A TaqMan RT-PCR Method for Detecting Porcine Circovirus 3
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摘要:目的 建立检测猪圆环病毒3型（Porcine circovirus 3, PCV3）感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。方法 通过分析明确PCV3复制相关蛋白Rep基因特征，设计针对Rep基因的特异性引物和探针，经条件优化后建立检测PCV3感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法敏感性好，最低检测限为42.2拷贝·μL−1；特异性强，对常见猪群传染病均无交叉反应；重复性好，组内变异系数和组间变异系数均在1.48%以内。对福建省2014年至2018年保存的193份组织样品进行检测发现，PCV3在福建省猪群中存在较高的阳性感染率（65.80%），且和PCV2混合感染率较高（52.85%）。结论 本方法的建立为开展Rep基因在PCV3复制和感染过程中的作用机制提供检测方法。
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关键词:
- 猪圆环病毒3型 /
- Rep基因 /
- TaqMan实时荧光定量PCR方法 /
- 检测
Abstract:Objective A TaqMan RT-PCR method was established for detecting porcine circovirus 3 （PCV3） infection in swine.Method Specific primers and probe were designed by Oligo 7 software targeting the Rep gene after genetic comparison.Result The established TaqMan RT-PCR method could detect 42.2 copies·uL−1 with no positive signal on common porcine infectious diseases indicating high specificity of the methodology. On the constructed positive plasmids, the coefficients of variation for the intra- and inter-assays were less than 1.48% showing a high detection reproducibility. From the 193 clinical specimens collected in Fujian from 2014 to 2018, the newly developed method showed a high prevalence of PCV3 at 65.80% and high co-infection with PCV2 at 52.85%.Conclusion The established TaqMan RT-PCR method was made available for studying the function of Rep in PCV3.-
Keywords:
- Porcine circovirus 3 /
- Rep gene /
- TaqMan RT-PCR method /
- detection
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菊芋为菊科向日葵属，是一种草本植物，叶中含有多种具有药用功能的化学成分[1-4]。黄酮是一类药用功能较高的化学成分，具有抗氧化、抗炎、抗病毒等药用功能[5]，研究表明，黄酮类成分通常具有体外抑菌活性[6-7]。目前，国内外对菊芋叶黄酮类成分的研究集中在提取工艺、体外抗氧化等方面[8-10], 关于组培菊芋叶成分的报道较少。
组培菊芋苗的培养耗费母体少，繁殖迅速，繁殖率高，优化组培菊芋叶中有效成分的提取分离方法，可提升组培菊芋叶中有效成分的利用率。本文采用响应面法对组培菊芋叶中总黄酮成分的提取工艺进行优化，并探索其体外抑菌活性，为组培菊芋叶有效成分的开发应用奠定实验基础，也为进一步开发利用组培菊芋提供依据。
1. 材料与方法
1.1 仪器与材料
主要仪器：电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；紫外可见分光光度计(上海恒平)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；洁净工作台(苏州安泰)、接种器械灭菌器(上海咏星生物科技有限公司)；恒温水浴锅；玻璃层析柱；储液球；双连球；铁架台。
试剂与材料：菊芋采自福建卫生职业技术学院药用植物园，经中药鉴定教研室鉴定为菊科菊芋(Helianthus tuberosus L.)；芦丁(中国食品药品检定研究所，批号：100080-201610)。高纯水；无水乙醇、NH4NO3、KNO、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、FeSO4·7H2O、C10H14N2O8·2H2O、C2H5NO2、C12H18C12N4OS、C8H10ClNO3、HCl、Al(NO3)3、NaNO2、肌醇、蔗糖、琼脂均为分析纯；大孔树脂X-5(杭州凯英)；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；枯草芽孢杆菌。
1.2 方法
1.2.1 响应面优化组培菊芋叶总黄酮提取工艺
(1) 菊芋组培苗的培养：选取健康菊芋外植体，灭菌条件控制75%乙醇处理25 s，升汞处理350 s，初代、继代培养均选用MS培养基，炼苗后得菊芋组培苗。
(2) 供试品溶液的制备：组培菊芋叶50℃烘干，粉碎，精密称取1.0 g，按一定液料比加入乙醇溶液，超声提取一定时间，提取液过滤，定容，即得。
(3) 标准曲线的绘制：精密称取芦丁标准品0.004 0 g，加入70%乙醇溶液，用容量瓶定容至25 mL，配成供试芦丁标准液，该溶液质量浓度ρ=0.16 mg·mL-1。移液管精密吸取芦丁标准液0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5 mL于10 mL刻度试管中，添加70%乙醇溶液至5 mL，采用NaNO2-Al(NO3)3比色法在510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。
(4) 总黄酮含量的测定：总黄酮含量测定采用NaNO2-Al(NO3)3比色法。
(5) 方法学考察：① 精密度试验：精密吸取0.16 mg·mL-1的芦丁标准品溶液1 mL，按上述方法测定其吸光度，重复测定6次，考察实验仪器的精密度；② 重复性试验：精密称取6份菊芋粉末(同一批次)，按照上述方法制备供试溶液，测定样品的吸光度，考察重复性；③ 稳定性试验：精密称取菊芋粉末0.2 g，按照上述方法制备供试液，分别在不同时间进行检测(1、2、4、8、12 h)，考察其稳定性；④ 加样回收率试验：精密称取菊芋粉末6份，每份0.2 g，按上述方法制备供试液，其中3份加入1 mL质量浓度为0.16 mg·mL-1的芦丁标准品，另外3份不加，测定其吸光度，考察其加样回收率。
(6) 单因素试验：在超声功率200 W、超声频率40 KHz的条件下，考察不同液料比、提取时间、提取温度和提取溶剂含量对总黄酮提取率的影响，平行3次，取平均值，结果见图 1。
(7) 响应面法优化试验：根据Box-Behnken中心组合试验设计原理设计试验。
1.2.2 组培菊芋叶体外抑菌活性试验
(1) LB平板的制备：配置100 mL营养肉汤，加入2 g琼脂，高压灭菌后，得营养琼脂。将此营养琼脂于超净台中分装入5个培养皿中，每个培养皿约20 mL。
(2) 细菌液的制备：取1环细菌于灭菌后的营养肉汤中，37℃摇床培养过夜。
(3) 抑菌液的制备：取组培菊芋粉100 g，70%乙醇超声提取，回收溶剂后用石油醚萃取，弃去石油醚相，剩余溶液纯水混悬后上X-5大孔树脂柱，后用70%乙醇洗脱，浓缩洗脱液，纯水溶解，配成总黄酮质量浓度40 mg·mL-1的抑菌液。
(4) 染菌平板的制备：取培养过夜的菌液1 mL，加入约9 mL生理盐水，分光光度计测定混合液，确保OD=600 nm时，T=20。在超净台中取5 mL调好T值的菌液，加入1 mL灭菌后的50%葡萄糖液和50 mL 40℃的营养琼脂，混匀后各取5 mL于前一天配置的LB平板上，冷却。
(5) 抑菌试验：平板划分4个区域，各做上记号后，将牛津杯贴放于平板表面，两两对称，相邻杯中心相距30 mm以上，牛津杯内加入200 μL抑菌液，无菌水为阴性对照，青霉素为阳性对照。操作完成后盖好平板，倒置于37℃的培养箱中培养24 h，观察结果。
(6) 最低抑菌质量浓度的测定：采用试管二倍稀释法结合平板法[11]，抑菌液质量浓度为40、20、10、5、2.5 mg·mL-1，不加抑菌液的试管为阳性对照，菌液、抑菌液均不加的试管为阴性对照。各培养液配好后，移液枪移取，玻璃棒涂布于普通琼脂培养基，37℃恒温培养24 h，肉眼观察有无细菌生长。
2. 结果与分析
2.1 响应面优化组培菊芋叶总黄酮提取工艺
2.1.1 标准曲线的绘制
根据绘制的标准曲线(图 1)得知，y = 1.1792x + 0.0578(R2=0.9997)，线性范围0~0.8 mg·mL-1。
2.1.2 方法学考察
精密度试验结果显示，总黄酮含量RSD值为2.35%，表明仪器精密度良好；重复性试验结果显示，总黄酮含量的RSD值为2.1%，表明方法重复性较好；稳定性试验结果显示，总黄酮含量RSD值为1.84%，表明总黄酮在12 h内稳定性较好；加样回收率试验结果显示，总黄酮的平均回收率为96.86%，RSD值为1.13%，表明样品处理方法合适。
2.1.3 单因素试验
由图 2可见，总黄酮的提取率随着溶剂用量的逐渐增加而逐渐上升，当液料比达到1：20时，基本稳定。随着提取时间的增加，总黄酮提取率呈现出先上升后下降的趋势，提取时间为30 min时，提取率最高。随着提取温度的增加，总黄酮提取率也呈现先上升后下降趋势，60℃时，达到峰值。随着提取溶剂乙醇含量的增加，总黄酮提取率呈现出先上升后下降趋势，峰值出现时乙醇含量为50%。
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图 2 不同试验因素对总黄酮提取率的影响Figure 2. Effects of different factors on the extration rate of flavonoids2.1.4 响应面优化试验
根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，采用4因素3水平响应面分析法优化工艺参数，因素水平见表 1，试验结果见表 2。
表 1 响应面分析的因素及水平Table 1. Factors and levels of response surface analysis水平 A液料比/
(mL·g-1)B提取时间
/minC提取液含量
/%D提取温度
/℃-1 20 20 40 50 0 30 30 50 60 1 40 40 60 70 表 2 响应面试验结果Table 2. Experimental results of response surface analysis试验号 A
液料比/
(mL·g-1)B
提取时间
/ minC
提取液含量
/%D
提取温度
/℃R
总黄酮提
取率/%1 30 40 40 60 1.31 2 30 30 40 50 1.29 3 30 30 50 60 1.43 4 40 40 50 60 1.43 5 40 30 50 70 1.41 6 20 30 50 70 1.36 7 20 40 50 60 1.37 8 40 30 50 50 1.37 9 30 30 40 70 1.32 10 30 40 50 50 1.37 11 20 30 50 50 1.31 12 30 20 60 60 1.30 13 20 20 50 60 1.37 14 40 30 60 60 1.43 15 30 30 50 60 1.44 16 30 20 50 70 1.39 17 30 30 50 60 1.44 18 20 30 60 60 1.39 19 30 30 60 50 1.30 20 30 20 50 50 1.30 21 30 30 50 60 1.43 22 30 40 60 60 1.38 23 30 30 50 60 1.42 24 20 30 40 60 1.37 25 30 40 50 70 1.29 26 30 20 40 60 1.44 27 40 30 40 60 1.46 28 40 20 50 60 1.44 29 30 30 60 70 1.30 (2) 回归方程与方差分析：以总黄酮提取率R为指标，采用Design-Expert.V8.0.6软件对表 2数据进行分析，得到回归方程：R1 =1.43+0.031 A-6.917×10-3 B-7.233×10-3 C+0.012D-1.575×10-3 AB-0.014 AC-3.725×10-3AD+0.054 BC-0.041 BD-9.300×10-3CD+9.524×10-3A2-0.029B2-0.041C2-0.077D2方差分析见表 3。
表 3 响应面试验方差分析Table 3. Variance analysis of response surface test方差来源 平方和 自由度 均方 F值 P值 模型 0.085 14 6.04×10-3 19.49 ＜0.0001 A(液料比) 0.011 1 0.011 36.74 ＜0.0001 B(提取时间) 5.74×10-4 1 5.74×10-4 1.85 0.195 C(乙醇含量) 6.28×10-4 1 6.28×10-4 2.03 0.1765 D(提取温度) 1.75×10-3 1 1.75×10-3 5.65 0.0322 AB 9.92×10-6 1 9.92×10-6 0.032 0.8605 AC 7.78×10-4 1 7.78×10-4 2.51 0.1353 AD 5.55×10-5 1 5.55×10-5 0.18 0.6786 BC 0.012 1 0.012 37.99 ＜0.0001 BD 6.80×10-3 1 6.80×10-3 21.94 0.0004 CD 3.46×10-4 1 3.46×10-4 1.12 0.3086 A2 5.88×10-4 1 5.88×10-4 1.9 0.1898 B2 5.61×10-3 1 5.61×10-3 18.09 0.0008 C2 0.011 1 0.011 34.63 ＜0.0001 D2 0.039 1 0.039 125.49 ＜0.0001 残差 4.34×10-3 14 3.10×10-4 - - 失拟项 4.05×10-3 10 4.05×10-4 5.55 0.0564 纯误差 2.91×10-4 4 7.29×10-5 - - 总和 0.089 28 - - - 由表 3可知，回归模型达极显著水平(P＜0.001), 而失拟项不显著(P=0.0564＞0.05)，表明所建模型拟合度良好，能替代试验真实点解释响应结果。各因素对总黄酮提取率的影响依次为液料比＞提取温度＞乙醇含量＞提取时间，BC、BD、B2、C2、D2的P值都＜0.001，表示具有极显著影响，各因素对响应值的影响不是简单的线性关系，存在一定交互作用。
模型的变异系数(C.V.)为1.28%，信噪比为13.748，均在可接受范围内。回归模型的决定系数R-Squared为0.951 2，Adj R-Squared为0.902 4，表明该模型能解释90.24%响应值的变化，可以用于提取工艺的优化。
(3) 响应面分析：固定回归方程中任意2个因素在编码值0的水平，研究剩余2个因素对总黄酮提取率的影响，结果见图 3~8。
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图 3 液料比与提取时间交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 3. Response surface and contour plots on effects of extraction time and substrate:solvent ratio on yield of flavonoids![]()
图 4 液料比与乙醇含量交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 4. Response surface and contour plots on effects of ethanol concentration and substrate:solvent ratio on yield of flavonoids![]()
图 5 乙醇含量与提取时间交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 5. Response surface and contour plots on effects of ethanol concentration and extraction time on yield of flavonoids![]()
图 6 提取温度与液料比交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 6. Response surface and contour plots on effects of substrate:solvent ratio and extraction temperature on yield of flavonoids![]()
图 7 提取时间与提取温度交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 7. Response surface and contour plots on effects of extraction time and temperature on yield of flavonoids![]()
图 8 乙醇含量与提取温度交互影响总黄酮提取率的响应面与等值线Figure 8. Response surface and contour plots on effects of ethanol concentration and extraction temperature on yield of flavonoids由图 3可见，等高线沿液料比坐标轴方向的变化快于时间坐标轴，表明液料比对响应值的影响更明显。当提取时间一定时，总黄酮提取率随液料比增加而升高；当液料比一定时，随着提取时间的增加其呈现出先增后降的趋势，响应面比较平滑，表明液料比和超声时间的交互影响不显著。
由图 4可见，当乙醇含量一定时，总黄酮提取率随液料比增加而升高；当液料比一定时，随着乙醇含量的增加其呈现出先增后降的趋势，响应面比较平滑，表明液料比和乙醇含量的交互影响不显著。
由图 5可见，当乙醇含量一定时，总黄酮提取率随液料比增加呈现出先增大后减小的趋势；当提取时间一定时，随着乙醇含量的增加其呈现出先增后降的趋势，等高线呈现椭圆形状，表明提取时间和乙醇含量的交互作用对总黄酮提取率的影响显著。
由图 6可见，当提取温度一定时，总黄酮提取率随液料比增加而升高；当液料比一定时，随着乙醇含量的增加其呈现出先增后降的趋势，响应面比较平滑，表明液料比和提取温度的交互影响不显著。
由图 7可见，当提取温度一定时，总黄酮提取率随提取时间增加呈现出先增大后减小的趋势；当提取时间一定时，随着乙醇含量的增加其呈现出先增后降的趋势，等高线呈现椭圆形状，表明提取时间和提取温度的交互作用对总黄酮提取率的影响比较显著。
由图 8可见，当提取温度一定时，总黄酮提取率随乙醇含量增加呈现出先增大后减小的趋势；当乙醇含量一定时，随着提取温度的增加其呈现出先增后降的趋势，但变化并不明显，表明提取温度和乙醇含量的交互作用对总黄酮提取率的影响不显著。
(4) 验证性试验：由Design-Expert 8.0.6软件进一步分析回归模型，得到最佳工艺参数为：液料比1：40, 提取时间20 min，乙醇含量40.29%，提取温度63.8℃，预测值为1.50 mg·g-1。考虑到试验的可操作性，将乙醇含量修正为40%，提取温度修正为64℃。
按上述修正后的提取条件进行提取，平行操作3次，测得总黄酮提取率为1.47 mg·g-1，与预测值1.50 mg·g-1的相对误差为2%，表明模型可靠，提取效果理想。
2.2 组培菊芋叶体外抑菌活性研究
2.2.1 提取物抑菌效果
提取物抑菌效果见表 4，阳性对照为青霉素，空白对照为无菌平板。
表 4 总黄酮对菌种的抑菌圈直径Table 4. Diameters of inhibition zones on bacteria by flavonoid extract, mm(单位/mm) 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 空白 菊芋总黄酮 18.48±0.69 8.34±0.29 8.53±0.34 - 18.21±0.90 8.53±0.35 8.56±0.34 18.05±0.88 8.57±0.27 8.43±0.23 阳性对照 19.00±0.22 18.18±0.28 17.00±0.25 - 18.76±0.31 18.07±0.25 16.94±0.25 18.81±0.45 18.11±0.16 16.98±0.22 由表 4可见，组培菊芋叶总黄酮对大肠杆菌的抑制效果良好，但对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果不明显。
2.2.2 最低抑菌质量浓度测定结果
试管二倍稀释法结合平板法测定，结果见表 5，说明组培菊芋叶总黄酮对大肠杆菌的MIC值为20 mg·mL-1。
表 5 总黄酮对大肠杆菌的最低抑菌质量浓度(MIC)Table 5. Minimal inhibitory concentration (MIC) of flavonoid extract against E.coli抑菌液质量浓度
/(mg·mL-1)大肠杆菌 40 无长菌 20 无长菌 10 长菌 5 大量长菌 2.5 大量长菌 阳性对照 大量长菌 阴性对照 无长菌 3. 讨论与结论
研究结果表明，响应面优化组培菊芋叶最佳工艺条件为：液料比1：40, 提取时间20 min，乙醇含量40%，提取温度64℃，测得总黄酮提取率为1.47 mg·g-1，与预测值1.50 mg·g-1的相对误差为2%，表明模型可靠，提取效果理想。组培菊芋叶醇提物纯化后对大肠杆菌的抑制效果良好，但对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制效果不明显。
组培菊芋叶总黄酮的抑菌活性受抑菌液的质量浓度影响较大，抑菌液质量浓度越小，抑菌效果越不明显。本试验中所用的组培菊芋叶醇提物对金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌抑菌效果不明显，延长组培时间是否可以让叶中积累抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的成分，还需进一步探索。此外，组培菊芋叶的抑菌效果与野外菊芋的抑菌效果不太一致[12]，是否因为两者总黄酮的成分存在差异，尚需进一步探索。
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图 2 实时荧光定量PCR检测方法的扩增曲线
注：0−6：质粒拷贝数分别为4.22×100～4.22×106 拷贝·μL−1。
Figure 2. Amplification curve of RT-PCR
Note: 0–6: numbers of plasmid copies from 4.22×100 to 4.22×106 copy·μL−1.
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图 4 实时荧光定量PCR检测方法的特异性
注：1：PCV3阳性；对照：PCV1、PCV2、PPV、PRV、v-PRV、PCMV、PBoV、PTTSuV 1a和PTTSuV 1b，样品均为阴性，无荧光扩增信号。
Figure 4. Specificity of TaqMan RT-PCR method
Note: 1: PCV3 positive control; experimental control groups: PCV1, PCV2, PPV, PRV, v-PRV, PCMV, PBoV, PTTSuV 1a, and PTTSuV 1b （all negative with no fluorescent signal）.
表 1 实时荧光定量PCR方法的变异系数
Table 1 Coefficients of variation （CV） of TaqMan RT-PCR between inter- and intra-groups
序号 Number 拷贝数 Copies 组内 （Intra-group） 组间 （Inter-group） Ct值±标准差 Ct value ± SD 变异系数 CV/% Ct值±标准差 Ct value ± SD 变异系数 CV/% 1 4.22×106 14.82±0.09 0.58 14.83±0.13 0.85 2 4.22×104 22.24±0.16 0.72 22.28±0.18 0.82 3 4.22×102 29.64±0.33 1.10 29.78±0.44 1.48 
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表 2 临床样品的检测
Table 2 Detection on clinical samples by TaqMan RT-PCR method
项目 Item 样品数 Number PCV3 PCV2 PCV2&PCV3 阳性样品
Positive samples阳性率
Positive ratio/%阳性样品
Positive samples阳性率
Positive ratio/%阳性样品
Positive samples阳性率
Positive ratio/%2014年 25 7 28.00 21 84.00 5 20.00 2015年 28 13 46.43 20 71.43 11 39.29 2016年 41 28 68.29 34 82.93 18 43.90 2017年 63 51 80.95 55 87.30 43 68.25 2018年 36 28 77.78 31 86.11 25 69.44 合计 Total 193 127 65.80 161 83.42 102 52.85
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