Comparison of ORFV011 Genes of Orf virus Vaccine strain and ORFV-PN Strain
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摘要:目的 比较分析羊口疮病毒疫苗株与ORFV-PN株ORFV011基因的分子特点、编码蛋白的生物学功能差异，为福建省羊口疮的科学防控提供理论指导。方法 对羊口疮疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因进行克隆和测序，运用生物信息学相关软件比较分析两者测序结果的差异。结果 测序结果显示，疫苗株和ORFV-PN株ORFV011基因均由1 137个核苷酸组成，编码378个氨基酸。核苷酸序列和氨基酸序列相似性比较显示，ORFV-PN与疫苗株和弱毒株D1701株ORFV011基因核苷酸序列相似性分别为98.6%和98.4%，氨基酸序列相似性均为98.7%。与疫苗株相比，ORFV-PN株共有16处核苷酸变异和5处氨基酸变异。在蛋白二级结构上，ORFV-PN株和疫苗株α-螺旋占比分别为34.13%（129/378）和30.42%（115/378），β-转角占比分别为6.08%（23/378）和6.88%（26/378），无规则卷曲占比分别为37.30%（141/378）和39.15%（148/378），β-折叠占比分别为22.49%（85/378）和23.54%（89/378）。蛋白三级结构上，ORFV-PN株预测的三维结构与疫苗株的三维结构在α-螺旋和无规则卷曲上有一定的差异。结论 福建省羊口疮病毒ORFV011基因出现变异，应当引起广大兽医工作者的重视，有关部门应当加强对羊口疮的监测。Abstract:Objective To provide theoretical basis for prevention and control of Orf in Fujian, the molecular characteristics and biological functions of ORFV011 genes of the vaccine strain and ORFV-PN strain were compared.Methods ORFV011 genes from the two strains were cloned and sequenced for comparison and analysis using bioinformatics software.Results The sequencing results indicated that both genes composed of 1 137 nucleotides coding 378 amino acids. The nucleotide sequence similarity of ORFV011 of the ORFV-PN strain was 98.6% with that of the vaccine strain, while 98.4% with that of the lentogen strain D1701. The amino acid sequence similarity of ORFV011 of the ORFV-PN strain with either the vaccine strain or the D1701 strain was the same at 98.7%. There were 16 nucleotide mutations and 5 amino acid variations in the gene of the ORFV-PN strain as compared to that of the vaccine strain. On the secondary structure, the encoded protein by ORFV011 gene of the ORFV-PN strain and the vaccine strain had 34.13% (or 129/378) and 30.42% (or 115/378) alpha helixes, respectively; 6.08% (or 23/378) and 6.88% (or 26/378) beta turns, respectively; 37.3% (or 141/378) and 39.15% (or 148/378) random coils, respectively; and, 22.49% (or 85/378) and 23.54% (or 89/378) extended strands, respectively. The predicted three-dimensional structure of ORFV011 of the ORFV-PN strain showed differences on the alpha helixes and random coils as compared with that of the vaccine strain.Conclusion It appeared that ORFV011 of the ORFV-PN strain deviated from that of the vaccine strain in sequence as well as secondary and three-dimensional structures. Thus, special attention must be placed in monitoring and controlling the Orf.
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Keywords:
- Orf virus /
- vaccine strain /
- ORFV-PN strain /
- ORFV011 gene
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0. 引言
【研究意义】褐苞薯蓣（Dioscorea persimilis Prain et Burkill）为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea L.）植物，广泛分布于我国南方各地，适应性强，产量大，是山药市场的重要组成部分，在广西、福建、海南等地被用作山药地区习用品[1]，并被福建省、广东省、广西省地方药材标准收载[2-4]。褐苞薯蓣块茎富含蛋白质、氨基酸、淀粉、粗多糖、尿囊素等成分，具有健脾养胃、生津益肺、补肾涩精等功效[5]，可鲜食、药用，又可加工成各类保健食品。采收期对褐苞薯蓣的营养和药用价值有直接影响，研究褐苞薯蓣不同采收期的品质变化，并根据品质变化调整销售方式，对其产品的品质提升具有重要意义。【前人研究进展】适宜采收期需综合考虑有效成分、产量的动态积累及市场需求状况，目前关于山药采收期的研究主要集中于薯蓣(Dioscorea opposita Thunb.) [6,7]，参薯(Dioscorea alata L.) [8]和山薯(Dioscorea fordii Prain et Burkill) [9]，鲜有对褐苞薯蓣采收期的研究报道，且主要是对块茎发育过程的物质积累变化研究[8,10-12]，对地上部枯萎后块茎就地贮藏期间的成分变化研究较少。评价指标主要为生物量、折干率、多糖、淀粉、可溶性糖、蛋白质、尿囊素等，对氨基酸变化的研究较少[13]。【本研究切入点】一般认为，山药的采收期为地上部茎叶枯萎后，但产地调查发现，由于福建冬季大部分地区的土温在0 ℃以上且雨水较少，多数种植区的褐苞薯蓣块茎可留在地里过冬，实际采收期受市场行情影响较大，可从块茎生物量积累基本完成至翌年3—4月份，采收期为半年左右，期间的营养成分变化尚无研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以福建宁化地区的特色褐苞薯蓣地方品种为材料，探究从10月下旬到翌年5月上旬块茎的折干率、蛋白质、淀粉、氨基酸、可溶性糖、蔗糖、总酚、多糖、尿囊素含量的变化规律，根据品质变化及生产实际情况确定最适采收期及销售方式，旨在提高褐苞薯蓣类山药品质，保证营养价值，为褐苞薯蓣的规范化种植及采收加工提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
以宁化当地的特色褐苞薯蓣地方品种为材料，种植于三明市宁化县三黄村（E116°58′29.42″，N26°05′11.39″），该地区属于中亚热带山地气候，年平均气温15～18 ℃，夏无酷暑，冬无严寒，春季长达4个月，无霜期214～248 d，年平均降水量1700～1800 mm，土壤为沙壤土。采用随机区组种植，按当地常规进行田间管理，2020年4月上旬种植，10月下旬块茎生物量积累基本完成，11月上旬地上部茎叶开始转黄，12月初地上部茎叶基本枯萎，翌年4月初块茎刚开始发芽，5月初块茎长出新生嫩茎。分别于2020年10月20日、11月10日、12月5日、12月30日和2021年1月25日、2月20日、3月15日、4月10日、5月5日每隔25 d从试验田每次随机采收块茎30个， 9批次共采收块茎270个。取块茎中部10 cm洗净去皮切片60 ℃烘干，测定折干率，粉碎过40目筛后4 ℃低温密封保存，用于可溶性糖、蔗糖、粗多糖、淀粉、蛋白质、尿囊素、总酚、氨基酸等含量测定。
试剂采用的磷酸二氢钾、磷酸、无水乙醇、葡萄糖、浓硫酸、高氯酸等均为国产分析纯，尿囊素对照品购自中国药品生物制品检定研究所（111501-200202）。
1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪（美国Agilent公司），BSA224S-CW电子分析天平（德国Sartorius公司）， UV-1780分光光度计（日本SHIMADZU公司），LHH-2数显恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司），KQ-400DE数控超声波清洗仪（江苏昆山超声仪器有限公司）， H-2050R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），JSP-200 高速多功能粉碎机（浙江省永康市金穗机械制造），电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.3 试验方法
1.3.1 测定指标和方法
折干率Drying rate(DR)测定为取块茎中部10 cm洗净去皮切成5mm厚片，称量鲜重， 60 ℃烘干后称量干重。计算公式：折干率%=干重/鲜重×100%；可溶性糖Soluble sugar（SS）含量参考王学奎[14]的方法测定；蔗糖含量参考薛应龙 [15]的方法测定；粗多糖Crude polysaccharide（CP）含量参考华树妹等[16]的方法测定；淀粉含量参考曹建康等[17]的方法测定；蛋白质含量根据《食品中蛋白质的测定（凯氏定氮法）》（GB 5009.5—2010）的方法测定；尿囊素含量参照黄瑞平[18]的方法测定；总酚Total phenol(TP)含量采用南京建成生物工程研究所的植物总酚测试盒（比色法）测定；氨基酸含量根据《食品中氨基酸的测定》（GB/T 5009.124—2016）的方法测定并计算总氨基酸Total amino acids（TAA）、必需氨基酸Essential amino acid（EAA）和呈味氨基酸Flavored amino acid（FAA）含量，每个指标生物学重复测定3次。
1.3.2 数据处理
采用Excel 2010 软件进行数据整理，计算平均值、标准差，应用SPSS 19.0软件进行多重比较和双变量相关性分析，相关性采用Pearson相关系数表示。
2. 结果与分析
2.1 主要品质变化趋势分析
2.1.1 折干率含量变化
块茎的折干率含量为（32.80±0.41）%～(39.70±1.10)%，呈升-降-升-降的波动态势(图1-A)。可能原因是，10月20日至11月10日块茎处于生长末期，成分继续积累，茎叶维持蒸腾作用，折干率上升；11月10日至12月5日茎叶发黄枯萎，成分积累下降，蒸腾作用减少，折干率下降；12月5日至翌年2月20日块茎处于休眠状态，随着在地下保存时间的延长，水分逐渐消耗，且此阶段雨水较少，折干率上升；翌年2月20日至5月5日随着气温升高，雨水增加，块茎逐渐解除休眠，长出新的根毛吸收水分，折干率下降。根据变化趋势，11月10日左右以及12月底至翌年3月初的块茎的折干率高于36%，其中翌年1月25日至2月20日块茎的折干率高达39%左右，在此期间采收块茎韧性不足，极易造成折断，折断块茎可用于烘干加工，且能耗更小，但块茎折断后必须马上处理，否则极易腐烂；10月20日前、12月5日左右及翌年3月15日后采收折干率相对较低，采收更不易折断。
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图 1 不同采收日期块茎品质变化趋势注：图中不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Figure 1. Tuber quality at time of harvestingNote: Data with different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05).2.1.2 可溶性糖、蔗糖含量变化
块茎的可溶性糖含量为（1.43±0.04）%～（10.60±0.37）%、蔗糖含量为（0.79±0.03）%～（5.29±0.19）%，且在10月20日至1月25日含量接近，表明在此期间块茎内的主要可溶性糖是蔗糖，二者的变化趋势均为先快速下降，再小幅波动，再快速上升（图1-B、C）。可能原因是，10月20日至12月5日为植株生长末期，随着茎叶的衰老，光合能力逐渐减弱，蔗糖作为光合作用的主要产物向块茎的运输减少，且不断转化为淀粉； 12月5日至翌年2月20日地上部完全枯萎，新的同化产物不再合成，块茎休眠期代谢减弱，碳水化合物仅进行少量转化；2月20日至5月5日块茎逐渐解除休眠，贮藏的碳水化合物重新转化为蔗糖等可溶性糖，为萌发提供能量。可溶性糖具有甜味，对鲜食口感有重要影响，10月20日采收的块茎可溶性糖、蔗糖含量分别可达5.69%、5.29%，4月10日至5月5日则分别可达4.01%～10.60%、1.39%～4.39%，口感较其他采收期更甜。
2.1.3 粗多糖含量变化
块茎的粗多糖含量为（0.89±0.03）%～（2.98±0.04）%，变化趋势为10月20日至12月30日下降，12月30日至翌年4月10日上升，4月10日至5月5日下降（图1-D）。由于植物多糖及糖复合物参与了细胞的各种生命现象的调节及结构物质的组成，因此多糖的变化受到环境变化、生长状态变化等影响，有待进一步研究。山药粗多糖具有增强免疫、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、解酒[19,20]等多种药理作用，是被公认的重要活性物质之一，若以多糖含量为采收标准，则10月20日至11月10日及翌年2月20至4月10日的含量较高，分别为1.72%～2.73%及2.40%～2.98%，较适合采收。
2.1.4 淀粉含量变化
块茎的淀粉含量为（70.92±1.50）%～（78.39±1.64）%，变化趋势为先上升再下降（图1-E）。可能原因是10月20日至12月5日地上部茎叶仍有光合能力，同化产物运输到块茎部位以淀粉的形式贮藏；12月5日至翌年5月5日地上部枯萎，淀粉不再合成，块茎原先贮藏的淀粉不断分解用于维持休眠及解除休眠后块茎生长的养分供应。淀粉是山药块茎干物质中的最主要成分，其中的抗性淀粉含量高，消化性差[21]，可作为糖尿病，肥胖患者的饮食原料又有促进排泄、改善肠道菌群环境等作用[22]，若以淀粉含量为采收标准，则11月10日～翌年4月10日的较适合采收，含量为73.14%～78.12%。
2.1.5 蛋白质、尿囊素含量变化
块茎的蛋白质含量为（5.06±0.15）%～（6.51±0.25）%、尿囊素含量为（2.84±0.01）～（4.29±0.17）mg·g−1，二者均呈升-降-升-降的变化趋势（图1-F、G）。可能原因是，10月20日至12月5日块茎仍处于生长阶段，蛋白质及含氮生物碱类物质尿囊素继续形成和积累； 12月5日至翌年2月20日块茎处于休眠期，蛋白质和尿囊素消耗或转化为其他物质； 翌年2月20日至5月5日块茎逐渐解除休眠恢复生长，贮藏的其他物质转化为蛋白质等含氮物质供应植株生长。蛋白质是人体必需的营养物质；尿囊素具有促进细胞生长、加快伤口愈合等生理功能，与山药传统上养胃的功效密切相关[23]，若以蛋白和尿囊素含量为采收标准，则12月5日左右及翌年3月15日至4月10日较适合采收，含量分别为6.33%～6.51%和3.95～4.29 mg·g−1。
2.1.6 总酚含量变化
块茎的总酚含量为（0.51±0.00）～（1.81±0.03）μg·g−1，变化趋势为10月20日至11月10日快速下降，11月10日至翌年4月10日小幅波动，翌年4月10日至5月5日快速上升（图1-H）。总酚含量越高越易导致褐变[24]，因此，11月10日前及翌年4月10日后采收，块茎较易褐变，不利于采后加工和储藏。
2.1.7 氨基酸含量变化
块茎富含17种氨基酸，包含6种必需氨基酸和4种呈甜味或鲜味的氨基酸。总氨基酸含量为40.6 ～50.8 mg·g−1，必需氨基酸含量为12.9 ～15.5 mg·g−1，呈味氨基酸含量为15.9 ～20.2 mg·g−1，3者均呈波动变化趋势(表1)。谷氨酸是山药中含量最高的氨基酸，也是所有呈味氨基酸中鲜味最强的氨基酸，不仅是一种重要的鲜味剂，同时具有预防治疗肝昏迷及保护肝脏的功能，甘氨酸有清香甜味，能有效降低苦味[25]，二者在3月15日后采收的含量较高。块茎总氨基酸、必需氨基酸在12月5日、翌年3月15日和4月10日采收时均表现出较高的含量，在10月20日、11月10日、12月30日及翌年2月20日采收的含量偏低，若综合考虑氨基酸的营养和口感，则12月5日左右、翌年3月15日至4月10日较适合采收。
表 1 不同采收日期块茎氨基酸变化趋势Table 1. Amino acids in tubers harvested in different time periods氨基酸
Amino acids不同采收日期（月-日）氨基酸含量
Amino acids content at ifferent collecting date/（mg·g−1）10-20 11-10 12-05 12-30 01-25 02-20 03-15 04-10 05-05 天冬氨酸# Aspartate 5.0 d 5.2 cd 6.3 a 5.5 bc 5.6 b 5.2 cd 6.4 a 6.4 a 4.3 f 苏氨酸* Threonine 1.6 b 1.6 b 1.8 a 1.6 b 1.9 a 1.6 b 1.9 a 1.9 a 1.8 a 丝氨酸 Serine 2.4 e 2.3 e 2.9 d 2.5 e 3.3 b 2.5 e 3.1 c 3.2 bc 4.1 a 谷氨酸# Glutamate 7.4 ef 6.9 f 8.4 c 8.0 cd 9.2 b 7.7 de 9.6 ab 9.3 ab 9.8 a 甘氨酸# Glycine 1.6 b 1.6 b 1.8 a 1.6 b 1.8 a 1.5 b 1.8 a 1.8 a 1.8 a 丙氨酸# Alanine 2.2 d 2.2 d 2.4 c 2.0 e 2.6 b 2.0 e 2.4 c 2.4 c 3.2 a 胱氨酸 Cystine 0.2 c 0.3 b 0.3 b 0.3 b 0.4 a 0.4 a 0.4 a 0.4 a 0.4 a 缬氨酸* Valine 2.0 de 1.9 e 2.3 ab 2.0 de 2.2 bc 2.0 de 2.4 a 2.4 a 2.1 cd 蛋氨酸 Methionine 0.2 b 0.3 a 0.3 a 0.1 c 0.2 b 0.2 b 0.2 b 0.3 a 0.2 c 异亮氨酸* Isoleucine 1.6 b 1.6 b 1.8 a 1.6 b 1.8 a 1.6 b 1.9 a 1.9 a 1.5 b 亮氨酸* Leucine 3.2 bc 3.1 c 3.6 a 3.2 bc 3.4 ab 3.1 c 3.6 a 3.6 a 3.0 c 酪氨酸 Tyrosine 1.2 d 1.2 d 1.3 c 1.3 c 1.6 a 1.1 e 1.4 b 1.2 d 1.4 b 苯丙氨酸* Phenylalanine 2.6 c 2.6 c 3.0 ab 2.7 c 2.9 b 2.7 c 3.1 a 3.0 ab 2.3 d 赖氨酸* Lysine 2.2 c 2.1 c 2.5 ab 2.2 c 2.4 b 2.2 c 2.6 a 2.6 a 2.5 ab 组氨酸 Histidine 1.1 c 1.0 d 1.2 b 1.1 c 1.1 c 1.0 d 1.2 b 1.3 a 1.2 b 精氨酸 Arginine 5.0 c 4.6 d 6.3 a 5.1 c 5.4 b 4.4 d 6.5 a 6.3 a 4.0 e 脯氨酸 Proline 2.2 ab 2.1 bc 2.3 a 2.1 bc 2.3 a 2.0 c 2.3 a 2.3 a 2.2 ab 总氨基酸 TAA 41.7 de 40.6 e 48.5 b 42.9 d 48.1 b 41.2 e 50.8 a 50.3 a 45.8 c 必需氨基酸 EAA 13.2 d 12.9 d 15 bc 13.3 d 14.6 c 13.2 d 15.5 ab 15.4 a 13.2 d 呈味氨基酸 FAA 16.2 f 15.9 f 18.9 c 17.1 d 19.2 bc 16.4 f 20.2 ab 19.9 a 19.1 c 注：*表示必需氨基酸；#表示呈味氨基酸，同行数据不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。
Note:*: EAA; #: FAA; data with different lowercase letters on same row indicate significant differences (P<0.05).2.2 主要品质指标相关性分析
对9个采收期的主要品质指标进行相关性分析(表2)。可以看出，折干率与蛋白质含量呈显著负相关（P<0.05）表明块茎水分减少的同时伴随着蛋白质的消耗。蔗糖含量与可溶性糖含量呈显著正相关（P<0.05），与淀粉含量呈显著负相关（P<0.05），表明蔗糖等可溶性糖与淀粉含量的此消彼长，也验证了光合产物“源”和贮藏物质 “库”之间的运输转化。总氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸三者含量呈极显著正相关（P<0.01），并同时与蛋白质含量呈显著相关（P<0.05）；尿囊素含量与蛋白质、必需氨基酸含量呈极显著正相关（P<0.01），与总氨基酸含量呈显著正相关（P<0.05），表明蛋白质、氨基酸、尿囊素三者的含量变化规律相似，可通过其中一种成分的测定来推断3种成分的变化趋势。总酚含量和蔗糖含量呈极显著相关（P<0.01），表明蔗糖含量较高时块茎的总酚含量也高，因此采收前、后期块茎口感较甜，适合鲜食，但不适于采收加工。
表 2 品质指标相关性分析Table 2. Correlations among quality indices指标
Index折干率
DR可溶性糖
SS蔗糖
Sucrose粗多糖
CP淀粉
Starch蛋白质
Protein总氨基酸
TAA必需氨基酸
EAA呈味氨基酸
FAA尿囊素
Allantoin可溶性糖 SS −0.605 蔗糖 Sucrose −0.485 0.781* 粗多糖 CP 0.073 −0.073 −0.089 淀粉 Starch 0.066 −0.644 −0.721* −0.003 蛋白质 Protein −0.687* 0.005 −0.174 0.364 0.508 总氨基酸 TAA −0.380 −0.050 −0.326 0.266 0.625 0.757* 必需氨基酸 EAA −0.210 −0.313 −0.481 0.434 0.694* 0.764* 0.943** 呈味氨基酸 FAA −0.415 0.104 −0.263 0.164 0.562 0.690* 0.975** 0.852** 尿囊素 Allantoin −0.427 −0.314 −0.481 0.353 0.635 0.913** 0.746* 0.834** 0.640 总酚 TP −0.281 0.683* 0.965** −0.029 −0.722* −0.317 −0.360 −0.481 −0.310 −0.596 注：*表示显著相关（P<0.05）， **表示极显著相关（P<0.01）。
Note: *: significant correlation (P<0.05); **: extremely significant correlation (P<0.01).3. 讨论与结论
福建山药栽培历史悠久，种质资源丰富，栽培面积达5000 hm2以上，是我国山药主要原产地和重要的生产基地之一[26]。李丽红等[27]收集的72份福建省不同地区代表性地方山药品种中，褐苞薯蓣占56%，张武君等[28]2018年收集的37份福建山药地方主栽品种中，褐苞薯蓣占调查总数的51%，表明褐苞薯蓣为省内主要的山药栽培类型。福建省地处亚热带，全省年均气温17～21 ℃，中南部低海拔地区冬季霜冻少，褐苞薯蓣块茎在生长结束后可就地贮藏，根据市场行情调整采收期，与北方山药错峰供应，现挖现卖，在保证营养品质的前提下新鲜上市，符合新鲜零添加的消费理念，采收期可达半年。
李丹等[6]以多糖和淀粉为采收标准，研究了怀山药成分动态变化，认为最佳采收期与传统采收期一致，为10月份以后；马蕊等[7]对不同生长期的怀山药（品种）和铁棍山药的折干率、浸出物、粗多糖、尿囊素、腺苷、淀粉等化学成分进行分析研究，认为2种山药适合12月中旬采收，怀山药若冬后采收，建议次年2月底前采收完毕；张培通等[8]分析了长江中下游地区参薯块茎发育动态特征，认为播种180 d之后，块茎仍有膨大趋势，但需要在霜冻风险到来前及时收获完毕；陈华龙等[9]以尿囊素为采收标准，研究了不同生长期的粤北产广山药成分动态变化，认为最适采收期为生长的第8～10个月。以上研究主要是针对薯蓣、参薯和山薯类山药，获得的最佳采收期往往是生物量达到最大时或最后的采收批次，由于气候条件及种植习惯等原因并未进行较长时间的就地贮藏，在块茎完成生长进入休眠到翌年恢复生长这一阶段的品质变化尚未有相关研究报道，因此对福建省褐苞薯蓣的采收不能起到较好的指导作用。
本研究根据测定的各品质指标变化趋势及相关性分析结果，结合植株整体的生长发育变化可以得出：宁化褐苞薯蓣块茎在10月20日（块茎生物量积累基本完成）至翌年4月10日（块茎刚开始发芽）期间均可根据市场需求和加工利用偏好进行采收。10月20日左右采收，块茎的可溶性糖、蔗糖含量较高，口感较佳且粗多糖含量较高，但总酚含量较高，较适合鲜食，若仅考虑鲜食口感、多糖成分，以及有提早上市的需求，可早于10月20日采收。12月5日左右（茎叶恰好完全枯萎）及翌年3月15日（块茎解除休眠）至4月10日采收，生物量积累完成、折干率相对较低，且淀粉、蛋白质、尿囊素、氨基酸含量均较高，其中3月15日至4月10日采收的多糖含量也较高，以上2个采收期即适合鲜食又适合加工。11月10日左右以及12月底至翌年3月初，折干率较高，采收易折断，但折断块茎可供烘干加工。4月10日至5月5日，块茎重新萌发成新的植株，总酚含量增加，营养及外观品质下降，且一般福建春季在清明（4月4日）左右开始种植，太迟采收影响下一茬种植，因此不适合就地贮藏到该阶段采收。
综合考虑产量、采收折断率、采后褐变、外观及营养品质及茬口安排，则宁化褐苞薯蓣块茎最适采收期为12月5日左右，即茎叶大部分枯萎到完全枯萎期间，以及翌年3月15日至4月10日块茎休眠解除至刚开始发芽期间。本研究得到的品质变化规律及所对应的植株长发育状态可作为褐苞薯蓣块茎采收及加工的参考依据，但具体的采收时间和品质变化时间由于受到种植时间、管理方式、种植生境及具体品种的影响，须根据实际情况进行调整。
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图 1 ORFV011基因的PCR扩增
注：M：2000 DNA Ladder；1：疫苗株DNA；2：ORFV-PN株DNA；3: 阴性对照。
Figure 1. PCR amplification of ORFV011 genes
Note: M:2000 DNA Ladder; 1: DNA of vaccine strain; 2:DNA of ORFV-PN strain; 3: negative control.
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图 2 ORFV011重组质粒双酶切鉴定结果
注：M：5000 DNA Ladder；1：疫苗株重组质粒；2：ORFV-PN株重组质粒。
Figure 2. Identification of ORFV011 recombination plasmid by restriction endonuclease digestion
Note： M: 5000 DNA Ladder; 1:the recombination plasmid of vaccine strain; 2: the recombination plasmid of ORFV-PN strain.
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图 4 疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白抗原位点预测
Figure 4. Predicted antigenic indices on ORFV011 in vaccine and ORFV-PN strains
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图 5 疫苗株（A）和ORFV-PN株（B）ORFV011蛋白结构域三维结构预测
Figure 5. Predicted 3D tertiary structures of ORFV011 in vaccine strain (A) and ORFV-PN strain (B)
表 1 ORFV参考毒株
Table 1 ORFV reference strains
毒株Virus 登录号GenBank 分离地Isolation site 时间Time NZ2 DQ184476 新西兰New Zealand 2005 OV-SA00 AY386364 美国USA 2003 OV-IA82 AY386363 美国USA 2003 D1701 HM133903 德国Germany 2010 NA1-11 KF234407 中国广东Guangdong, China 2013 Shanxi HQ202153 中国山西Shanxi, China 2010 Jilin KJ808074 中国吉林Jilin, China 2011 Guizhou KP994595 中国贵州Guizhou, China 2010 Xinjiang2 KF666565 中国新疆Xinjiang, China 2012 FJ-NP KC568369 中国福建Fujian, China 2013 FJ-GT KC568394 中国福建Fujian, China 2009 China vaccine JQ904789 中国甘肃Gansu, China 2012 
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表 2 疫苗株和ORFV-PN株ORFV011蛋白二级结构预测
Table 2 Predicted secondary structures of ORFV011 in vaccine and ORFV-PN strains
蛋白二级结构预测 Secondary structure prediction α-螺旋 Alpha helix β-转角 Beta turn 无规则卷曲 Radom coil β-折叠 Extended strand ORFV-PN株 ORFV-PN strain 34.13%（129/378） 6.08%（23/378） 37.3%（141/378） 22.49%（85/378） 疫苗株 Vaccine strain 30.42%（115/378） 6.88%（26/378） 39.15%（148/378） 23.54%（89/378）
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