Cloning, Expression and Subcellular Localization of DlAGOMEL1 from Longan
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摘要:目的 探究DlAGOMEL1基因在龙眼体胚发生过程中的调控作用，并明确该基因在亚细胞中的定位，为深入研究DlAGOMEL1基因的功能提供理论依据。方法 采用RT-PCR技术，基于龙眼基因组数据库，克隆DlAGOMEL1基因的CDS及该基因的5′端上游启动子序列，采用生物信息学方法分析该基因，通过实时荧光定量PCR技术检测其在龙眼体胚不同发育阶段的相对表达量，同时，构建该基因的瞬时融合表达载体，得到重组质粒，并将其瞬时转入洋葱内表皮细胞中，用荧光共聚焦显微镜观察细胞绿色荧光信号。结果 获得DlAGOMEL1基因CDS全长序列及5′端上游启动子序列长度分别为2655 bp、1512 bp，该基因编码884个氨基酸；系统进化树分析表明，龙眼DlAGOMEL1蛋白与胡杨亲缘关系最近，与单子叶植物水稻、玉米等亲缘关系最远；实时荧光定量分析表明，该基因在龙眼体胚不同阶段均表达，在子叶胚时期（CE）的相对表达量较高，而在球形胚时期（GE）的相对表达量最低。亚细胞定位结果发现，DlAGOMEL1基因定位于细胞质中。结论 DlAGOMEL1基因在龙眼体胚阶段的相对表达量呈“V”字型，可能主要参与龙眼晚期体胚发生的转录调控过程，在细胞质中发挥主要的功能作用。
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关键词:
- 龙眼 /
- DlAGOMEL1基因 /
- 表达分析 /
- 亚细胞定位
Abstract:Objective Still unclear regulatory functions of DlAGOMEL1 on the nonembryonic callus and different embryogenic cultures of longan (Dimocarpus longan) were investigated.Method From the longan genome database, the full-length cDNA sequences (CDS) ofDlAGOMEL1 and its promoter were obtained using RT-PCR. Bioinformatics of this gene was analyzed and the relative expressions of this gene in embryogenic cultures were detected by real-time quantitative PCR. The recombinant plasmid was constructed from the transient fusion expression vector, and the onion inner epidermal cells transformed into transient onion cells. Green fluorescence signal of the cells was searched under a fluorescence confocal microscope. Result The CDS of DlAGOMEL1 was 2,655 bp which encoded 884 amino acids and the promoter was 1,512 bp. The DlAGOMEL1 of longan and other plants were highly conserved as shown in a multiple sequences analysis. Phylogenetic tree of the protein indicated its close relation with Populars euphonium but not with monocotyledonous plants, such as rice and maize. The gene expressed differently in somatic embryo development stages—most strongly at cotyledon embryo stage and least at spherical embryo stage. The subcellular localization of DlAGOMEL1 was found in cytoplasm.Conclusion Since the relative expression of DlAGOMEL1 was shown to be high at the late stage of longan somatic embryo, the gene might be functionally active in the late stage of the development. The revealed subcellular localization of the gene seemed to predispose its involvement in the cytoplasm of longan.-
Keywords:
- Dimocarpus longan /
- DlAGOMEL1 /
- gene expression /
- subcellular localization
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0. 引言
【研究意义】土壤盐渍化已成为影响全球环境问题并严重影响作物生产安全[1]。过量的盐分迫使植物根系吸收大量的钠（Na+）和氯（Cl−），从而干扰钾（K+）稳态，影响细胞活性、代谢和光合作用，导致活性氧（ROS）的积累，并产生渗透胁迫和离子毒性，从而导致植株无法正常生长[2]。培育耐盐作物是有效利用盐碱地和解决农作物盐胁迫问题的可行途径[3]。藜麦（Chenopodium quinoa Willd.），又称南美藜、藜谷、奎奴亚藜等，属于藜科藜属的双子叶植物，距今已有七千余年的种植历史[4]。藜麦的营养价值极高，含有丰富的蛋白质、维生素、矿物质，以及一些人体所必需的氨基酸与多酚，藜麦的氨基酸组成与人体的氨基酸需求相似且优于很多谷物[5]。除此之外，藜麦的抗盐碱、抗干旱和抗病虫害等能力强，植株在高海拔、寒冷、土壤贫瘠情况下仍能生长良好，被认为未来最具有潜力的作物之一[6]。因此，精心选育具有高强抗性的藜麦新品种，进一步促进盐碱地生物改良，保障粮食安全，具有重大的现实意义。【前人研究进展】藜麦作为一种兼性盐生植物，具有天然的耐盐碱能力，其耐盐机制受多方面的控制[7-8]。有研究表明藜麦耐盐通过Na+/H+逆向转运蛋白（NHX） 将Na+在液泡中区隔化、有效的液泡和木质部K+浓度的保持、较高的活性氧（ROS）耐受性以及对气孔发育的有效控制等，从而能在盐碱地较正常生存[9]。许多研究表明，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、甜菜碱醛脱氢酶（BADH）、脯氨酸、可溶性糖等在植物对抗逆境胁迫过程中起到了非常重要的作用[10]。【本研究切入点】对藜麦在盐逆境胁迫下的研究，国内外多集中在不同品种藜麦的耐盐性鉴定以及不同盐浓度对藜麦种子的活力和相关生理生化特性的影响，但对盐胁迫处理后相关耐盐基因的表达量变化情况却鲜有报道。【拟解决的关键问题】通过探讨不同浓度盐胁迫对藜麦种子发芽率和幼苗生理特性的影响，以及盐胁迫下SOD、POD的酶活性及其BADH基因时空表达模式和不同盐胁迫下藜麦农艺性状的影响，以期为藜麦的推广应用、盐碱地改良及植物耐盐机理研究提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 种子萌发及植株培养条件
选田间农艺形状优良的藜麦品种Temuco种子，75%酒精消毒后用蒸馏水洗净。用0、200、450 mmol·L−1 NaCl溶液处理24h，将处理后的种子置于发芽盒中，每盒100粒种子，每个盐浓度重复3次。每盒分别加入50 mL上述各溶液后，将所有发芽盒置于光照培养箱（宁波莱福科技有限公司）中，培养条件设置如下。阶段1：光照100%，温度25 ℃，16 h；阶段2：光照0，温度20 ℃，8 h。以24 h为一个循环，每天统计发芽数，计算发芽势和发芽率。第15天每个重复取5株幼苗测定鲜重和株高并测定叶片的生理生化指标，同时取根、茎、叶组织测定不同部位下SOD、POD和BADH基因的表达量差异。
幼苗期瞬时盐处理：挑取蒸馏水条件下发芽第15天长势一致的幼苗，分别用0、200、450 mmol·L−1NaCl溶液处理，由于幼苗的瞬时处理在根部受到的影响最为直接，选择在0、2、6、12、24 h取根部的组织样品，分别测定SOD、 POD和BADH基因的表达量。
成熟植株培养和处理：另取Temuco饱满种子100颗种于盆钵，每钵1颗，置于塑料大棚内。幼苗长至8片真叶时，将相同量的0、200、450 mmol·L−1 3个浓度NaCl溶液倒入试验所选长势一致的幼苗土壤中，所有盆底部装上底托，有水溢出则再次倒入土壤中。每个浓度处理8株幼苗，每个处理重复3次。
1.2 生理生化指标及元素测定方法
分别选取发芽盒中第15天各处理的幼苗子叶，称重后用锡箔纸包好放入液氮中，转至超低温冰箱（−80 ℃）中保存，用于SOD、POD、MDA、脯氨酸和可溶性糖等指标的测定。SOD活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）法[11]，POD活性测定采用愈创木酚法[11]，可溶性糖含量采用苯酚-硫酸法[11]，脯氨酸含量测定采用茚三酮法[11]，MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸法[11]。
盆钵藜麦植株在成熟初期时测定农艺性状。叶面积采用任永峰等[12]的方法测定，叶片相对含水量测定用加热烘干法；待植株完全成熟后收获种子，去杂质和脱粒处理后置于干燥环境中5 d，挑选饱满种子。千粒重依据国家标准GB/T 5519－2008进行测定[12]。
种子的各元素含量采用原子吸收分光光度计法[13]，硫含量测定采用硫酸钡比浊法[14]，碳含量测定采用干烧法[15]，氮含量测定采用凯氏定氮法[16]。钠钾比测定采用Hans等[17]的方法。
1.3 荧光定量PCR(qPCR)检测基因相对表达量
Trizol试剂快速提取法提取RNA，DNase I消化去除DNA污染后，取3 µg RNA作为模板，以Oligo d(T)18为引物，使用M-MLV反转录酶（TaKaRa公司，日本）合成cDNA。通过比对GenBank核酸序列数据库中已公布物种（菠菜、拟南芥和甜菜）的cDNA序列和基因组DNA序列，于基因的保守区域设计引物。PCR扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒纯化（Axygen公司，美国）回收并连接至pMD18-T载体（Takara公司，日本）后送华大基因测序部测序。根据测序获得的藜麦的cDNA序列信息，设计特异性的基因表达引物（表1）。BioRad CFX connect™ real-time PCR System （BioRad, USA）用于进行荧光定量PCR，酶试剂为SuperReal Premix Plus with SYBR Green I（天根公司，中国）。
表 1 藜麦3种基因扩增引物Table 1. Amplification primers of 3 quinoa genes引物名称
Name正向引物
Forward primer反向引物
Reverse primer用途
UseBADH-1 CTGAAGAAATCATCGGTGATATTC TCAAGGAGACTTGTACCATC BADH cDNA片段扩增 BADH-2 GCATTTGAAGAAAGGGTA CACTACGCTTGACTCCTCCC BADH基因定量PCR POD-1 GGATGTGATGCATCAGTACTAGTAG GACAACAGCATCTCTAGCAGC POD cDNA片段扩增 POD-2 GATTCAACTCCAGGAAACACA CAGCATCTCTAGCAGCATAGG POD基因定量PCR SOD-1 AACCACTCAATTTTCTGGAAGA AGTATGCATGCTCCCAAACATC SOD cDNA片段扩增 SOD-2 TGATTTGGAGTGGTTTCAAC CAATTAGTCAAGGAGGTGGT SOD基因定量PCR 相对表达量以GAPDH基因为内参进行靶基因的标准化，用2−ΔΔ Ct法来分析试验数据。
Δ Ct=Ct（靶基因）−Ct（GADPH）
ΔΔ Ct=Δ Ct（试验组）−Δ Ct（对照组）
1.4 数据处理
所有数据均取3个重复的平均值，SPSS（19.0）软件进行单因素方差（ANOVA）统计分析，差异显著性定义为P＜0.05，Excel（2019）软件制作相应图表。已知物种的基因序列使用NCBI在线软件BLASTN检索（http://ncbi.nlm.nih.gov）下载，序列比对使用软件MEGA 5.0，引物设计使用软件Primer 5.0。
2. 结果与分析
2.1 不同NaCl浓度对藜麦种子萌发的影响
从表2可知，在200 mmol·L−1 NaCl浓度处理下，相比对照而言，种子的发芽率、发芽势和株高均无显著差异；在450 mmol·L−1 NaCl浓度下，发芽率和发芽势相比对照分别显著下降50.50%和73.86%，苗期株高相比对照显著下降40.31%。发芽指数随浓度上升显著下降。活力指数和鲜重均在200 mmol·L−1 NaCl浓度时最高，较对照增幅分别为47.87%和90.91%；在450 mmol·L−1 NaCl浓度下，活力指数相比对照下降80.18%，鲜重则和对照之间差异不显著。该试验结果表明高盐浓度会抑制藜麦的发芽以及幼苗活力，低盐环境有利于提高藜麦的活力指数。
表 2 不同NaCl浓度对藜麦种子Temuco萌发的影响Table 2. Quinoa seed germination affected by NaCl stressNaCl浓度
NaCl concentration/( mmol·L−1)发芽率
Germination rate/%发芽势
Germination potential/%发芽指数
Germination index活力指数
Vitality Index株高
Plant height/cm鲜重
Fresh weight/g0 85.40 a 78.72 a 16.53 a 3.28 b 3.87 a 0.22 b 200 80.34 a 72.52 a 11.93 b 4.85 a 4.21 a 0.42 a 450 42.27 b 20.58 b 3.82 c 0.65 c 2.31 b 0.19 b 同列数据后不同小写字母表示同一指标在不同浓度下差异显著（P＜0.05），下同。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences on same indicator at different concentrations (P＜0.05). Same for below.2.2 不同NaCl浓度对成熟植株农艺性状的影响
考察成熟的藜麦植株的农艺性状，有助于鉴定植株适应性、抗逆性和丰产性。由表3可知，450 mmol·L−1 NaCl浓度下，株高、叶面积和叶片相对含水量与对照相比，分别显著下降了16.09%、15.88%和12.35%，说明高盐浓度下藜麦植株的生长发育受到明显抑制。而200 mmol·L−1 NaCl浓度盐处理下株高、叶面积、千粒重和叶片相对含水量与对照处理间均无显著差异。
表 3 Temuco成熟期不同浓度盐胁迫下农艺性状Table 3. Agronomic characteristics of Temuco quinoa under salt stress at mature stageNaCl浓度
NaCl concentration/(mmol·L−1)株高
Plant height/cm叶面积
leaf area/cm2叶片相对含水量
Relative water content of leaves/%千粒重
thousand kernel weight/g0 157.2 a 952.3 a 91.5 a 4.11 a 200 155.6 a 947.8 a 87.7 a 4.02 a 450 131.9 b 801.1 b 80.2 b 4.08 a 2.3 不同NaCl浓度胁迫下种子元素含量变化
由表4可知，在450 mmol·L−1 NaCl浓度下，藜麦种子的N元素含量与对照相比显著降低16.21%，N元素是种子内部各种有机物的重要组成成分，该结果表明高盐胁迫会显著影响种子内部有机物的合成运输等过程，此外其他元素的含量无明显变化；在200 mmol·L−1 NaCl浓度下，各个元素含量与对照相比均无显著差异。
表 4 Temuco种子各元素成分含量Table 4. Contents of elements in Temuco seedsNaCl浓度
NaCl concentration/(mmol·L−1)N/% C/% S/% Fe/(mg·g−1) Cu/(mg·g−1) Ca/(mg·g−1) Mg/(mg·g−1) 0 3.27 a 44.82 a 0.20 a 0.058 a 0.005 a 8.592 a 1.784 a 200 3.41 a 45.03 a 0.23 a 0.060 a 0.006 a 8.439 a 1.692 a 450 2.74 b 44.91 a 0.21 a 0.057 a 0.006 a 8.682 a 1.729 a 图1中横坐标为NaCl浓度，纵坐标为Na+/K+比。结果表明低浓度盐胁迫下Na+/K+比率与对照相比没有发生显著变化，在高浓度盐胁迫处理下Na+/K+比率显著上升。Na+/K+比率可以作为检测种子活力的敏感指标，该结果表明高浓度盐胁迫会显著降低藜麦的种子活力，而低盐胁迫对藜麦种子活力并无明显影响。低浓度下Na+/K+比率没有显著变化，在高浓度时Na+/K+比率显著上升，这说明450 mmol·L−1高浓度NaCl可迫使Na+离子大量进入藜麦种子细胞，而藜麦种子对于低浓度NaCl不敏感。
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图 1 Temuco种子盐胁迫下Na+/K+变化Figure 1. Changes of Na+/K+ in Temuco seeds under salt stress2.4 不同NaCl浓度下幼苗叶片生理生化指标的变化
随着盐浓度的增加，幼苗SOD、POD活性呈现出先上升后下降的单峰变化趋势（表5）。在200 mmol·L−1 NaCl浓度下，SOD和POD的酶活性分别达到最高值138.75 U·g−1·min−1和96.37 U·g−1·min−1 ，与对照相比分别显著提高了20.48%和27.95%；在450 mmol·L−1 NaCl浓度时，SOD和POD的活性与对照相比分别显著下降了20.04%和29.26%（表5）。可溶性糖和脯氨酸含量在200 mmol·L−1和450 mmol·L−1两个盐浓度下，与对照相比较均有显著增长，可溶性糖的增幅分别为68.06%和41.67%，脯氨酸含量的增幅分别为237.38%和189.97%。但在高盐浓度下，可溶性糖的含量相较于低盐浓度显著降低，脯氨酸含量无显著变化，两者均呈现出先增长后逐渐下降的趋势，同时可看出脯氨酸对NaCl浓度的耐受性要强于可溶性糖（表5）。
表 5 不同NaCl浓度处理后幼苗叶片生理生化指标Table 5. Physiochemical indexes of seedling leaves treated with NaCl solutions of varied concentrationsNaCl浓度
NaCl concentration/
( mmol·L−1)SOD活性
SOD Activity/
(U·g−1·min−1)POD活性
POD Activity/
(U·g−1·min−1)可溶性糖含量
Soluble suger content/
(mg·g−1)脯氨酸含量
Proline content/
(μg·g−1)MDA含量
MDA content/
(μmol·g−1)0 115.16 b 75.32 b 7.20 c 25.12 b 3.42 b 200 138.75 a 96.37 a 12.10 a 84.75 a 3.54 b 450 92.08 c 53.28 c 10.20 b 72.84 a 5.57 a MDA含量可以反映细胞膜脂质过氧化作用水平。由表5可知，当NaCl浓度达200 mmol·L−1时，MDA含量略有上升但未达显著，当NaCl浓度达到450 mmol·L−1时，MDA含量较对照显著提高62.87%。说明高盐浓度会使藜麦细胞内活性氧不断升高，细胞膜逐渐受到破坏。
2.5 BADH、SOD和POD基因在不同盐浓度下的表达情况
在不同的盐浓度和不同的组织部位，藜麦的BADH、SOD和POD 3个基因存在不同的表达形式（图2）。从图2可知，BADH基因表达主要集中在根部，在200 mmol·L−1和450 mmol·L−1的NaCl浓度下均表现出显著的上升；SOD基因表达响应也主要在根部，其表达量在200 mmol·L−1盐浓度显著升高，后在450 mmol·L−1盐浓度时呈现显著下降；POD基因的表达的主要部位为茎叶，其表达量随盐浓度增加先上升后下降。
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图 2 NaCl处理后幼苗根、茎、叶的BAHD(A)、POD(B)、SOD(C)相对表达水平Figure 2. Relative expressions of BADH (A), POD (B), and SOD (C) in roots, stems, and leaves of seedlings under NaCl treatments取根部的组织进行动态基因表达水平测定，结果表明（图3A），在200 mmol·L−1盐浓度胁迫下，BADH和POD的表达量于盐处理2 h时后有所增加，整体呈现上升倾向，至24 h时仍处于上升趋势，SOD在该浓度下随时间变化不大；在450 mmol·L−1盐浓度条件下，BADH表达量在处理后的2 ～12 h显著增加，但在24 h时出现急剧下降；SOD和POD在该浓度下无显著变化。这说明这三者基因对盐浓度的敏感性和反应速度均存在差异。
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图 3 200(A)、450(B) mmol·L−1NaCl处理后不同时间对幼苗BADH与SOD、POD基因表达水平Figure 3. Expressions of BADH, SOD, and POD in seedlings at different times after 200 mmol·L−1 (A) and 450 mmol·L−1 (B) NaCl treatments3. 讨论与结论
藜麦是一种兼性盐生植物，现有2500多份种质资源，不同资源之间的耐盐能力有差异，有些品种能耐受高达海水的盐浓度（约500 mmol·L−1 NaCl）[18-19]。藜麦种质Temuco原产地南美，植株茎叶绿色，种子土黄色，田间农艺性状表现优良。本研究结果发现在低盐（200 mmol·L−1 NaCl）环境下有助于藜麦Temuco生长，而在450 mmol·L−1盐浓度下，Temuco种子的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和株高均呈现显著下降，成株的株高、叶面积和叶片相对含水量也显著降低，显然细胞的生长受到了阻挠和迫害；同时，MDA含量急剧上升，说明细胞活性氧增加，氧化反应加剧，细胞膜受到破坏[20]；抗氧化酶SOD和POD活性在该浓度下也显著下降，表明高盐环境下细胞活力下降，酶活性受到影响；此外高盐明显降低了植株对N元素的吸收，Na+/K+比率显著上升，从而降低蛋白质合成和酶促反应的活性。但是在200 mmol·L−1低盐浓度下，除发芽指数有所下降外，Temuco的种子活力指数和鲜重出现显著增加，且各个营养元素还略有上升趋势，这说明低盐含量有利于藜麦的生长发育；在该浓度下SOD、POD、可溶性糖和脯氨酸等均增加，表明低盐浓度胁迫下藜麦植株通过抗氧化酶活性增强用已清除植株体内产生的自由基，以及积累渗透调节物质以抵抗盐胁迫的伤害。
藜麦的SOD、POD、可溶性糖和脯氨酸均参与对抗盐胁迫，但对盐耐受程度不同。随着盐浓度的增加，这四种成分都随之增加，说明它们对盐胁迫均有响应；但是SOD和POD对盐耐受浓度小于450 mmol·L−1，而可溶性糖和脯氨酸对盐耐受浓度大于450 mmol·L−1。这说明，在Temuco细胞的耐盐机制中，渗透保护剂的耐受能力要大于抗氧化酶体系。
藜麦抗逆基因的表达存在组织特异性。BADH和SOD基因在藜麦的根部位置表达较多。根部是植株盐分吸收的直接接触部位，也是盐胁迫以及其导致的活性氧产生的最强位置，这说明BADH和SOD具有局部靶标效应；而POD基因的主要表达位置在叶片和茎秆，这可能跟其功能是清除过氧化物有关[21]，因此其作用发挥较BADH和SOD的物理位置上要延后。
BADH基因对NaCl胁迫更为敏感，反应更为迅速。从时间动态表达上可以看到，在低盐浓度下，BADH和POD反应敏感；在450 mmol·L−1高盐环境下，BADH依然反应迅速，但是POD和SOD基本无响应。BADH是渗透压调节的关键中间酶，当细胞内外压强出现顺逆差时，BADH基因会迅速反应以调整细胞渗透调节物质GB的含量，Jacobsen等[7]和Ruffino等[22]也报道过藜麦通过增加细胞内甜菜碱、脯氨酸等渗透调节物质来维持细胞膨压。同时，过高的盐浓度会抑制酶活性，15 d的幼苗在450 mmol·L−1盐浓度瞬时处理下，POD和SOD基本无反应，这说明POD和SOD合成通路上的上游酶可能已经提前失活。因此可以将BADH基因的表达量水平和响应速度作为藜麦耐盐种质筛选的标记之一。
相同盐浓度下不同的胁迫方式对藜麦生长发育的影响不同。本试验使用3种不同的盐胁迫方式，观察发现：a）在450 mmol·L−1盐浓度下，瞬时盐处理第15天的幼苗，12 h后幼苗开始萎蔫并在24 h后基本处于失水状态；b）从种子萌发开始就一直处于高盐胁迫环境下的藜麦，尽管生长受到抑制，但依然可以存活，说明藜麦在从种子萌发到组织分化的整个生长过程中有充分的自我调整时间以适应高盐环境；c）等待成株后再进行盐处理则植株对高盐的耐受性较强，其生长发育也受抑制，但仍可以完成生命历程。因此，在藜麦的引种或是耐盐品种的培育过程中，要注意移栽的时间以及处理方式的合理选择。
藜麦是未来最具潜力的农作物之一，而芽期和苗期是盐胁迫对于藜麦的影响的两个关键时期[17]。本研究对藜麦种质Temuco在不同NaCl浓度下的生理生化特性及抗逆基因的不同响应模式进行了探讨，为进一步深入研究藜麦的耐盐机制和耐盐种质的选育提供理论基础。
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图 1 龙眼DlAGOMEL1基因CDS和启动子序列PCR扩增及融合表达载体的构建
注：（1）M1-DL 2 000 bp，M2-DL 15 kb；（2）A-DlAGOMEL1基因CDS电泳图；B-DlAGOMEL1基因5＇端上游启动子序列；C-融合表达载体的pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP环状质粒。
Figure 1. Electrophoretograms of CDS of DlAGOMEL1 and promoter by PCR and fusion expression vector in longan
Note: (1) M1-DL 2 000 bp; M2:-DL 15 kb; (2) A-DlAGOMEL1 CDS; B- promoter of DlAGOMEL1; C- fusion expression vector of pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-eGFP circular plasmids.
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图 5 AGOMEL1蛋白系统发育进化树
Figure 5. Phylogenetic analysis on DIAGOMEL1 from longan and other plants
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图 6 龙眼体胚发生不同阶段DlAGOMEL1的相对表达量
注：（1）NEC：非胚性愈伤组织；EC：胚性愈伤组织；ICpEC：不完全胚性紧实结构；GE：球形胚；CE：子叶胚。（2）图中不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Figure 6. Relative expressions of DlAGOMEL1 at different somatic embryogenesis stages of longan
Note: (1) NEC: Non-embryonic callus; EC: Embryonic callus; ICpEC: Incomplete embryogenic compact structure; GE: Globular embryo; CE: Cotyledon embryo. (2) Different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05).
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图 7 pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP蛋白在洋葱内表皮细胞的亚细胞定位
注：A～C：导入DlLAGOMEL1重组质粒的洋葱内表皮细胞；D～F：导入pCAMBIA1300-35s-GFP空载体的洋葱内表皮细胞；A、D：荧光激发图；B、E：叠加图；C、F：明场图。
Figure 7. Subcellular localization of pCAMBIA1300-35s-DlAGOMEL1-GFP protein in onion
Note: A–C: subcellular locations of endoepidermal cells of onion scale leaf introduced into DlAGOMEL1 recombinant plasmid; D–F: subcellular locations of endoepidermal epidermis cells of onion scale leaf introduced into pcambia1300-35s-GFP empty vector; A and D: flourescent field; B and E: merged field; C and F: bright field.
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称
Primer name引物序列
Sequence （5′-3′）用途
Purpose退火温度
Annealing temperature/℃DlAGOMEL1-CF AATATCGACTTCACGCGTCTG 全长验证
Full length validation61 DlAGOMEL1-CQ GCAAGCAACCACAATGAAGC pro-AGOMEL1-F ACTTGTTAGAGACCGACCTAC 启动子克隆
Promoter cloning54 pro-AGOMEL1-R ATACGAGAATCTTGACAATAACC DlAGOMEL1-1300-F CAGTGGTCTCACAACATGACTCGATGCATGATAAG 载体构建
Vector construction61 DlAGOMEL1-1300-R CAGTGGTCTCATACATTCCTGGTGAATAGCATCCA GFP-F AACATACGGAAAACTTACCCT 荧光信号验证
Fluorescence Signal Verification55 GFP-R GTGCAACTCGCTGATCATTAT DlAGOMEL1-QF GGTCTCACTCTCCAAACTCAG 实时荧光定量 PCR
Real-time quantitative PCR58 DlAGOMEL1-QR TTGAAGAAGCAGCTGTCTCC 注：加粗CAGT为保护碱基，下划线为酶切位点。
Note: bold CAGT are the protective bases, and underlined are the restriction sites.
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表 2 龙眼AGOMEL1基因启动子序列顺式作用元件
Table 2 Cis-acting elements of DlAGOMEL1 promoter
顺式元件
Cis element序列
Sequences方向
Strand matrix位置
Position/bp功能
FunctionABRE ACGTG/AACCCGG/CACGTG/ACGTG +/+/−/+ 616/798/1153/1154 脱落酸反应Abscisic acid responsiveness Box 4 ATTAAT − 948 光响应Light responsiveness G-Box CACGTT/CACGTG/GCCACGTGGA −/−/+ 615/1153/1151 光响应Light responsiveness GATA-motif GATAGGA/GATAGGG +/+ 690/1107 光响应Light responsiveness TCT-motif TCTTAC + 212 光响应Light responsiveness CAT-box GCCACT + 1285 分生组织表达Meristem expression LTR CCGAAA + 1353 低温响应Low-temperature responsivenes MBS CAACTG + 1407 参与干旱诱导的MYB结合位点
MYB binding site involved in drought-inducibility注: +: 正向; −: 负向。
Note: +: positive strand; −: negative strand.
下载: 导出CSV
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