Effects of Biochar Addition on Phenolic Acids and Microbial Community in Rhizosphere Soil at Continuous Cropping Field of Tobacco
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摘要:目的 以连作植烟根际土壤为研究对象，探明生物炭对不同生育期烤烟根际土壤中与化感自毒密切相关的7种酚酸（阔马酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸）及土壤微生物群落结构的影响，为缓解化感自毒引起的烟草连作障碍提供理论依据。方法 采用HPLC检测和高通量测序技术分析了不同施肥处理烤烟各生育时期根际土壤中酚酸物质含量和土壤微生物的变化情况。结果 不同施肥处理后烤烟各生育时期根际土壤中均检测出6种酚酸类物质，除肉桂酸变化不明显外，对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸的含量在各生育期均表现为生物炭处理低于常规施肥处理；且施用生物炭后酚酸物质的总量在团棵期、旺长期和采烤期较常规施肥处理分别降低了1.86%、11.36%和40.44%。生物炭能在一定程度上提升烤烟根际土壤微生物群落的多样性与丰富度，旺长期生物炭处理细菌、真菌OTU丰度分别是常规施肥处理的1.23倍和1.07倍；与常规施肥处理相比，生物炭处理的细菌Shannon、ACE和Chao1指数旺长期分别提升了12.43%、23.0%和23.0%，采烤期分别提升了0.32%、2.40%和1.25%；真菌Shannon、ACE和Chao1指数旺长期分别提升了6.54%、6.67%和7.43%，采烤期分别提升了57.93%、8.60%和26.37%。结论 生物炭对植烟土壤有一定的改良与提质效应，有利于创造健康的根际微生态环境，缓解化感自毒引起的连作障碍。Abstract:Objective Effects of biochar addition on the microbial community and phenolic acids in rhizosphere soil at site of continuous-cropping of tobacco at various growth stages were investigated.Method The changes on the contents of 7 phenolic acids and microbial communities in the rhizosphere soil under conventional and biochar-added fertilizations were determined by HPLC and high-throughput sequencing techniques for the analysis.Result Six out of the 7 phenolic acids were detected in the soil specimens at all tobacco growth stages. With the addition of biochar in the fertilizer, aside from cinnamic acid that showed no significant variation, the contents of p-hydroxybenzoic acid, vanillic acid, syringic acid, 4-coumaric acid, and ferulic acid in the soil were lower than those under the control treatment of conventional fertilization. Compared to control, the total phenolic acid in the soil fertilized with added biochar decreased at the resettling, vigorous growing, and harvesting tobacco stages by 1.86%, 11.36%, and 40.44%, respectively. Biochar improved the diversity and richness of rhizosphere microbial community as well. At the vigorous tobacco growing stage, the bacteria and fungi OTU abundance under biochar treatment were 1.23 times and 1.07 times of control, respectively. Compared with the conventional fertilization, the biochar addition increased the Shannon, ACE and Chao1 indices on bacteria by 12.43%, 23.0%, and 23.0%, respectively, during the vigorous growing stage; and, by 0.32%, 2.40%, and 1.25%, respectively, during the harvesting stage. On fungi, the Shannon, ACE and Chao1 indices were raised by 6.54%, 6.67%, and 7.43%, respectively, in the vigorous growing stage; and, by 57.93%, 8.60%, and 26.37%, respectively, in the harvesting stage.Conclusion It appeared that biochar significantly improved and upgraded the tobacco-growing soil by creating a healthy micro-ecological rhizosphere. The addition also alleviated some of the detrimental effects of the allelopathic autotoxicity generated from continuous cropping.
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Keywords:
- tobacco /
- obstacles in continuous cropping /
- phenolic acid /
- soil microbes
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0. 引言
【研究意义】烤烟是我国重要的经济作物之一。大量研究表明，烟田土壤长年连作以及施肥措施单一，会导致烟田土壤pH值、有机质含量不断下降，土壤养分失衡，酶活性变化，微生物多样性降低以及自毒物质积累等一系列土壤问题[1]，进而导致烟株营养失调、土传病害严重发生等，从而影响烟叶的产量和质量[2]，严重制约了烟草行业的可持续发展。探明连作障碍的发生原因并采取有效措施缓解连作障碍是烟叶健康生产的关键。作物连作障碍与化感自毒密切相关，单一作物连作会造成根系分泌物在土壤中不断积累，从而对作物和土壤微生物产生化感作用[3]，而土壤微生物是土壤中生理活性最强的部分，对土壤环境的变化较为敏感，能较早的表征土壤质量和生态功能的变化[4]。因此从根际微生态角度研究连作障碍并寻求有效缓解措施具有重要的理论与实际意义。【前人研究进展】研究表明酚酸类物质是单一连作体系中重要的化感物质，可通过影响植物的膜系统、光合作用、酶活性等抑制植物生长[5]；也可通过直接或间接的自毒作用，选择性地促进或抑制某些土壤微生物生长，最终导致根际微生物群落结构改变而影响作物生产[6]。前人对黄瓜[7]、大豆[8]、草莓[9]、地黄[5]和三七[10]等的连作研究表明，连作土壤中酚酸物质的含量数倍于轮作，且随连作年限增加表现出明显积累趋势，酚酸类物质在连作土壤中不断积累是导致连作障碍发生的关键。然而，有研究发现，酚酸类物质在植烟土壤中也同样表现出富集效应，酚酸类物质总含量随着烤烟连作年限的延长表现出升高的趋势，随着烤烟连作年限增加，酚酸物质逐渐积累并参与土壤各种生理生化过程[11]。研究指出，烟草连作障碍土壤中化感类自毒物质的积累会导致土壤微生物群落多样性显著降低，病原微生物数量明显增加，造成土壤微生态系统失衡[12]。由此可见，酚酸类物质在植烟土壤中积累亦在某种程度上导致了烟草连作障碍的发生。【本研究切入点】通过土壤调理修复来克服连作障碍已成为近几年研究的热点。而生物炭作为一种土壤改良剂，以其独特的物理、化学及生物学特性受到越来越多的关注。大量研究表明，生物炭在改善土壤理化性质[13]、促进作物生长[14]等方面均有积极作用；同时，前人通过生物炭对苹果[15]、芦笋[16]等连作障碍的影响研究发现，生物炭能在一定程度上缓解化感自毒引起的连作障碍，但生物炭对植烟土壤连作障碍的影响目前尚未见报道。【拟解决的关键问题】因此，本试验采用HPLC检测及Illumina Hiseq高通量测序技术探明生物炭对连作烤烟根际土壤酚酸类物质及微生物群落结构的影响，为缓解和消减烤烟化感自毒引起的连作障碍、提高其产量和质量提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验于2018年在云南省临沧市耿马县勐撒镇进行（99°23′22″ E，23°33′40″N）。选取连作障碍严重的烟田，试验区植烟土壤类型为红壤，土壤质地为轻黏土，试验地土壤理化性质：pH4.69；有机质29.13 g·kg−1；水解氮155.28 mg·kg−1；铵态氮2.48 mg·kg−1；有效磷8.84 mg·kg−1；速效钾145.97 mg·kg−1；烤烟品种为云烟87。供试生物炭基本性质为：pH10.02；有机质31.06 g·kg−1；水解氮226.1 mg·kg−1；全磷6.77 g·kg−1；全钾14.70 g·kg−1；有效磷356.0 mg·kg−1；速效钾3 142 mg·kg−1。
1.2 试验设计和样品采集
试验设置2个处理，T1：当地常规施肥（单施烟草专用复合肥，每667 m2施基肥40 kg，养分含量49%，N∶P2O5∶K2O=10∶14∶25；每667 m2追肥20 kg，养分含量45%，N∶P2O5∶K2O=15∶0∶30）；T2：烟草专用复合肥减量10%（每667 m2施基肥36 kg，追肥18 kg）+生物炭300 g·株-1（烤烟移栽时作为基肥拌塘施用）。在常规栽培管理措施如耕作、排灌、密度、防治病虫害等一致的前提下，采用随机区组排列试验设计，设每处理3次重复，常规单垄移栽，行距1.2 m，株距0.6 m，移栽后垄高20 cm，每行种植25株，每个处理4行，每处理共种植100株。
样品采集：于团棵期、旺长期、采烤期按5点取样法选取烟株，采用抖根法采集根际土壤，去除土样中的杂物、细根后混匀放入自封袋中，混匀的土样分2份，一份自然风干保存，一份在−80 ℃冰箱内保存，用于土壤酚酸类物质及土壤微生物的测定。
1.3 HPLC检测
1.3.1 仪器和试剂
Waters2695高效液相色谱仪，Waters2487可变波长检测器（美国Waters公司）；Empower色谱数据工作站；高纯水制备仪（MilliQ，Millipore）。
阔马酸（批号：U4CGB-MC）、对羟基苯甲酸（批号：CB27）、香草酸（批号：DM29）、丁香酸（批号：CL28），购于上海笛柏化学品技术有限公司；4-香豆酸（批号：C10067978）、阿魏酸（批号：1709277）购于上海延拓生物科技有限公司。各标准品纯度均大于98%。流动相使用的甲醇为色谱醇，液相色谱用水为高纯水，所有流动相均过0.22 μm微孔滤膜。
1.3.2 溶液配制
分别精密称定标准品阔马酸0.010 2 g，对羟基苯甲酸0.010 1 g，香草酸0.010 2 g，丁香酸0.010 2 g，4-香豆酸0.010 2 g，阿魏酸0.010 2 g，置于100 mL容量瓶中，用99.9%的色谱级甲醇精确定容到100 mL，配制为100 mg·kg-1 的混合标液，4℃避光保存，待用。
1.3.3 样品处理
供试烤烟根际土壤风干，除去须根等杂物，过40目筛，称取50 g置于250 mL具塞三角瓶中，加入150 mL 2 mol·L−1NaOH，120 rmin−1振荡提取3 h，静置3 h，用滤纸过滤。取上清液用5 mol·L−l HCl调至pH为2.5。然后用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，45℃蒸干，残渣用5 mL色谱纯甲醇溶解，4℃避光保存。过0.22 μm滤膜，待测[17]。
1.3.4 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国WATERS公司）；流动相A：0.3%乙酸水溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱：0 min，流动相A 95%，B 5%；1 min，流动相A 80%，B 20%；5 min，流动相A 70%，B 30%；7.5 min，流动相A 20%，B 80%；10 min，流动相A 95%，B 5%；流速为0.3 mL·min−1；柱温35℃；进样量10 μL。每个样品分析结束后，进样延迟1 min，去除干扰成分的影响，保证分析结果的稳定性和重复性。
1.3.5 线性关系考察
取1.3.2中6种酚酸混合对照品溶液，分别配制为5、10、30、50、80、100 mg·kg−1标准品溶液，过0.22 μm滤膜后10 μL进样。以对照品的含量（μg）为横坐标，以峰面积为纵坐标，求得回归方程（表1）。
表 1 6种酚酸类对照品的线性关系Table 1. Linear relationships between 6 phenolic acids and their reference standards酚酸类物质 Phenolic acids 线性方程 Linear equation R2 阔马酸 Caramelic acid Y=7.23×105X+2.19×104 0.999 6 对羟基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid Y=7.68×106X 1.000 0 香草酸 Vanillic acid Y=3.86×106X 1.000 0 丁香酸 Syringic acid Y=1.33×106X 1.000 0 4-香豆酸 4-Coumaric acid Y=9.51×105X+5.25×103 0.999 2 阿魏酸 Ferulic acid Y=1.49×106X 1.000 0 肉桂酸 Cinnamic acid Y=1.19×108X−2.41×105 0.999 3 1.4 土壤微生物多样性的测定
1.4.1 基因组DNA的提取和PCR扩增
参照PowerSoil® DNA土壤基因组DNA提取试剂盒的步骤提取各根际土壤样品DNA，然后利用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的纯度和浓度，用无菌水稀释至1 ng·μL−1。使用带标签序列（Barcode）的ITS2区及16SrDNAV3-V4区特异引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）、ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）和338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和高效高保真酶进行PCR。用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，用AxyPrepDNA试剂盒进一步纯化回收后，送上海美吉生物医药科技有限公司进行MiSeq测序。
1.4.2 下机数据的质控与分析
剔除标签序列（Barcode）和引物序列，用FLASH[18]软件进行序列拼接；通过Usearch软件（Version 7.0）过滤得到序列后去除嵌合体序列，得到有效序列；用Uparse[19]软件（Version 7.1）在97%的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用RDP classifier软件[20]和SILVA[21]数据库进行物种注释，利用Mothur软件（version v.1.30.1）作稀释度曲线，计算文库覆盖率（Coverage），Shannon、Simpson、ACE及Chao1指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价。
1.5 数据处理
采用Excel软件进行数据处理；采用SPSS 17.0数据处理系统进行统计分析。
2. 结果与分析
2.1 烤烟根际土壤中酚酸类物质的动态变化
不同施肥处理后烤烟各生育时期根际土壤中均检测出6种酚酸类物质，分别为对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸、肉桂酸（表2）。除肉桂酸变化不明显外，烤烟不同生育时期不同处理下5种酚酸类物质的含量有差异。团棵期各酚酸物质含量最低，不同施肥处理下各酚酸物质含量差异不显著。旺长期，对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸均表现出富集效应，含量较团棵期明显增加，但以上5种酚酸物质的含量表现为生物炭处理低于常规施肥处理。采烤期，各酚酸物质含量较旺长期有所下降，但生物炭处理的以上5种酚酸物质含量较常规施肥处理分别下降了48.89%、77.42%、48.09%、36.75%、49.02%，差异达显著水平（P＜0.05）。就总量而言，烤烟根际土壤中酚酸物质的总量在整个生育期呈现出先增加后减少的趋势，生物炭处理后酚酸物质的总量在团棵期、旺长期和采烤期较常规施肥处理分别降低了1.86%、11.36%和40.44%。以上结果表明，生物炭能在一定程度上降低烤烟根际土壤中酚酸物质的含量，减少化感自毒作用。
表 2 不同施肥处理后烤烟各生育时期根际土壤中酚酸类物质的含量变化Table 2. Changes of phenolic acids in rhizosphere soil at tobacco growth stages after fertilization treatments生长时期
Growth period处理
Treatment酚酸类物质种类 Species of phenolic acid /(μg·g−1) 阔马酸
Caramelic acid对羟基苯甲酸
p-hydroxybenzoic acid香草酸
Vanillic acid丁香酸
Syringic acid4-香豆酸
4-Coumaric acid阿魏酸
Ferulic acid肉桂酸
Cinnamic acid总量
Total amount团棵期
Resettling stageT1 - 0.82±0.035 d 0.24±0.036 c 1.00±0.058 d 6.99±0.151 d 0.25±0.045 d 0.39±0.055 a 9.69±0.275 d T2 - 0.81±0.005 d 0.29±0.012 b 0.87±0.023 e 6.91±0.015 d 0.23±0.006 d 0.40±0.015 a 9.52±0.032 d 旺长期
Vigorous growing stageT1 - 1.2±0.072 a 0.47±0.032 a 1.57±0.025 a 12.15±0.086 a 0.45±0.049 c 0.36±0.047 a 16.21±0.206 a T2 - 0.97±0.031 b 0.45±0.029 a 1.38±0.026 b 10.86±0.070 b 0.36±0.047 c 0.34±0.049 a 14.36±0.147 c 采烤期
Harvesting stageT1 - 0.90±0.006 c 0.31±0.021 b 1.31±0.021 c 9.96±0.066 c 2.55±0.079 a 0.35±0.038 a 15.38±0.026 b T2 - 0.46±0.030 e 0.07±0.006 d 0.68±0.057 f 6.30±0.025 e 1.3±0.035 b 0.35±0.015 a 9.16±0.083 e 注：T1为常规施肥处理，T2为生物炭处理；“-”表示该类物质未被检出；同列数字后不同字母表示差异显著 (P＜0.05)。
Note: T1 is conventional fertilization; T2, fertilization with added biochar; “-” indicates substance not detected; data with different letters indicate significant difference between treatments at P＜0.05.2.2 烤烟根际土壤微生物群落变化特征
2.2.1 细菌、真菌的OTU丰度和Alpha多样性
覆盖率（Coverage）是指样本中序列被检测出的概率，其值越高，代表本次测序结果越符合样本中微生物的实际情况。在本试验中，各处理的覆盖率为97.75%～99.77%（表3～4），表明测序读长足以进行此项分析。由表3～4可知，施用生物炭对烤烟根际土壤微生物群落的丰富度和多样性均有影响。各生育期，烤烟根际土壤细菌OTU丰度均表现为生物炭处理＞常规施肥处理，且旺长期生物炭处理的OTU丰度是常规施肥处理的1.23倍。真菌的OTU丰度在团棵期表现为生物炭处理＜常规施肥处理，但从旺长期开始真菌OTU丰度增加明显，旺长期、采烤期生物炭处理的OTU丰度分别是常规施肥处理的1.07倍和1.45倍。
表 3 细菌OTU丰度和Alpha多样性Table 3. Bacteria OTU abundance and alpha diversity index生长时期
Growth period处理
Treatment原始序列数
Raw number有效序列数
Effective numberOTU丰度
OTU abundanceAlpha多样性 Alpha diversity 覆盖度
Coverage/%Shannon Simpson ACE Chao1 团棵期 Resettling stage T1 40 641 34 217 2 396 6.10 0.006 2 2 290.60 2 333.31 98.62 T2 47 715 38 864 2 494 5.94 0.008 0 2 343.31 2 336.02 98.77 旺长期 Vigorous growing stage T1 39 969 31 587 2 258 5.09 0.036 2 2 219.44 2 231.73 98.29 T2 42 595 32 361 2 782 5.72 0.019 0 2 729.95 2 740.30 98.01 采烤期 Harvesting stage T1 38 873 29 074 2 651 6.19 0.005 9 2 504.00 2 532.72 98.09 T2 34 332 25 847 2 655 6.21 0.006 4 2 564.08 2 564.33 97.75 注：T1为常规施肥处理，T2为生物炭处理，表4同。
Note: T1 is conventional fertilization; T2, fertilization with added biochar. Same for Table 4.表 4 真菌OTU丰度和Alpha多样性Table 4. Fungi OTU abundance and alpha diversity index生长时期
Growth period处理
Treatment原始序列数
Raw number有效序列数
Effective numberOTU丰度
OTU abundanceAlpha多样性 Alpha diversity 覆盖度Coverage/% Shannon Simpson ACE Chao1 团棵期 Resettling stage T1 63 560 62 976 1 243 3.56 0.100 4 838.31 826.40 99.77 T2 67 763 66 909 1 111 3.32 0.088 5 804.76 797.89 99.75 旺长期 Vigorous growing stage T1 56 003 54 716 1 649 3.82 0.056 6 1 325.78 1 314.58 99.41 T2 69 341 67 164 1 771 4.07 0.045 6 1 414.15 1 412.23 99.51 采烤期 Harvesting stage T1 62 965 62 697 808 1.64 0.488 1 846.60 710.98 99.71 T2 65 160 64 659 1 171 2.59 0.275 9 919.37 898.43 99.68 Alpha多样性分析结果表明（表3～4），团棵期生物炭处理烤烟根际土壤细菌和真菌的多样性和丰富度均低于常规施肥处理，但随着生物炭在土壤中定植，旺长期生物炭对土壤微生物群落的丰富度和多样性提升明显。旺长期生物炭处理的细菌Shannon、ACE和Chao1指数较常规施肥处理分别增加了12.43%、23.0%和23.0%；真菌Shannon、ACE和Chao1指数增加了6.54%、6.67%和7.43%。采烤期，生物炭处理的细菌Shannon、ACE和Chao1指数较常规施肥处理分别增加了0.32%、2.40%和1.25%；真菌Shannon、ACE和Chao1指数增加了57.93%、8.60%和26.37%。由此可见，生物炭的施用能明显提升烤烟根际土壤中微生物的多样性和丰富度，但生物炭在土壤中定植至发挥作用需要一定的时间。
2.2.2 细菌群落种类组成及门水平相对丰度
各处理烤烟根际土壤样品中细菌在门（Phylum）分类水平上物种相对丰度堆积柱形图如图1所示。由图1可知，不同处理不同生育期烤烟根际土壤细菌区系在门水平上的组成相似，主要由变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、绿弯菌门Chloroflexi、酸杆菌门Acidobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、Patescibacteria、破壁菌门Firmicutes和WPS-2组成。进一步分析处理间差异表明，生物炭对部分细菌群落的相对丰度有影响。团棵期，生物炭处理（T2）较常规施肥处理（T1）变形菌门的相对丰度增加了50.66%；绿弯菌门和酸杆菌门相对丰度分别减少了25.06%和33.06%。旺长期，T2处理与T1处理相比放线菌门、拟杆菌门相对丰度分别减少了17.24%和38.63%；而绿弯菌门、酸杆菌门、Patescibacteria和破壁菌门相对丰度却分别增加了38.04%、85.19%、27.25%和114.14%。采烤期，T2处理较T1处理变形菌门、拟杆菌门、Patescibacteria的相对丰度分别减少了15.63%、22.30%和45.07%；而放线菌门、绿弯菌门和酸杆菌门的相对丰度分别增加了19.08%、24.43%和35.67%。
2.2.3 真菌群落种类组成及门水平相对丰度
各处理烤烟根际土壤样品中真菌在门（Phylum）分类水平上物种相对丰度堆积柱形图如图2所示。由图2可知，不同处理不同生育期烤烟根际土壤真菌区系在门水平上主要由子囊菌门Ascomycota、被孢霉门Mortierellomycota和担子菌门Basidiomycota组成。但不同处理不同生育期土壤真菌群落相对丰度差异明显，团棵期和旺长期2个处理烤烟根际土壤真菌优势种群均为子囊菌门，采烤期则为被孢霉门。各生育期，生物炭处理（T2）的子囊菌门相对丰度较常规施肥处理（T1）的分别增加了42.07%、14.83%和63.90%；团棵期和旺长期，T2处理担子菌门相对丰度较T1处理分别降低了50.98%和41.47%；团棵期和采烤期，T2处理被孢霉门相对丰度较T1处理分别降低了42.22%和28.00%。
3. 讨论与结论
3.1 生物炭对烤烟根际土壤中酚酸类物质的影响
前人通过对不同连作年限植烟土壤中各酚酸类物质含量变化情况进行研究，发现长期连作会导致植烟土壤酚酸物质的积累[22]，并进一步证明了这些自毒物质对土壤微生物特别是病原微生物的选择性促进，以及由此导致的土壤微生态系统失衡，是烟草连作障碍产生的主要原因[23]。有研究指出通过施用土壤改良剂缓解化感自毒作用，恢复并重建健康的根际生态系统，是克服连作障碍的有效途径[24]。生物炭作为一种土壤改良剂，在克服连作障碍方面有很大的优势。本研究以连作植烟土壤为对象，研究了施用生物炭后植烟土壤中酚酸类物质的变化情况，研究发现生物炭对烤烟根际土壤酚酸类物质的分泌有影响，烤烟根际土壤中对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸、4-香豆酸、阿魏酸的含量在各生育期均表现为常规施肥处理＞生物炭处理；且随着生物炭在土壤中定植，能明显降低烤烟根际土壤中酚酸物质的含量，酚酸物质的总量在团棵期、旺长期和采烤期较常规施肥处理分别降低了1.86%、11.36%和40.44%。
前人在生物炭对苹果实生苗[15]及芦笋[16]在连作土壤中生长的影响研究表明，在连作土壤中添加生物炭可明显降低土壤中酚酸类物质含量，有利于缓解化感自毒引起的苹果和芦笋连作障碍现象。本研究结论与之一致，施用生物炭亦能在一定程度上降低连作植烟土壤中酚酸物质的含量。有研究指出，常规复合肥+农家肥最有利于减轻烟草土壤的自毒作用，而常规复合肥+有机肥次之，单施常规复合肥最差[25]，本研究也发现各生育时期烤烟根际土壤中酚酸类物质的含量均表现为常规复合肥＞常规复合肥+生物炭，说明生物炭对缓解烟草的化感自毒也有一定的作用。
3.2 生物炭对烤烟根际土壤微生物区系的影响
除能缓解酚酸类物质引起的化感自毒作用外，有研究指出生物炭对土传病害也有一定的防控作用[26]，因为生物炭的多孔性和巨大的比表面积能为土壤微生物的生存繁殖提供较好的栖息地，同时，生物炭还能提供大量C源，有利于促进土壤中有益微生物的生长，而抑制病原菌的生长，形成利于植物生长而不利于病原菌生长的健康土壤环境[25,27]。本研究亦发现施用生物炭不仅能明显提升烤烟根际土壤中细菌、真菌的OTU丰度，还能明显提升细菌和真菌群落的多样性和丰富度，避免了某一单一优势菌种的大量繁殖，有利于优化烤烟根际土壤微生物的群落结构，增加土壤微生物群落分布的均匀程度。
土壤微生物是土壤中最活跃的生物体，对环境变化敏感，能够较早指示土壤微生态系统功能的变化，从而为评判土壤性质的变化提供可靠的依据[23]。本研究中生物炭对烤烟根际土壤微生物的调节作用说明，生物炭对优化植烟土壤中微生物群落结构有一定的作用，有利于营造健康的土壤微生物区系，维持土壤微生态平衡。
研究表明，生物炭具有密度低、弱碱性、C/N比较高、吸附力强等特点，对连作土壤的改良具有积极作用[28]，但前人研究多局限于生物炭对土壤理化性质的改良及对作物生长的促进作用。生物炭对连作植烟土壤酚酸类物质及微生物区系的影响研究表表明，生物炭能明显降低连作植烟土壤中酚酸类物质的含量，减少酚酸物质的化感自毒作用，同时提升植烟土壤中细菌、真菌的OTU丰度及多样性和丰富度指数，优化根际土壤微生物群落结构，创造有利于作物生长的根际微生态环境，从而促进烤烟的生长，提升烤烟的产量和质量。说明生物炭对植烟土壤有一定的改良与提质效应，对化感自毒引起的烟草连作障碍有较明显的缓解作用，但其作用机理还有待进一步研究。
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表 1 6种酚酸类对照品的线性关系
Table 1 Linear relationships between 6 phenolic acids and their reference standards
酚酸类物质 Phenolic acids 线性方程 Linear equation R2 阔马酸 Caramelic acid Y=7.23×105X+2.19×104 0.999 6 对羟基苯甲酸 p-hydroxybenzoic acid Y=7.68×106X 1.000 0 香草酸 Vanillic acid Y=3.86×106X 1.000 0 丁香酸 Syringic acid Y=1.33×106X 1.000 0 4-香豆酸 4-Coumaric acid Y=9.51×105X+5.25×103 0.999 2 阿魏酸 Ferulic acid Y=1.49×106X 1.000 0 肉桂酸 Cinnamic acid Y=1.19×108X−2.41×105 0.999 3 
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表 2 不同施肥处理后烤烟各生育时期根际土壤中酚酸类物质的含量变化
Table 2 Changes of phenolic acids in rhizosphere soil at tobacco growth stages after fertilization treatments
生长时期
Growth period处理
Treatment酚酸类物质种类 Species of phenolic acid /(μg·g−1) 阔马酸
Caramelic acid对羟基苯甲酸
p-hydroxybenzoic acid香草酸
Vanillic acid丁香酸
Syringic acid4-香豆酸
4-Coumaric acid阿魏酸
Ferulic acid肉桂酸
Cinnamic acid总量
Total amount团棵期
Resettling stageT1 - 0.82±0.035 d 0.24±0.036 c 1.00±0.058 d 6.99±0.151 d 0.25±0.045 d 0.39±0.055 a 9.69±0.275 d T2 - 0.81±0.005 d 0.29±0.012 b 0.87±0.023 e 6.91±0.015 d 0.23±0.006 d 0.40±0.015 a 9.52±0.032 d 旺长期
Vigorous growing stageT1 - 1.2±0.072 a 0.47±0.032 a 1.57±0.025 a 12.15±0.086 a 0.45±0.049 c 0.36±0.047 a 16.21±0.206 a T2 - 0.97±0.031 b 0.45±0.029 a 1.38±0.026 b 10.86±0.070 b 0.36±0.047 c 0.34±0.049 a 14.36±0.147 c 采烤期
Harvesting stageT1 - 0.90±0.006 c 0.31±0.021 b 1.31±0.021 c 9.96±0.066 c 2.55±0.079 a 0.35±0.038 a 15.38±0.026 b T2 - 0.46±0.030 e 0.07±0.006 d 0.68±0.057 f 6.30±0.025 e 1.3±0.035 b 0.35±0.015 a 9.16±0.083 e 注：T1为常规施肥处理，T2为生物炭处理；“-”表示该类物质未被检出；同列数字后不同字母表示差异显著 (P＜0.05)。
Note: T1 is conventional fertilization; T2, fertilization with added biochar; “-” indicates substance not detected; data with different letters indicate significant difference between treatments at P＜0.05.
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表 3 细菌OTU丰度和Alpha多样性
Table 3 Bacteria OTU abundance and alpha diversity index
生长时期
Growth period处理
Treatment原始序列数
Raw number有效序列数
Effective numberOTU丰度
OTU abundanceAlpha多样性 Alpha diversity 覆盖度
Coverage/%Shannon Simpson ACE Chao1 团棵期 Resettling stage T1 40 641 34 217 2 396 6.10 0.006 2 2 290.60 2 333.31 98.62 T2 47 715 38 864 2 494 5.94 0.008 0 2 343.31 2 336.02 98.77 旺长期 Vigorous growing stage T1 39 969 31 587 2 258 5.09 0.036 2 2 219.44 2 231.73 98.29 T2 42 595 32 361 2 782 5.72 0.019 0 2 729.95 2 740.30 98.01 采烤期 Harvesting stage T1 38 873 29 074 2 651 6.19 0.005 9 2 504.00 2 532.72 98.09 T2 34 332 25 847 2 655 6.21 0.006 4 2 564.08 2 564.33 97.75 注：T1为常规施肥处理，T2为生物炭处理，表4同。
Note: T1 is conventional fertilization; T2, fertilization with added biochar. Same for Table 4.
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表 4 真菌OTU丰度和Alpha多样性
Table 4 Fungi OTU abundance and alpha diversity index
生长时期
Growth period处理
Treatment原始序列数
Raw number有效序列数
Effective numberOTU丰度
OTU abundanceAlpha多样性 Alpha diversity 覆盖度Coverage/% Shannon Simpson ACE Chao1 团棵期 Resettling stage T1 63 560 62 976 1 243 3.56 0.100 4 838.31 826.40 99.77 T2 67 763 66 909 1 111 3.32 0.088 5 804.76 797.89 99.75 旺长期 Vigorous growing stage T1 56 003 54 716 1 649 3.82 0.056 6 1 325.78 1 314.58 99.41 T2 69 341 67 164 1 771 4.07 0.045 6 1 414.15 1 412.23 99.51 采烤期 Harvesting stage T1 62 965 62 697 808 1.64 0.488 1 846.60 710.98 99.71 T2 65 160 64 659 1 171 2.59 0.275 9 919.37 898.43 99.68
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