Transcriptome Sequencing on Eight Psidium guajava Cultivars
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摘要:目的 获得番石榴转录本数据，探讨不同番石榴品种转录本之间差异。方法 研究通过Illumina HiSeq 2500平台对红心（HX）、彩虹（CH）、紫红（ZH）、水晶（SJ）、秀珍（XZ）、彩叶变（CYB）、彩叶（CY）和紫星（ZX）等8个番石榴品种的8～9成熟果肉进行转录组测序，通过组装及数据库比对，获得大量番石榴转录本注释信息。结果 组装获得了126 979条 Unigene，平均长度766 bp，N50为1654 bp，N90为267 bp；8个番石榴品种间共有27 274个基因为共表达基因。通过主成分分析与差异基因表达聚类分析，发现品种水晶（SJ）和彩叶变（CYB）之间基因功能表达差异较小，品种紫红（ZH）与其他品种之间基因表达差异较大。聚类分析将品种水晶（SJ）和彩叶变（CYB）聚为一类，品种红心（HX）、彩虹（CH）、秀珍（XZ）、彩叶（CY）、紫星（ZX）归为一类，但品种紫红（ZH）与其他品种间距离较远。结论 本研究结果为后续番石榴种质资源分类、功能基因表达、功能基因鉴定提供了大量可靠的转录组数据。Abstract:Objective Transcriptomes of different guava cultivars were obtained for comparison.Methods Transcriptome sequencing by Illumina Hwaseq 2 500 was conducted on 8-9 mature fruit pulp from 8 varieties of Psidium guajava Linn, namely Red Heart (HX), Rainbow (CH), Purplish Red (ZH), Crystal (SJ), Shuzhen (XZ), Colored-leaf B (CYB), Colored-leaf (CY), and Purple Star (ZX).Results By comparing to the database, 126979 Unigenes of an average length of 766 bp with a N50 of 1654 bp and a N90 of 267 bp were identified. There were 27274 genes co-expressed in the 8 cultivars. The PCA and differential gene expression cluster analyses showed that the differences on the function expressions between the genes of SJ and CYB was less than those between ZH and other cultivars. SJ and CYB were clustered in a category and HX, CH, XZ, CY, and ZX in a different category, while ZH significantly differentiated from the other cultivars.Conclusion The substantial amount of transcription data secured from this study could be useful for the classification as well as the expression and identification of functional genes of guava germplasms.
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Keywords:
- Psidium guajava Linn. /
- transcriptome /
- sequencing /
- functional annotation
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0. 引言
【研究意义】番石榴（Psidium guajava Linn.）原产于南美洲大陆，广泛栽植于热带亚热带地区，在我国华南各地也均有栽培，是重要的药食同源植物。番石榴营养丰富，风味独特, 在水果市场特别是饮料市场上占有重要的地位，近年来市场对番石榴果汁的需求量也在快速增长。同时，番石榴作为传统药用植物在美洲、非洲和亚洲等地被用于治疗腹泻、痢疾和皮炎等疾病[1]。番石榴中大量的酚类、类胡萝卜素、萜类和三萜类等已经被证实具有抗氧化[2]、保肝[3,4]、抗过敏[5]、抗菌[6,7]、抗细胞毒性[8,9]、抗龋齿[10,11]、抗糖尿病[2,12]、抗炎症[13]等用途，并且已经广泛应用到临床。【前人研究进展】目前对于番石榴的研究多集中在采后生理[14-17]、内含物萃取[18-20]、药用价值[21]以及果汁产品的开发[22,23]等方面。【本研究切入点】关于番石榴植株本身营养成分富集和有效药用成分积累的机理和相关功能基因的研究还鲜见报道。在美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information）数据库中番石榴仅有132个基因和84个蛋白质信息，这极大地阻碍了番石榴生物技术相关研究的开展。因此，通过高通量测序平台获得番石榴转录组信息，可以为番石榴后续功能基因的鉴定提供参考。【拟解决的关键问题】本试验通过Illumina HiSeq 2500高通量测序平台对8个番石榴品种进行转录组测序，利用公共数据库对测序结果进行生物信息学分析，旨在为番石榴酚类、萜类、多糖类等生物合成途径功能基因的开发奠定基础。利用高通量测序分析8个番石榴种质资源之间的基因表达情况，通过生物信息学分析找寻其内在联系，同时为番石榴分子机制相关研究提供丰富的数据资源。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本试验8个番石榴（Psidium guajava Linn.）品种果实来源于福建省农业科学院果树研究所，包括红心（HX）、彩虹（CH）、紫红（ZH）、水晶（SJ）、秀珍（XZ）、彩叶变（CYB）、彩叶（CY）和紫星（ZX）等。8～9分成熟果实采摘，洗净晾干切块装入冻存管，投入液氮保存备用。液氮保存的样品交由杭州祥音生物医药科技有限公司进行文库构建及测序。
1.2 番石榴文库构建及转录组测序
采用Trizol 法分别提取总RNA，分别采用Nanodrop、Qubit 2.0、Aglient 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等。用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（Random hexamers）合成第一条cDNA链，加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二条cDNA链，利用AMPure XP beads纯化cDNA。纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，AMPure XP beads进行片段大小选择，最后通过PCR富集得到cDNA文库。
通过Illumina HiSeq 2500测序平台和PE125测序方法对番石榴构建转录组文库后进行测序，测序得到的原始图像数据经base calling 转化为原始数据（Raw reads），使用FastQC软件对原始数据进行质量评估。Trimmomatic软件[24]质量剪切获得Clean数据。最后利用Trinity软件[25]de novo组装成转录本，统计所得转录本的各项信息。
1.3 番石榴基因功能注释
使用NCBI Blast+软件[26]将转录本与保守结构域数据库CDD (Conserved domain database)、真核生物蛋白质同源数据库 KOG（Karyotic ortholog groups）、蛋白质直系同源数据库COG（Cluster of orthologous groups）、非冗余蛋白数据库NR（Non-redundant protein database）、核酸序列数据库NT (NCBI nucleotide sequences)、蛋白质结构域数据库 PFAM (Protein family database)、蛋白质序列数据库Swiss-Prot (A manually annotated and reviewed protein sequence database)、Swiss-Prot增补本TrEMBL数据库等多个数据库进行比对，得到转录本的注释信息。根据转录本与Swissprot、TrEMBL的注释结果得到基因本体论数据库GO (Gene ontology) 功能注释信息。利用KAAS软件得到转录本在东京基因与基金组百科全书数据库KEGG (Kyoto encyclopedia of genes and genomes)注释信息。根据转录本与数据库Blast比对结果和TransDecoder软件进行CDS预测。
1.4 番石榴RNA-seq测序质量评估
使用Bowtie 2软件[27]将样本有效数据比对到拼接所得的转录本上，统计Mapping信息。利用RSeQC软件[28]根据比对结果进行冗余序列分析、插入片段分布等分析。BEDTools[29]进行均一性分布检查和基因覆盖率统计分析。
1.5 基因表达及基因富集分析
使用Salmon[30]和WGCNA[31]分别进行基因的表达量计算和基因共表达分析。基于样本的表达量矩阵进行样本比较分析等多方向的统计分析和探索。使用DESeq2[32]进行基因表达差异分析，对表达差异分析结果进行可视化。基于差异分析结果，绘制基因功能表达韦恩图、样本间距离热图，并进行主成分分析（Principle component analysis，PCA）。使用topGO进行GO富集分析。使用clusterProfiler[33]进行KEGG通路和KOG分类富集分析。
2. 结果与分析
2.1 番石榴RNA-seq测序结果与数据组装
2.1.1 RNA-seq测序质量评估
8个品种的总碱基数为5 184 950 713～8 029 343 436 bp，平均7 014 638 271 bp。Read均长为144～146 bp，平均145 bp；GC含量为49.98%～51.23%，平均50.48%；Q30为95.31%～95.96%，平均50.48%（表1）。可见，所获得的转录组质量较高。
表 1 样本质量控制数据统计Table 1. Statistics on quality control data of samples品种
Cultivars总碱基数
Number of bases/bpReads/bp Q30/% GC/% 红心HX 7123935342 145 95.96 49.98 彩虹CH 8029343436 144 95.47 50.68 紫红ZH 6300972075 145 95.57 50.10 水晶SJ 7681478290 145 95.60 51.23 秀珍XZ 5184950713 144 95.31 50.27 彩叶变CYB 7824848106 146 95.82 50.65 彩叶CY 7607494989 144 95.35 50.44 紫星ZX 6364083214 144 95.50 50.49 2.1.2 RNA-seq测序数据组装
组装共获得283 853条 Transcript。总序列信息达388 691 331 bp（0.39 Gb），平均长度1 369 bp，Transcript的N50为2 517 bp，N90为579 bp。其中长度为200～300 、300～500、500～1 000、1000～2000 、≥2 000 bp分别占23.31%、15.92%、16.20%、19.73%、24.83%。所得Transcript序列再次组装后得到126 979 条 Unigene，Unigene总序列信息达97 373 299 bp（97.37 Mb），平均长度766 bp，各长度分布图如图1所示长度为200～300、300～500、500～1000 、1000～2000、≥2000 bp分别占42.81%、23.23%、14.56%、9.40%、9.99%。Unigene的N50为1654 bp，N90为267 bp，组装完整性较高。番石榴转录组测序结果的isoform分析表明100 373 个Unigene含有1个isoform，占比79.05%；含有2个isoforms的数量次之，共8 109个Unigene，占比6.39%；含有3个及以上isoforms的Unigene共有18 497 个，占比14.57%。
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图 1 Transcript（A）和Unigene（B）长度分布Figure 1. Distributions of transcript length (A) and Unigene length (B)2.1.3 SSR与SNP分析
8个番石榴品种含有SSR位点的Unigene共30265个，其中含有单碱基重复（p1）类型的Unigene最多，共15432个，占总数的50.99 %；双碱基重复（p2）类型的Unigene共7614个，三碱基重复（p3）类型的Unigene有3846个，四碱基重复（p4）类型的Unigene共314个，五碱基重复（p5）类型的Unigene共104个，六碱基重复（p6）类型的Unigene共68个。含有至少2个SSR位点的Unigene共2887个，含有至少2个位点且存在共用碱基的类型有172个。
8个番石榴品种发生单核苷酸变异的基因个数在42 941～77 098，发生片段插入或片段缺失的基因个数在13 780～18 435。其中HX发生变异数量最多，SJ发生变异数量最少。
2.2 番石榴Unigene功能注释
2.2.1 NR数据库比对注释
共有82 283个Unigene被注释到NR数据库（图2），占所有基因数目的64.8%。NR功能注释匹配的物种中26 007个Unigene（31.63%）与巨桉（Eucalyptus grandis）得到匹配，与番石榴同为桃金娘科（Myrtaceae Juss.）。其中E值小于1E-150 的Unigene有9 066个（11.03%），E值介于1E-100 到1E-150 之间的Unigene有5 516个（6.71%），E值介于1E-50 到1E-100 的Unigene有12 782个（15.54%），E值介于1E-5到1E-50的Unigene有54 905个（66.77%）。匹配序列相似度80%以上的Unigene有50 798个（61.78%），相似度40%～80%的Unigene有30 860个（37.53%），相似度低于40%的Unigene有625个（0.76%）。
2.2.2 GO功能分类
GO功能分类注释结果（图3）：21 414个Unigene被分为3个本体71个功能组，共计787 311个GO条目。其中222 806个GO条目被分类到细胞组分的22个功能组中，细胞（55 714个，18.62%）、细胞部分（55 636个，18.59%）、细胞器（44 023个，14.71%）和膜（31 509个，10.53%）功能组中涉及的Unigene较多；185 476个GO条目分类到22个分子功能组，其中结合活性（44 261个，40.00%）和催化活性（34 292个，30.99%）功能组中涉及的Unigene较多；374 139个GO条目被分类到27个生物学过程功能组，细胞进程（51 000个，13.51%）、单一生物进程（41 616个，11.03%）以及代谢进程（40 882个，10.83%）功能组中涉及的Unigene较多。
2.2.3 KOG功能分类
将番石榴Unigene与KOG数据库进行比对（图4），并对其结果进行功能分类统计其中信号转导机制注释到最多，共计5 577个，占比15.72%；其次是一般功能预测3 726个，占比10.50%；以及翻译后修饰、蛋白折叠和分子伴侣3 072个，占比8.66%。
2.2.4 KEGG功能分类
番石榴7 236个Unigene在KEGG数据库中的比对结果如图5所示。306个代谢途径中得到注释，其中核糖体途径（ko03010，Ribosome）被注释到500个Unigene，氨基酸生物合成途径（ko01230，Biosynthesis of amino acids）注释到264个Unigene，碳代谢途径（ko01200，Carbon metabolism）注释到260个Unigene。
2.3 番石榴PCA主成分与相关性及聚类分析
通过R包vegan构建番石榴8个品种间的PCA分析结果如图6所示。SJ和CYB在PCA 3D中直线距离均为最短，表明其主成分相似性最高；而品种CH和CY在两个3D图中距离均较远，表明其主成分之间相似性不高；在PCoA 3D中品种之间被分成4个区域，ZX、HX、XZ、和CH之间距离较近分布在一个区域，SJ和CYB分布在一侧，而品种CY和ZH距离前2个区域的品种距离较远，被划分到不同区域。
使用统计算法bray curtis计算样本间距离，然后进行层次聚类(Hierarchical cluatering)分析，构建树状结构，得到树状关系形式用于可视化分析。通过R包gplots构建番石榴样本间距离热图（图7），8个样品间距离分布在0.21～0.52；其中SJ和CYB归为一类，两者间距离为0.3；其余6个品种归为一类，但品种ZH与所有品种的距离在0.37～0.49，距离较远；而HX、CH、XZ、ZX和CY等5个品种的距离在0.21～0.29，距离较近，相似度较高。
2.4 番石榴品种间基因共表达分析
使用R包VennDiagram对8个番石榴品种共有的和独有的表达基因 （TPM > 0）的数目进行VENN图绘制（图8），直观的展现出样本中的表达基因数目组成相似性及重叠情况。8个番石榴品种含有27274个基因为共有的表达基因，而非重叠区表示不同样本之间特有的表达基因数。8个品种的特有表达基因数为1197（SJ）～5128（CH）。
2.5 番石榴8个品种间基因表达差异统计分析
8个番石榴品种进行基因差异表达分析结果（表2）表明：上调表达基因数为1994（CYB vs CY）~13355（CH vs HX），平均数为4 451；下调表达基因数为1 896（CH vs HX）~11 471（SJ vs ZH）之间，平均数为6 898；非差异基因数为109 549（SJ vs ZH）~118 012（CYB vs CY），平均数115 629。KEGG富集途径分析表明：仅HX vs SJ未富集核糖体途径，其余组别均富集该途径；仅HX vs CH未富集碳代谢途径；仅ZH vs ZX及HX vs CH未富集氨基酸生物合成途径；仅HX vs SJ及ZH vs ZX富集淀粉和蔗糖代谢途径。
表 2 番石榴8个品种间基因表达差异统计分析Table 2. Statistical analysis on gene expressions of 8 guava cultivars对照组
CK试验组
Experimental
cultivars上调基因数
Up-regulatory
genes下调基因数
Down-regulatory
genesKEGG富集途径
KEGG pathway1 2 3 4 SJ ZX 2601 8289 Y Y Y N SJ ZH 5959 11471 Y Y Y N SJ CH 1996 7354 Y Y Y N SJ XZ 1994 7178 Y Y Y N CYB CY 2640 6327 Y Y Y N SJ HX 2187 8443 N Y Y Y ZX ZH 4876 4232 Y Y N Y CH HX 13355 1896 Y N N N 注：KEGG富集途径1：核糖体；2：碳代谢；3：氨基酸生物合成；4：淀粉和蔗糖代谢。Y表示富集到该代谢途径，N表示未富集到该代谢途径。
Note: KEGG pathway 1: ribosome; 2: carbon metabolism; 3: amino acid biosynthesis; 4: starch and sucrose metabolisms; Y: enriched; N: non-enriched.3. 讨论与结论
番石榴为桃金娘科常绿木本植物，具有较高的食用和药用价值。本研究较为系统地研究了番石榴的转录组，获得了大量的Clean data，其中Q30和GC含量分析结果均符合要求。此外，在Nr、KOG、GO、KEGG等数据库中，大量Unigene得到有效注释，组装的N50和N90参数分别为2 517 bp和579 bp。此外，还获得了大量番石榴SSR和SNP标记。整体上，本研究所构建的转录组文库较为可靠和准确，具有较高的参考价值，可为后续研究提供科学参考。
转录组分析可为揭示植物品种间的特征差异形成机理提供重要的技术手段。目前，番石榴的转录组相关方面的研究较少[34]。本试验中，通过转录组分析发现水晶（SJ）和彩叶变（CYB）聚为一类，红心（HX）、彩虹（CH）、秀珍（XZ）、彩叶（CY）、紫星（ZX）归为一类，但品种紫红（ZH）与其他品种间距离较远。说明紫红品种的分子特征较为特殊，而水晶和彩叶变的亲缘关系较近，其余红心（HX）、彩虹（CH）、秀珍（XZ）、彩叶（CY）和紫星（ZX）的亲缘关系较近。聚类树状图与前期基于果实性状的研究结果较为一致[35]，为番石榴种质资源分类提供了一定的参考。例如水晶（SJ）和彩叶变（CYB）的果皮颜色均为黄绿色；仅紫红（ZH）的果颜色为紫红色。在代谢途径差异方面，不同品种中富集的代谢途径并不完全一致，是导致品种果实间差异的重要原因，在后续分析中，仍需要进一步结合品种特性，关联转录组分析结果更加系统地揭示形成品种间性状差异的分子机理。
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图 1 Transcript（A）和Unigene（B）长度分布
Figure 1. Distributions of transcript length (A) and Unigene length (B)
表 1 样本质量控制数据统计
Table 1 Statistics on quality control data of samples
品种
Cultivars总碱基数
Number of bases/bpReads/bp Q30/% GC/% 红心HX 7123935342 145 95.96 49.98 彩虹CH 8029343436 144 95.47 50.68 紫红ZH 6300972075 145 95.57 50.10 水晶SJ 7681478290 145 95.60 51.23 秀珍XZ 5184950713 144 95.31 50.27 彩叶变CYB 7824848106 146 95.82 50.65 彩叶CY 7607494989 144 95.35 50.44 紫星ZX 6364083214 144 95.50 50.49 
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表 2 番石榴8个品种间基因表达差异统计分析
Table 2 Statistical analysis on gene expressions of 8 guava cultivars
对照组
CK试验组
Experimental
cultivars上调基因数
Up-regulatory
genes下调基因数
Down-regulatory
genesKEGG富集途径
KEGG pathway1 2 3 4 SJ ZX 2601 8289 Y Y Y N SJ ZH 5959 11471 Y Y Y N SJ CH 1996 7354 Y Y Y N SJ XZ 1994 7178 Y Y Y N CYB CY 2640 6327 Y Y Y N SJ HX 2187 8443 N Y Y Y ZX ZH 4876 4232 Y Y N Y CH HX 13355 1896 Y N N N 注：KEGG富集途径1：核糖体；2：碳代谢；3：氨基酸生物合成；4：淀粉和蔗糖代谢。Y表示富集到该代谢途径，N表示未富集到该代谢途径。
Note: KEGG pathway 1: ribosome; 2: carbon metabolism; 3: amino acid biosynthesis; 4: starch and sucrose metabolisms; Y: enriched; N: non-enriched.
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