Microbial Communities in Rhizosphere and Root-Endosphere of Wild Cymbidium ensifolium
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摘要:目的 比较野生建兰根际和根内细菌的种群结构差异，为研究根共生细菌与建兰的营养关系奠定理论基础。方法 采用高通量测序技术鉴定福州鼓山野生建兰根际和根内共生细菌，分析其种类多样性和种群结构。结果 建兰根际、根内拥有种类多样的细菌，辛普森指数分别为0.99、0.95；香农指数比较显示建兰根际细菌种类多样性显著高于根内。建兰根际拥有10门细菌，优势门为变形菌门（60.5%）、酸杆菌门（20.5%）、放线菌门（15.3%），根内优势细菌门分别为变形菌门（75.3%）、酸杆菌门（7.3%）、放线菌门（14.6%）。根际与根内丰度最高的10个细菌属中，Solibacter、Acidipila仅在根际中，戴氏菌、新鞘氨醇菌和Granulicella仅存在于根内。根际中酸杆菌门酸杆菌纲的丰度显著高于根内，11个差异显著的目，仅肠杆菌目在根内的丰度大于根际，根际有12个属的丰度显著高于根内。结论 建兰根际与根内细菌种类丰富度存在显著性差异，其原因可能是不同生态位的细菌对建兰的生物学功能存在较大差异。Abstract:Objective Community diversity and structures of the bacteria in the rhizosphere and endosphere of wild Cymbidium ensifolium were studied to understand the symbiotic relationship between them.Method The high-throughput sequencing method was applied to identify the bacteria in the rhizosphere soil and the root-endosphere of C. ensifolium at locations in Mt. Gushan, Fuzhou where the wild orchids were found. Species diversity and community structures of the spheres were compared.Result Numerous species of bacteria were found in the specimens. The Simpson index in the rhizosphere soil was determined to be of 0.99, and that in the root-endosphere 0.95. The Shannon indices indicated that the rhizosphere was significantly more diverse on species than the root-endosphere. There were 10 phyla of bacteria in the rhizosphere with the dominant ones being Proteobacteria (60.5%), Acidobacteria (20.5%), and Actinobacteria (15.3%). In the root-endosphere, the prevailing phyla were Proteobacteria (75.3%), Acidobacteria (7.3%), and Actinobacteria (14.6%). Among the 10 bacterial genera in the highest abundance, Solibacter and Acidipila existed only in the rhizosphere, while Dyella, Novosphingobium, and Granulicella only in the root-endosphere. The abundance of Acidobacteria Acidobacteriia bacteria in the rhizosphere were significantly higher than those in the root-endosphere. Of the 11 significantly different orders, only Enterobacteriales showed a greater abundance in the root-endosphere than in the rhizosphere. There were 12 genera significantly more abundant in the rhizosphere than in the root-endosphere.Conclusion The significantly different microbial community diversity and structures in the field rhizosphere and root-endosphere of wild C. ensifolium grown at the same area might reflect a highly complex synergism between the environment and the plants.
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水稻是重要的粮食作物，在全球粮食供应中发挥着关键作用。与传统常规水稻相比，杂交稻产量优势明显。目前，杂交稻产量占中国水稻总产量的60%左右，已在全球40多个国家推广应用[1-2]。杂交稻可分为两系法杂交稻和三系法杂交稻，其中两系法杂交稻是我国独创的杂种优势利用方法，是中国杂交稻育种的重要组成部分[1-4]。两系法杂交稻能够充分利用籼粳亚种间的杂种优势，大幅度提高单产，其独特的技术及在配制杂交组合方面的优势受到育种界的高度重视，已成为杂交稻育种的主流技术之一[3-4]。
水稻两系不育系可分为光敏核不育系(PGMS)和温敏核不育系(TGMS)。近年来，包括TMS1、TMS3、TMS5、TMS10、CSA等多个决定水稻P/TGMS性状的基因已经被成功克隆，人们更加深入了解了光温条件控制水稻育性转变的分子机理[5-9]。其中，tms5突变基因目前在生产上应用最为广泛，已育成的两系不育系中，绝大部分不育系的育性都由tms5位点控制[4, 7]。TMS5(Os02g0214300)编码RNA酶ZS1，它能够降解3个泛素核糖体L40融合蛋白基因(UbL40-1、UbL40-2、UbL40-4)的mRNA。UbL40基因在水稻花粉母细胞中优势表达，表达水平随温度的升高而增加。在tms5突变体中，第一外显子的碱基C被替换为A，从而提前形成了TAG终止密码子，导致TMS5失去功能。在日均温高于28℃的高温条件下，UbL40 mRNA表达水平提高，由于tms5突变体中(温敏核不育系)RNase ZS1功能缺失，UbL40 mRNA过度积累，导致花粉雄性不育，而野生型品种中RNase ZS1功能正常，UbL40 mRNA不过度积累，表现育性正常。在日均温23℃的低温条件下，由于UbL40 mRNA表达及积累水平低，水稻tms5温敏核不育系的花粉母细胞发育未受影响，所以能正常结实[7]。因此，tms5温敏核不育系可在高温条件下进行杂交制种，在低温条件下进行不育系繁殖。
目前，人们普遍利用温敏核不育系为tms5基因供体，采用常规杂交育种方法进行两系不育系选育。然而，这种育种方法存在劳动强度大、成本高、育种周期长等缺点，育成一个优良不育系常常需要10年以上的时间。近年来，CRISPR/Cas9基因组编辑技术被广泛用于创造精确的水稻基因定向突变，快速改良了多种水稻性状[10-16]，在创制水稻两系不育系方面已有成功报道[9, 15-16]。
本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对优良材料GH89的TMS5位点进行定点突变，在T0代就获得了温敏核不育系，经T1代自交分离，获得了非转基因温敏核不育系，所获得的不育系保持了GH89米质优良、开花习性好等优良特性，可供进一步选育利用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及种植条件
本研究以本实验室选育的优良中间材料GH89为受体材料进行遗传转化，转化所获得的T0代和T1代基因编辑材料，于水稻正常种植季节(5~9月)种植于福建省农业科学院寿山试验基地温室或大田内，按照常规方法进行正常田间种植及管理。T0代和T1代不育株割兜再生，在幼穗分化敏感期利用该基地秋季自然低温或人工气候箱进行低温处理，抽穗后移到温室内套袋收种。T2代突变纯合材料及自交分离出的野生型植株(对照)种植于田间及种植盆内，盆栽植株于育性敏感期移入人工气候箱(购自加拿大Conviron公司)进行不同温度处理。
1.2 载体构建及遗传转化
利用http://www.e-crispr.org/生物信息学网站，设计并合成与TMS5基因匹配的sgRNA序列(表 1)，参照北京唯尚立德生物技术公司提供的相关方法，利用VK005-1载体快速构建试剂盒，构建CRISPR/Cas-9-TMS502基因编辑载体。将构建好的载体转化到根癌农杆菌LBA4404中，然后通过农杆菌介导的方法转化GH89水稻愈伤组织，再生获得水稻植株[17]。
表 1 试验所用引物Table 1. Primers used for the study引物名 序列(5′-3′) 试验目的 TMS502-S CAGCCACCGCGCCGCCACCGGGT sgRNA构建 TMS502-A AACACCCGGTGGCGGCGCGGTGG sgRNA构建 TMS5F1 CCATCGTGCTTCGTGCCA TMS5基因扩增、测序 TMS5R1 CTGCTTGATCTCGCTCCC TMS5基因扩增、测序 HptF AGGTCAGGCTCTCGCTAAAC 转基因阳性株检测 HptR ACGTAAGGGATGACGCACAAT 转基因阳性株检测 1.3 基因编辑材料的鉴定
提取T0代植株的叶片总DNA，通过上游引物HptF和下游引物HptR(表 1)PCR扩增潮霉素磷酸转移酶基因来鉴定阳性转基因植株，PCR反应条件为95℃预变性4 min，随后按94℃、45 s，55℃、45 s，72℃、30 s的程序进行32个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物通过凝胶电泳鉴定转基因阳性株。所鉴定出的阳性株再以特异性引物TMS5F1和TMS5R1(表 1)PCR扩增TMS5基因的基因组片段，PCR反应条件为95℃预变性4 min，然后按94℃、45 s，62℃、45 s，72℃、1 min的程序进行32个循环，最后72℃延伸10 min。将TMS5基因目的片段的PCR产物送铂尚生物技术(上海)有限公司进行Sanger测序鉴定。T1代单株通过PCR扩增潮霉素基因来鉴定转基因阳性及非转基因植株，非转基因单株通过测序鉴定TMS5基因型，获得纯合突变单株，自交收种获得T2代，用于育性观察及鉴定。
1.4 tms5突变体育性观察及鉴定
1.4.1 田间自然条件育性观察鉴定
T2代纯合突变株系tms5-1-1、tms5-5-5、tms5-9-1及野生型对照tms5-1-wt于2018年5月初播种，5月28日移栽于大田。每份材料种植100株，于抽穗时，取即将开花的小穗的上、中、下各2个颖花，共6个颖花制片，用1%的I2-IK对花粉进行染色，用显微镜观察，计算花粉黑染率。套袋10株单穗，25 d后调查自交结实率。
1.4.2 人工气候箱育性鉴定
tms5-1-1、tms5-5-5、tms5-9-1、tms5-1-wt于秧龄25 d时移栽于盆内，每份材料各种15盆，每盆各种2株，自然条件种植管理。2018年7月1日试验材料进入幼穗分化期，当幼穗长约1 cm时，将每份材料各5盆移入人工气候箱分别进行不同温度处理，3台人工气候箱分别设置日平均温度22℃、24℃、28℃处理，光照14.5 h，光温处理条件见表 2，处理约20 d后，材料即将抽穗开花时移出人工气候箱，抽穗后调查各材料的花粉黑染率，8月10日统计套袋结实率。
表 2 人工气候箱处理的光温条件Table 2. Light and temperature conditions in phytotron时间/
(时：分)日加权平均温度/℃ 光照/
(μmol·m-2·s-1)28 24 22 2:00 25 20 18 0 5:00 25 23 21 0 5:30 25 23 21 150 8:00 27 25 23 300 11:00 33 27 25 480 16:00 29 25 23 300 20:00 27 23 21 150 2:00 25 20 18 0 2. 结果与分析
2.1 基因编辑载体构建及转基因水稻获得
水稻温敏不育基因TMS5共有6个外显子，选择第一外显子的第40~62个核苷酸位置作为本试验的sgRNA结合靶点(表 1)，构建好CRISPR/Cas-9基因编辑载体TMS502，并将其转入水稻材料GH89中。共再生获得12株水稻幼苗，于2016年6月移入温室种植。经潮霉素基因检测，共有10株苗为转基因阳性(图 1)，依次编号为tms5-1到tms5-10。
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图 1 PCR鉴定T0代转基因阳性植株注：M为分子量标记，H2O是以无菌水为模板的阴性对照，+为潮霉素阳性对照。Figure 1. Positive PCR identification of T0 transgene plants2.2 T0代TMS5基因突变鉴定分析与表型调查
利用TMS5F1和TMS5R1特异性引物(表 1)PCR扩增上述10个转基因阳性植株TMS5的目标区段序列，并对PCR产物进行Sanger测序鉴定，其中tms5-3、tms5-6、tms5-7、tms5-8未发生基因编辑突变，其余6个克隆发生了突变，其中tms5-1为插入A的纯合型突变，tms5-2、tms5-10为插入T的杂合型突变，tms5-4为两条染色体各插入A和T的双等位突变，tms5-5为缺失一个G的杂合突变，tms5-9为缺失7个碱基的杂合型突变。2016年8月底，这些转基因材料开始抽穗，tms5-1和tms5-4两株水稻的花药细小，不能开裂，利用1%的I2-IK对花粉进行染色，镜检结果为典败型花粉，其余植株能够正常结实。将tms5-1和tms5-4割兜再生，育性敏感期利用寿山基地10月份的自然低温处理，这两个植株均能转为可育并自交结实，种子成熟后收获上述6株发生突变的T0植株自交种子。本试验结果表明，tms5-1和tms5-4是温敏两系不育系，具有高温不育，低温可育的典型特征。
2.3 T1代非转基因植株分离与tms5纯合突变体鉴定
2017年5月中旬，在温室内将来自上述6株突变T0植株的种子按每个T1代株系单独进行育苗，苗期对各单株的转基因潮霉素标记进行分析，选择不含转基因成分的单株移栽到大田内，随后每个株系选择15~20个单株进行tms5基因型检测，共获得了4种纯合突变基因型(图 2)，突变类型与T0代所检测到的结果一致，并未产生新的突变。种子成熟时，收获野生型纯合植株自交种子，作为育性观察对照，各不育单株利用再生穗收种获得T2代。
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图 2 T1代tms5纯合突变体测序注：A为GH89野生型；B为tms5-1-1(插入A)；C为tms5-2-1(插入T)；D为tms5-5-5(缺失G)；E为tms5-9-1(缺失CCACCGG)。Figure 2. Representative sequences of T1 homozygous tms5 mutants2.4 T2代tms5不育系人工气候箱育性鉴定及田间育性表现
在人工气候箱及田间自然高温环境下，对4种基因型的T2代非转基因株系tms5-1-1、tms5-5-5、tms5-9-1、tms5-1-wt的育性特征进行了分析(表 3、图 3)，结果表明：3种基因型的tms5突变体都表现高温不育、低温可育的温敏特性，这些不育系的温敏不育起点温度约为24℃。而野生型对照tms5-1-wt在4种环境下都表现花粉育性正常，结实正常。这一结果表明，通过定点突变GH89的TMS5基因，能够将其转变为两系不育系。
表 3 tms5突变体花粉育性鉴定Table 3. Pollen fertility of tms5 mutants材料 花粉黑染率/% 自交结实率/% 22℃ 24℃ 28℃ 自然条件 22℃ 24℃ 28℃ 自然条件 tms5-1-1 75.1 1.2 0 0 36.2 0 0 0 tms5-5-5 78.5 0.8 0 0 38.1 0 0 0 tms5-9-1 83.1 0.5 0 0 35.2 0 0 0 tms5-1-wt 90.6 91.2 91.8 89.6 85.1 83.5 82.3 81.4 注：花粉黑染率及自交结实率均为10株的平均值，自然条件指福州7月1~20日的长日高温条件。 ![]()
图 3 日均温22℃和28℃的温度条件下tms5-1突变体与野生型的花药形态及花粉育性注：标尺长度上四图为1 mm，下四图为60 μm。Figure 3. Anther morphology and pollen fertility of tms5-1-wt and tms5-1-1 under day average temperature of 22℃ or 28℃3. 讨论与结论
培育优良的光温敏核不育系是两系法杂交稻选育的核心。近年来，多个决定水稻P/TGMS性状的基因已经被成功克隆[5-9]，水稻温敏核不育基因tms5的研究与应用最为广泛[7]。正常品种在发生TMS5突变并失去功能后，能够表现温敏雄性不育特征。庄楚雄团队[16]利用CRISPR/Cas9对11个水稻品种的TMS5位点进行编辑，在1年内获得了能够稳定遗传的、不含转基因成分的新不育系。这些不育系材料因遗传背景的差异而表现出不同的温敏不育起点温度，所获得的多数tms5不育系的起点温度符合两系不育系育种的实际要求，但有些不育系起点温度较高，不能适应生产需求。因此，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对优良水稻品种的TMS5位点进行定点突变，是一种快速培育水稻两系不育系的重要途径，但具体品种在编辑为tms5温敏核不育系后，其育性转换的起点温度无法预测，需进一步试验鉴定。
GH89为本实验室选育的优良育种中间材料，分蘖力强、粒形细长、开花习性好、柱头外露率高、米质优良、生育期适中、产量较高，具有转育为两系不育系的优良农艺性状。本研究在TMS5基因中设计了1个靶序列，高效地利用CRISPR/Cas-9对GH89的TMS5位点进行了定点编辑，所获得的10株T0代转基因苗共有6株产生了突变，其中tms5-1和tms5-4在T0代就表现出温敏雄性不育特征。通过在人工气候箱进行22℃、24℃及28℃不同温度水平的处理，3种基因型的tms5突变体都表现温敏核不育特性。在28℃高温条件下，tms5突变体表现完全不育；在24℃条件下，tms5突变体开始出现少量可染花粉，但并不能自交结实。说明GH89背景的tms5不育系的温敏不育起点温度约为24℃，这一起点温度符合福建省以南地区水稻两系不育系的选育要求。在22℃低温条件下，不育系出现大量可染花粉，自交结实率可达35.2%~38.1%，说明GH89背景的tms5不育系的可繁性较好。
本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将优良水稻育种材料GH89快速改良为两系不育系，为杂交稻新品种配制提供了一种两系法不育系选育的新方法。
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图 1 建兰根际与根内细菌16S rDNA高通量测序结果稀释曲线
Figure 1. Rarefaction curve of 16S rDNA high-throughput sequencing of bacteria in C. ensifolium rhizosphere soil and C. ensifolium root-endosphere
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图 2 建兰根际与根内细菌优势类群
注：图中细菌无中文名称用黑线代替（图3～6同）。
Figure 2. Dominant groups of bacteria in rhizosphere soil and C. ensifolium roots
Note: Bacteria absent Chinese names are shown by black lines (same for Figs. 3～6).
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图 3 建兰根际与根内细菌丰度最大的10个目
Figure 3. Dominant bacterial orders in in rhizosphere soil and C. ensifolium roots
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图 4 建兰根际与根内细菌丰度最大的10个属
Figure 4. Dominant bacterial genera in rhizosphere soil and C. ensifolium roots
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图 5 建兰根际与根内细菌不同分类单元下差异显著的类群
Figure 5. Significantly different bacterial groups of different taxa unit in rhizosphere soil and C. ensifolium roots
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图 6 建兰根际、根内共有的细菌OUT数量
Figure 6. Number of OUTs on bacteria commonly found in rhizosphere soil and C. ensifolium roots
表 1 建兰根际土壤及根内部样品细菌OUTs丰度和α多样性指数
Table 1 OUTs richness and alpha diversity indices of bacteria in rhizosphere soil and C. ensifolium root-endosphere
样品
Sample有效序列
Clean reads可操作分类单位
OTUsα多样性指数 alphy diversity indices 香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson超1指数
Chao1测序深度
Good’s coverage根际 Rhiz 74 878±6 490 817±42 7.56±0.09* 0.99±0.00 865.43±36.11* 0.998±0.00 根内 Endo 68 600±10 198 654±78 6.10±1.05* 0.95±0.04 700.99±67.30* 0.998±0.00 注：*在P=0.05水平下，该指标根际与根内细菌存在显著性差异。
Note: *at the level of P=0.05, there is a significant difference between this indicator rhizosphere and endosphere bacteria.
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