Effects of Feeding Schizochytrium on Anti-Vibrio vulnificus Infection in Zebrafish
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摘要:目的 研究饲料中添加裂殖壶菌对鱼类抗细菌感染能力的影响，为裂殖壶菌作为饲料添加剂的应用提供理论基础。方法 以6个月的成年斑马鱼为研究对象，以基础颗粒饲料为对照组（C组），试验组在基础饲料中添加干重3%的裂殖壶菌（S组），进行28 d饲喂试验。28 d后以创伤弧菌Vibrio vulnificus菌株FJ03-X2对斑马鱼进行攻毒，统计免疫保护率，并收集斑马鱼的肾脏组织提取RNA，逆转录成cDNA，通过Real-time RT-PCR检测相关基因lysozyme和tnfb的表达。结果 饲料中添加3%裂壶菌能够显著提高斑马鱼感染创伤弧菌后的存活率，相对保护率为42.8%；Real-time RT-PCR检测的结果发现S组的斑马鱼肾脏中溶菌酶Lysozyme的mRNA水平极显著高于对照组（P＜0.01），而肿瘤坏死因子TNFb的mRNA水平则极显著低于对照组（P＜0.01）。结论 裂殖壶菌作为营养添加剂可以提高斑马鱼抗创伤弧菌感染的能力。Abstract:Objective A feeding experiment was conducted in order to study the effects of feeding Schizochytrium on the resistance of fish to bacterial infection.Methods Six-month adult zebrafishes were fed with diety added 3% Schizochytrium(Group S) for 28 days in a laboratory culture system, and the control with only basic diety(Group C). Then Vibrio vulnificus FJ03-X2 was applied for infection, and the relative survival percent of zebrafishes were analyzed. And RNA was extracted from the kidney tissues and reverse transcribed into cDNA to detect the experison of lysozyme and tnfb.Results The survival rate of Group S was significantly increased with immune protective rate reaching 42.8%. The mRNA level of Lysozyme in the kidney of zebrafish in Group S was significantly higher than that in the control (P＜0.01), while the mRNA level of TNFb was significantly lower than that in the control group (P＜0.01).Conclusion As a nutrient additive, Schizochytrium could improve the ability of zebrafish to resist bacterial infection, which provided a theoretical basis for the application of Schizochytrium in fishery industry.
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Keywords:
- Schizochytrium /
- zebrafish /
- Vibrio vulnificus /
- feed additive
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0. 引言
【研究意义】提高水稻产量一直是水稻育种研究的重要内容。前人研究表明，理想株型与杂种优势利用相结合是提高水稻产量的有效途径[1-2]。改良水稻株型实质是协调水稻产量相关性状——有效穗数、穗粒数和粒重等主要性状之间的关系。传统杂交育种方法改良水稻产量相关性状存在的不确定性和盲目性，大大限制了水稻高产育种水平的提高。大量水稻产量相关性状基因的克隆及相关生物技术的应用，特别是近几年发展起来的基因组编辑技术的应用，为定向改良水稻株型和产量相关性状创造了条件，也提供了一条有效途径。【前人研究进展】基因组编辑技术(genome editing)是一种在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。其基本原理是利用序列特异性核酸酶(sequence-specific nucleases，SSNs)锚定基因组特定的位点，产生DNA双链断裂，激活细胞自身修复机制，进行非同源末端连接或同源重组修复。在修复过程中会发生基因序列改变，从而实现基因定点缺失、定点插入或替换等突变，从而达到定点改造基因组的目的[3]。目前用于基因组编辑的序列特异性核酸酶(SSNs)主要有3类：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系统。近年来，随着基因组编辑技术的发展和完善，基因组编辑技术开始广泛应用于作物遗传及育种种质创新研究[4]。【本研究切入点】水稻理想株型基因Ideal Plant Architecture 1(IPA1)是决定株型的关键调节因子，编码SPL14蛋白，是一个SPL转录因子家族成员, 其表达主要受miRNA156调节[5-6]。当miRNA156在基因IPA1上的识别位点发生突变时，干扰miRNA156调控IPA1 mRNA的降解，使IPA1表达量增高，导致水稻植株的分蘖数减少，株高和穗粒数增加，形成所谓的分蘖少、穗大、株型好的“理想株型”[5-7]。但由于不同的生态环境及育种目标，对株型的要求有所差异，使得理想株型的应用受到很大限制。通常，水稻多穗型品种较少蘖、大穗型品种有更好的适应性。本研究从创制与理想株型相反的水稻株型材料入手，探讨创制多穗型水稻株型的方法，并了解其株型特征。【拟解决的关键问题】基于基因组编辑技术在基因定向突变方面的有效性，本研究利用TALENs技术，定点突变明恢86背景下的IPA1基因，创制一批IPA1基因突变体，获得与理想株型相反的水稻株型材料，为水稻株型改良提供新的遗传变异材料。
1. 材料与方法
1.1 材料
本研究所用受体水稻品种明恢86，是一个优良的籼型三系杂交稻恢复系[8]。所用菌株由本实验室保存；TALEN左臂骨架载体、TALEN右臂骨架载体、植物表达载体p1300M等质粒载体均由上海斯丹赛生物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 基因序列的获取及靶位点的设计和选择
利用粳稻日本晴基因组上IPA1基因的序列信息(NCBI：http://www.ncbi.nlm.gov/)，考虑IPA1基因序列较长，设计了两对分段扩增引物(IPA1-F1：GCT ACA GTC TCC TTC CCA CC, IPA1-R1：CAG GCA AGT CAC ATC ACT CAA C; IPA1-F2：CAC AGC AGC AGT GGA TAG GAI，PA1-R2：CGC ATT ATT ATT CAT CAC AGG GA)，通过PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR扩增体系，扩增获得明恢86中IPA1基因全长序列，与日本晴进行比对分析。
靶位点的设计和选择是利用相关TALENs靶位点设计辅助网站(或www.talendesign.org/)获得基因可供选择的靶位点，综合基因特点选择最优靶位点[9]。
1.2.2 载体构建及转基因植株的获得
合适靶位点选取后，明确TALEN左臂、右臂识别序列，根据上海斯丹赛公司提供的试剂盒使用说明书及模块组合方法，首先分别合成左、右臂识别元件及其连接的FokI核酸酶的表达载体。在由上海斯丹赛生物技术有限公司提供的TALEN左臂骨架载体、TALEN右臂骨架载体的基础上添加识别靶位的TALE蛋白的表达元件。验证正确后，再将左、右臂识别元件及其连接的FokI核酸酶的表达元件连接到植物表达载体p1300M上，并通过测序确定，构建完整的TALENs表达载体。将构建好的表达质粒导入农杆菌LBA4404，采用本实验室创建的高效农杆菌介导籼稻胚性愈伤转化方法[10]，获得转基因再生植株。
1.2.3 水稻遗传转化苗阳性植株筛选
检测TALENs表达载体框是否成功插入到再生水稻基因组中，本研究通过TALENs表达载体框引物(TF：5- TGA CCG AGT TCA AGT TCC-3′；TR：5′-TTG CGG GAC TCT AAT CA-3′)PCR分析遗传转化苗的总DNA，能够扩增出392 bp特异性条带的为阳性转化植株。
1.2.4 靶位点序列突变检测
TALENs载体遗传转化阳性植株的靶位点序列分析采用PCR扩增，然后测序分析。扩增引物(ITF: GCA GTG GCG GGA TAT GGT；ITR:ATC GTG TTG CTG GTT TGG)基于靶位点两侧序列设计。对于测序后确定的突变体，当靶位点序列缺失或插入4 bp以上时，后代追踪突变位点采用PCR结合聚丙烯酰胺凝胶(2%)电泳分析，而不是测序分析，以提高效率，减少费用。
1.2.5 突变体的相关表型分析
IPA1是影响株型的重要基因，突变体的表型分析主要从株高、穗数、穗粒数、千粒重、穗长等方面考察表型。因穗数受环境影响较大，所以在突变体周围种植保护行，以尽量减少环境造成的误差。所有的田间调查数据都进行3次重复，并用DPS 7.05数据处理软件分析。
2. 结果与分析
2.1 目标基因序列分析及靶位点选择
为了准确利用基因组编辑技术编辑籼稻恢复系明恢86的理想株型基因IPA1，需要了解明恢86中IPA1基因序列信息。因此，利用PCR扩增明恢86背景下IPA1基因序列，测序后比对发现，明恢86中IPA1基因序列与日本晴的一致。
依据相关文献[5-7]，基因IPA1是水稻分蘖数的一个负调控因子，其表达序列区有一个miRNA156结合位点，该结合位点序列发生碱基替换突变时，基因IPA1的表达产物增加，引起水稻株型的变化。为了解该miRNA156结合位点区发生强突变对水稻株型的影响，本研究TALENs的靶位点选择在miRNA156结合的位点附近(图 1)。依据TALENs靶序列设计原则，本研究设计了2个TALENs靶位(表 1)，分别利用这2个靶序列构建了相应的TALENs表达载体TIPA1-1和TIPA1-2，以期增加获得期望突变的概率。
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图 1 TALENs编辑水稻IPA1基因的靶位点注：空心框为基因IPA1的非翻译区，实心框为IPA1的编码区，实线为内含子；箭头所示为miRNA156结合序列区；TIPA1-1、TIPA1-2为基于TALENs设计的2个靶位点。Figure 1. Target sites in rice IPA1 gene for TALENs editingNote: Empty frame encloses untranslated region; filled frame, coding region; and, solid line, intron. Arrow indicates binding sequence of microRNA156; TIPA1-1 and TIPA1-2 are two target sites designed based on TALENs.表 1 基因编辑的靶位点序列Table 1. Target sequence for gene-editing靶位点编号
Target Num.靶位点序列
Target sequencesTIPA1-1 左臂Left arm：GCCGCCACCGACTCGAG 右臂Right arm：TCCCATGGCTGGGTTGACA TIPA1-2 左臂Left arm：CGGTGCCGCCACCGACT 右臂Right arm：GGGTTGACAGAAGAG 2.2 农杆菌介导转化和阳性再生克隆的筛选
将所构建的TALENs载体(TIPA1-1和TIPA1-2)分别经农杆菌介导转化水稻愈伤组织，获得转基因再生植株。PCR检测发现，不同的载体转基因后代的阳性克隆率有所不同。总的看TALENs载体的阳性克隆率较高，TIPA1-1和TIPA1-2的阳性克隆率分别为94.7%和85.1%(表 2、图 2)。
表 2 基因编辑再生植株阳性率及靶位点突变率Table 2. Positive transgenic and mutation rates of target gene editing on plants载体名称
Vector name再生克隆数 阳性克隆数 阳性率/% 突变克隆数 阳性克隆突变率/% TIPA1-1 38 36 94.7 2 5.6 TIPA1-2 67 57 85.1 0 0.0 注：再生克隆数Num. of regenerated clones，阳性克隆数Num. of positive clones，阳性率Positive percentage，突变克隆数Num. of mutation clones，阳性克隆突变率Mutation percentage of positive clones。 ![]()
图 2 基因编辑T0代阳性转基因植株筛选注：CK+为阳性(质粒)，CK-为阴性对照(野生型明恢86)；1~11为部分转基因植株；M为DNA Ladder。Figure 2. Screening of gene-edited T0 mutant transgenic plantsNote: CK+: indicates positive control (plasmid); CK-:negative control (wild type Minghui 86); numbers 1-11:parts of transgenic plants; M: DNA ladder.2.3 转基因植株中靶位点序列检测
对TALENs载体获得T0代阳性转基因植株，用引物ITF/ITR扩增IPA1基因的靶位点区，测序发现TIPA1-1载体转基因阳性克隆中只有2个克隆的植株靶位点有突变，阳性植株突变率约5.6%；而TIPA1-2载体转基因后代中未检测到靶位点的突变(表 2)。进一步将TIPA1-1和TIPA1-2的抗性愈伤组织进行继代培养，连续继代后分化，结果发现：TIPA1-1新的再生植株中出现新突变(原来无突变克隆)或新的突变类型(原有突变克隆)，并出现纯合突变和大片段缺失的类型；连续继代两代后即出现缺失16 bp的纯合突变和缺失180 bp的大片段缺失突变体。在TIPA1-1继代分化苗中筛选到31株突变体，突变类型有8种(图 3)。而在TIPA1-2继代分化苗中仍未筛选到靶位点突变植株，推测TIPA1-2的TALENs蛋白可能缺少活性。
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图 3 TALENs编辑基因IPA1的序列突变类型注：下划线部分序列为TALENs识别序列，中间阴影部分为Spacer序列，缺失的碱基用“-”表示; 左边编号A起头的为未经过连续继代的抗性愈伤组织直接分化苗，编号B起头和C起头的分别为抗性愈伤组织连续继代2次和3次后的分化苗。右边数字为变化碱基数，缺失为“-”，插入为“+”；Homo为纯合突变，未标示者为杂合突变。Figure 3. Mutation types of IPA1 produced by TALENsNote: Underscored sequences are TALENs recognition sequences; shaded part, spacer sequence; and, "-", missing base. On the left, numbers begin with A are directly differentiated from non-successive resistant callus; numbers with B, successively sub-cultured twice; and, numbers with C, successively sub-cultured three times. On the right, data are counts of variable base; and, "-" represents deletion; "+", insertion; "Homo", homozygous mutation; and, unmarked heterozygous mutation.2.4 不含转基因成分突变体植株筛选
将上述目标基因序列突变的T0代植株进行自交，获得T1代种子，种植成T1代植株。利用载体引物对这些T1代植株中的转基因成分进行PCR分析，筛选出不含转基因成分的T1代植株(图 4)。再利用测序(单碱基变异)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(多碱基缺失或插入)对不含转基因成分植株中靶位点序列进行分析，获得不含外源转基因成分的纯合或杂合靶基因突变体(图 5)。进一步对纯合突变体的农艺性状进行选择可获得水稻新种质。
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图 4 不含转基因成分(TALENs载体成分)的T1植株筛选注：泳道1~10为靶基因有突变的一个转基因T1代株系，其中无扩增条带的为不含转基因成分植株；泳道11：野生型明恢86；泳道12：清水；M：DNA Ladder。Figure 4. Selection of T1 plants without transgenic (TALENs vector) componentsNote: Lanes 1-10 are T1 transgenic plants mutated in target gene; and, those without amplified bands, non-transgenic. Lane 11 is wild-type Minghui 86; Lane 12, water; and, M, DNA ladder.![]()
图 5 不含转基因成分的突变体筛选注：A为测序检测野生型及缺失2 bp(-CT)纯合和杂合突变体靶序列; B为聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，野生型(wt)，缺失4 bp(-CTCT)的纯合(m)和杂合子(hm)。Figure 5. Selection on mutants free of transgenic componentsNote: A represents detection of target sequences in wild type and mutants with 2 bp-deletion (-CT) homozygous or heterozygous by sequencing; and, B, marker analysis of target site in wild type (wt) and mutants with 4 bp-deletion (-CTCT), homozygous (m) or heterozygote (hm) by polyacrylamide gel electrophoresis.2.5 IPA1-TALENs转基因植株后代表型观察及新株型材料创制
选择不含外源转基因成分的3种突变体(缺失2、4、16 bp移码突变体)观察田间表型。田间调查结果发现，这3种突变体的表型变化一致，株高相对野生型显著降低，而分蘖数显著增多(图 6)。
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图 6 IPA1基因编辑突变体株型注：ipa1-CK为杂合突变体分离得到的野生型；ipa1-2、ipa1-4、ipa1-16分别为T2代缺失2、4、16 bp的纯合突变体。Figure 6. Plant architectures of wild-type and IPA1 gene edited mutantsNote:ipa1-CK is a wild-type from progeny of a heterozygous mutant; ipa1-2, ipa1-4, and ipa1-16 are T2 homozygous mutants with 2 bp, 4 bp, and 16 bp detection, respectively.对考种数据进行分析发现，IPA1基因突变能够显著改变水稻的株高、有效穗数、穗长及穗粒数。在明恢86遗传背景下，缺失移码突变体的株高为90.6~94.1 cm、有效穗数为14.4~16.5个·株-1、穗长为18.1~19.4 cm、穗粒数为113.2~122.7粒、结实率为79.20%~83.70%、千粒重为28.1~28.8 g。与野生型比较，突变体的株高降低7.9%~11.4%，有效穗数增加46.9%~68.4%，穗长变短24.2%~29.3%，穗粒数减少31%~34%，结实率和千粒重差异不明显(表 3)。由此可见，利用TALENs基因组编辑技术定点突变水稻IPA1基因能够明显改变水稻株高、有效穗数、穗长及穗粒数等性状，产生与野生型不同的水稻新株型。
表 3 ipa1纯合突变体主要农艺性状Table 3. Main agronomic traits of IPA1 mutants样品编号
Sample NO.株高
Plant height/cm有效穗数
Effective panicle number穗长Average of panicle length/cm 穗粒数
grains per panicle结实率
SettingPercentage/%千粒重1000-grain weight/g ipa1-CK 102.2Aa 9.8A 25.6 A 178.2Aa 81.4a 28.3 a ipa1-2 90.6Bb 15.8C 19.3B 122.7Bb 79.20 a 28.1 a ipa1-4 90.7Bb 16.5C 19.4B 121.2Bb 83.70 a 28.6 a ipa1-16 94.1Bc 14.4B 18.1C 113.2Bc 82.50 a 28.8 a 注：ipa1-CK为杂合突变体分离得到的野生型；ipa1-2、ipa1-4、ipa1-16分别为T2代缺失2、4、16 bp的纯合突变体。表中同列数据后无相同大、小写字母者分别表示同一性状不同样品材料之间差异达极显著水平(P < 0.01)和显著水平(P < 0.05)。
Note：ipa1-CK is a wild-type from progeny of a heterozygous mutant; ipa1-2, ipa1-4, and ipa1-16 are T2 homozygous mutants with 2 bp, 4 bp, and 16 bp detection, respectively. Data in a same column with different capital letters indicate extremely significant differences (P < 0.01) and with different lowercase letters, significant differences (P < 0.05).3. 讨论
20世纪90年代，Khush等提出水稻“新株型”(理想株型)概念，其特征是少分蘖、植株较矮、穗粒数较多、茎秆强壮、根系发达并抗多种病虫害等[18-19]，但依此理念早期进行的水稻新株型育种实践效果并不理想[20-21]。水稻理想株型育种虽然进展缓慢，但有关理想株型相关基因的分子遗传学研究取得一系列重要进展，特别是围绕水稻理想株型关键基因IPA1的功能及调控机制研究[5-6, 22-24]，为水稻理想株型育种注入了新的活力。本研究通过基因组编辑技术定向突变了IPA1基因，在优良恢复系明恢86的背景下创制了一批ipa1基因移码突变体，表型观察发现：其植株显著矮化，分蘖显著增多，穗粒数显著减少，是一些与理想株型特征完全不同的株型变异。
目前生产上应用的每一种水稻株型都有缺陷，这是因为水稻产量构成因子(有效穗数、穗粒数和千粒重)间存在一定的负相关，增加水稻产量实质是它们彼此之间协调或折中的结果。早期的理想株型材料中，IPA1表达量增加，可显著增加穗粒数、但也显著减少了分蘖数，使得理想株型的增产效应并不明显[20-21]。对超级稻甬优12的最新研究发现，控制IPA1的表达水平可以适度调节理想株型性状，从而有可能获得理想产量[22]。当然，实际生产上应用的水稻品种产量形成的遗传机理要复杂得多，不仅仅是IPA1基因，也涉及其他相关基因及其互作效应[25-26]。本研究通过基因编辑突变IPA1基因后产生了一系列多穗型株型突变体，但这些突变体的产量效应，特别是与不同不育系配组后的杂种表现，以及与其他产量构成性状基因(如穗粒数基因、粒重基因等)的关系还有待进一步研究。
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图 1 Real-time RT-PCR检测创伤弧菌感染后肾脏中lysozyme的mRNA水平
注：C为对照组攻毒前；S为试验组攻毒前；C+V.v-L为对照组创伤弧菌攻毒存活的斑马鱼；C+V.v-D为对照组创伤弧菌攻毒死亡的斑马鱼；S+V.v-L为试验组创伤弧菌攻毒存活的斑马鱼；S+V.v-D为试验组创伤弧菌攻毒死亡的斑马鱼；**表示试验组与对照组存在极显著性差异P＜0.01。图2同。
Figure 1. mRNA level of lysozyme in the kidney of zebrafish under infection by Vibrio vulnificus
Note: C-Zebrafish in the control group before challenge; S-Zebrafish in the experimental group before challenge; C+V.v-L-Survival zebrafish in the control group challenged by Vibrio vulnificus; C+V.v-D-Dead zebrafish in the control group challenged by Vibrio vulnificus; S+V.v-L- Survival zebrafish in the experimental group challenged by Vibrio vulnificus; S+V.v-D- Dead zebrafish in the experimental group challenged by Vibrio vulnificus; **-The value indicates significant difference，P＜0.01. The same as Fig. 2.
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图 2 Real-time RT-PCR检测创伤弧菌感染后肾脏中tnfb的mRNA水平
Figure 2. mRNA level of tnfb in the kidney of zebrafish under infection by Vibrio vulnificus
表 1 基础饲料的营养成分
Table 1 Nutrient composition of basic feed
成分 Ingredient 含量 Content/% 粗蛋白质 Crude protein ≥40.0 粗纤维 Crude fiber ≤4.0 氨基酸 Amino acid ≥30.0 粗灰分 Crude ash ≤16.0 水分 Water content ≤11.0 盐分 Salt ≤3.0 总磷 Total phosphorus content ≥0.9 钙 Calcium ≥1.5 
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表 2 PCR引物序列
Table 2 PCR primer sequence
目的基因 Objective gene 正向引物序列（5′-3′）Forward primer sequence（5′-3′） 反向引物序列（5′-3′）Reverse primer sequence（5′-3′） actb1 CACTTCACGCCGACTCAAAC TCGGGGATGCTTATTTGCCA tnfb GCCAACCCATTTCAGCGATTG GGCATGTGATGAAGCCAAACGAA lysozyme CCGTAGTCCTTCCCCGTATCA GATTTGAGGGATTCTCCATTGG
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表 3 裂殖壶藻ATCC MYA-1381的脂肪酸组成
Table 3 Fatty acid composition of Schizochytrium ATCC MYA-1381
脂肪酸 Fatty acid 百分比 Percentage% C14∶0 3.81 C15∶0 0.95 C16∶0 43.22 C16∶1n7c 0.16 C17∶0 0.38 C17∶1n7c 0.13 C18∶0 0.74 C18∶1n9c 0.08 C18∶2n6c 0.04 C18∶3n3c 0.07 C20∶0 0.19 C20∶3n6c 0.67 C20∶4n6c 0.17 C20∶5n3c 1.25 C23∶0 0.08 C24∶0 0.08 C22∶6n3c 39.62 其他 Others 8.35
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表 4 斑马鱼创伤弧菌攻毒试验
Table 4 Infection test of zebrafish with Vibrio vulnificus
组别 Groups 攻毒尾数 Total number 死亡尾数 Dead number 死亡率 Death rate（24 h） 免疫保护率 Relative survival percent（RPS） 对照组 Control group 15 7 46.7% — 试验组 Experimental group 15 4 26.7% 42.8%
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期刊类型引用(1)
1. 张新明，赵璐，胡晓文. 裂壶藻营养价值及其在动物生产中的应用进展. 河南农业科学. 2021(03): 1-10 . 
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