15.94 Aa 5.29±1.79 ABb 2.91±1.27 ABabc 6 77.42±12.62 Aa 6.87±1.09 ABab 3.18±1.12 Aa 7 97.14±9.24 Aa 6.46±1.17 ABab 3.19±1.20 Aa 8 100.00±0 Aa 8.03±1.38 Aa 3.00±1.16 ABab 9 96.43±7.91 Aa 6.31±1.37 ABab 2.75±1.08 Bbc
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