Enhanced Thermophilic α-Cyclodextrin Glycosyltransferase Expression by Optimizing Target Signal Peptide in Bacillus subtilis
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摘要:目的 探索嗜热α-环糊精葡萄糖基转移酶（α-CGTase）在枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis RIK1285）中的高效胞外表达条件。方法 以来源于枯草芽胞杆菌的173种信号肽为基础构建信号肽文库，筛选获得9条表达效率更高的信号肽，其中citH信号肽引导分泌效率最高。在此基础上，为进一步优化α-CGTase的分泌表达，对信号肽citH的Gly2、Asn3及Thr4进行饱和突变，并比较不同突变体的引导分泌效率。结果 突变体G2R-N3K-T4L-CGT的引导分泌效率最高，重组枯草芽胞杆菌的胞外α-CGTase活力高达（14.2±0.11 ）U·mL−1，相比未突变信号肽[（9.6±0.29 ）U·mL−1]，分泌效率提高了47.9%；是野生菌株嗜热地芽胞杆菌Geobacillus caldoxylosilyticus.CHB1（0.66 U·mL−1）的21.5倍。重组α-CGTase的最适反应pH值为6.0，最适反应温度为60 ℃，在50 ℃以内稳定；Mg2+、Ca2+对α-环糊精酶活性具有一定的激活作用。结论 信号肽对环糊精酶在芽胞杆菌中的高效表达具有重要影响，为外源蛋白在芽胞杆菌中的表达提供一定借鉴。
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关键词:
- 信号肽 /
- α-环糊精葡萄糖基转移酶 /
- 饱和突变 /
- 枯草芽胞杆菌
Abstract:Objective Conditions to achieve high-efficiency secretory expression of the thermophilic α-cyclodextrin glucosyltransferase (α-CGTase) in Bacillus subtilis RIK1285 were explored to understand the role played by signal peptide.Method A library based on 173 signal peptides from B. subtilis was constructed to identify the highest secretion efficiency candidate. Using the saturation mutagenesis of segments in the selected signal peptide, the secretion expression of α-CGTase was enhanced.Result There were 9 signal peptides with high expression efficiency identified from the library. Among them, the signal peptide citH showed the highest secretion efficiency. Subsequently, the saturation mutagenesis of Gly2, Asn3, and Thr4 of citH produced a mutant, G2R-N3K-T4L-CGT, with an extracellular activity of α-CGTase as high as 14.2 U·mL−1 and a secretion efficiency increased by 47.9% over the non-mutated signal peptide (9.6 U·mL−1), which was 21.5 times higher than that of the wild-type Geobacillus caldoxylosilyticus CHB1 (0.66 U·mL−1). The purified α-CGTase had a maximal activity at pH 6.0 and 60 ℃, was thermally stable within 50 ℃, and could be activated by Mg2+ and Ca2+.Conclusion The important effect signal peptide had on the high-efficiency expression of cyclodextrinase in B. subtilis was verified. The result provided a new and valuable reference for studies on the expression of extraneous proteins in the bacteria. -
0. 引言
【研究意义】水稻是我国乃至全球的重要主粮作物之一，它为我们提供了大量的食物能量和营养，尤其是在中国、印度和其他东南亚国家，无论是平原还是丘陵山区，都有水稻种植。水稻主要害虫稻飞虱属半翅目（Hemiptera）飞虱科（Delphacidae），在全球水稻产区常暴发成灾，严重影响全球粮食安全[1]。化学农药的普遍持续、不合理施用，使得稻飞虱对多种杀虫剂，如对烟碱类、机磷类、氨基甲酸酯类等农药产生抗药性[2,3]，部分褐飞虱种群对新烟碱类药剂噻虫嗪、吡虫啉和昆虫生长调节剂类药剂噻嗪酮处于高水平抗性（抗性倍数分别为＞800倍、＞
2000 倍、＞1000 倍）[4]，致使这些农药丧失了使用价值。化学农药不仅产生抗药性、污染环境和再猖獗的“3R”问题，还使田间自然天敌种群受到严重损害，天敌的缺乏往往导致害虫失去有效控制而暴发成灾。随着人们对无公害无污染及有机农产品需求量的增加，开展利用天敌防治稻飞虱的工作，对确保生产安全与质量安全、保障人们饮食健康具有重要意义。【前人研究进展】稻虱缨小蜂（Anagrus nilaparvatae Pang et Wang）分布广泛，在海南、广东、浙江、福建、湖南等主要水稻产区均为稻飞虱的卵期优势寄生蜂[5−6]，对稻飞虱的寄生率最高可达80%以上[7,8−9]，对褐飞虱（Nilaparvata lugens）、白背飞虱（Sogatella furcifera）和灰飞虱（Laodelphax striatellus）均有明显的控制作用[10,11−12]，是控制稻飞虱田间种群数量的关键生物因子，具有广阔的生防应用前景[13,14]。稻虱缨小蜂寄主很多，可寄生褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱、稗飞虱、拟褐飞虱、伪褐飞虱、黑边黄脊飞虱、黑面黄脊飞虱等，较多的过渡寄主有利于其在主要寄主缺乏时保存一定的种群数量[15]。稻虱缨小蜂受环境及寄主等因素的影响。模拟干旱胁迫可降低对褐飞虱的寄生力和选择性[16]。稻虱缨小蜂对不同卵龄的寄主喜好程度不一样，偏好寄生1～4 d卵龄的褐飞虱卵，且更偏好寄生受精卵[17]。稻虱缨小蜂寻找寄主受稻飞虱的化学信息素影响，褐飞虱取食后诱导的水稻挥发物对稻虱缨小蜂有明显的引诱作用[18]。稻虱缨小蜂喜欢寄生稻株下部叶位组织内的灰飞虱、白背飞虱卵[19]。当只有白背飞虱和褐飞虱卵时，稻虱缨小蜂对褐飞虱有明显的偏好[20]。稻虱缨小蜂的怀卵量和虫体大小与褐飞虱卵粒大小呈极显著正相关[21]。水稻挥发物、稻飞虱利它素及飞虱卵的形态特征在稻虱缨小蜂识别褐飞虱和白背飞虱卵中的作用不明显[22]，羽化率和雌雄性比则不受寄主卵龄的影响[23]。以褐飞虱为寄主的净生殖力R0大于以白背飞虱为寄主的净生殖力，以褐飞虱为寄主的稻虱缨小蜂具有较强的室内繁蜂潜能，可用于室内繁蜂[9]。【本研究切入点】稻虱缨小蜂田间种群的发展滞后于稻飞虱，在稻飞虱迁入稻田早期，稻虱缨小蜂群体数量较少，不足以控制稻飞虱的繁殖。若用人工饲养的稻虱缨小蜂进行田间释放，弥补自然种群的不足，则有望实现生物防治达到控害的目的。以往研究者虽然对稻虱缨小蜂的寄主选择性已有较多研究，但对于适合作为冷藏寄主的灰飞虱和小宽头飞虱（Ishiharodelphax matsuyamensis)却未见适合度方面的报道，因此，需要全面了解繁殖寄主和冷藏寄主对稻虱缨小蜂的影响。【拟解决的关键问题】通过比较稻虱缨小蜂在褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱和小宽头飞虱4种寄主上的适合度，为稻虱缨小蜂的室内人工规模化饲养提供理论依据。1. 材料与方法
1.1 供试材料
稻虱缨小蜂于2018年采集自福建省农业科学院水稻研究所试验稻田，不同寄主稻虱缨小蜂品系分别用相应寄主连续继代繁殖。寄主褐飞虱记为Nl，白背飞虱记为Sf，灰飞虱记为Ls，小宽头飞虱记为Im。以褐飞虱为寄主繁殖的稻虱缨小蜂品系记为AnNl；以白背飞虱为寄主的记为AnSf；以灰飞虱为寄主的记为AnLs，以小宽头飞虱为寄主的记为AnIm。
水稻品种TN1采用水培法种植，营养液为青岛高科技工业园海博生物技术有限公司生产的霍格兰营养液，沟叶结缕草[Zoysia matrella (L.) Merr.]采用匍匐茎扦插繁殖，扦插前插条在显微镜下检查，确保不携带其他昆虫。TN1用于褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱的饲养，沟叶结缕草用于小宽头飞虱的饲养。水稻苗和沟叶结缕草的生长条件：温度（26±3） ℃、光周期16 h 光∶8 h 暗、相对湿度（ 80±10）%，TN1生长20～40 d，沟叶结缕草生长40 d以上。
1.2 试验方法
1.2.1 不同寄主稻虱缨小蜂品系形体的测量
分别将不同寄主繁育的7 d龄幼虫稻虱缨小蜂（已转色）用镊子挑出，放在载玻片上并置于体视显微镜（OLYMPUS型号SZ61TR）下拍照，其余的寄生卵置于无菌滤纸保湿的培养皿中培养，羽化后，用体视显微镜（OLYMPUS型号SZ61TR，精度1 µm）测量雌成虫的体长和腹部长度。体长和腹部长度的测量方法：将虫体摆放成直线状态，头部垂直于身体，体长为触角基部到腹部末端（不包括产卵器）的长度，腹部长度为胸部与腹部的交界处到腹部末端（不包括产卵器）的长度，每次测量10头稻虱缨小蜂，重复3次。测量后，用解剖针将雌成虫腹部剖开，置于倒置显微镜（INVERTED MICROSCOPE 型号BDS400）下计数具柄状椭圆形卵的数量。
1.2.2 稻虱缨小蜂在不同寄主上的适合度
将水稻苗和沟叶结缕草除去黄叶老叶，接入产卵盛期（腹部明显彭大）的对应飞虱（水稻苗接入褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱，沟叶结缕草接入小宽头飞虱），每棵寄主植株接入2只飞虱，用直径20 mm、长20 cm亚克力圆管罩住，上端用100目尼龙网封口，产卵3 d后，移除飞虱成虫，接入当天羽化的稻虱缨小蜂1对（雌、雄各1只为1对），在温度26 ℃、相对湿度（80±10）%和光周期14 h光∶10 h暗条件下让其自然寄生，直至稻虱缨小蜂死亡。7 d后，用0.1%甲醛溶液表面消毒后，在体视显微镜下，将被寄生的飞虱卵（被稻虱缨小蜂寄生过的飞虱卵呈橙黄色或黄绿色）用灭菌镊子全部挑出，置于无菌载玻片上，放在直径9 cm铺有灭菌滤纸的培养皿里，加适量灭菌蒸馏水保湿培养，培养条件：温度26 ℃、相对湿度（80±10）%，14 h光∶10 h暗。羽化后每天记载羽化数量和性比，并将当天羽化的稻虱缨小蜂配对后转移到前一天产过对应飞虱卵的新寄主植物上，让其寄生，7 d后剥查寄生数量（呈橙黄色或黄绿色卵的数量），调查繁殖力（每只雌蜂寄生飞虱卵的数量）。其余稻虱缨小蜂转移至新培养皿，每天记载羽化数量，并将刚羽化的成虫用自制无损伤昆虫转移器（专利号：ZL2022230627962）转移至另一培养皿中，每天记载死亡数量，观察成虫寿命（从羽化到死亡的时间）。每个处理调查5棵苗，并重复3次。
1.2.3 稻虱缨小蜂的寄主偏好
TN1水稻苗和沟叶结缕草种植于规格为1 000 mL的一次性塑料杯中，土培，每杯种植3株，呈一字排列，间隔2 cm。生长25 d后，TN1上分别接入怀卵寄主褐飞虱（Nl）、白背飞虱（Sf）和灰飞虱（Ls），沟叶结缕草上接入怀卵寄主小宽头飞虱（Im）；3 d后收集携带有飞虱卵的植株，用于后续试验。将不同品系的幼虫期稻虱缨小蜂挑出置于培养皿中保湿培养，稻虱缨小蜂羽化当天上午10:00记载羽化数量后打开培养皿盖子，将上述携带有飞虱卵的植株摆放于培养皿四周。每个品系稻虱缨小蜂1个培养皿，四周摆放4个寄主植株各1杯，以培养皿为中心，距离50 cm，平均分布。30 min后观察并记载各个寄主植株上的缨小蜂数量，4次重复，重复之间的寄主植株的位置随机摆放。
1.2.4 不同寄主品系的稻虱缨小蜂种群生命表
接蜂寄生和观察方法同1.2.2。接蜂当天为生命表X的起点，试验设20个重复，即每个品系接蜂20对，平均寄生数量作为产卵基数。接蜂7 d后将寄生卵挑出置培养皿保湿培养，每天记载羽化数、雌雄数量和死亡数，连续观察记载16 d。
生命表参数的计算公式（参照刘树生[24]的方法）：
净生殖力：R0=∑lxmx； 平均世代周期：T=∑xlxmxR0； 内禀增长率：rm=lnR0/T； 周限增长率：λ=erm。 1.2.5 数据处理与统计分析
采用Excel 2019进行数据整理，SPSS 27.0软件进行统计分析，多重比较采用沃勒-邓肯进行。数值采用平均值±标准误（mean±SE）表示，P值小于0.05表示差异达显著水平，图表中的不同英文小写字母表示在0.05水平下差异显著。
2. 结果与分析
2.1 不同寄主对稻虱缨小蜂形态的影响
幼虫体色：寄生在褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱上的稻虱缨小蜂幼虫和蛹体色呈浅橙色，少数黄绿色；灰飞虱上的也呈浅橙色，但较褐飞虱和白背飞虱的颜色更深；寄生在小宽头飞虱上的颜色最深，呈橙红色，无黄绿色个体（图1）。
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图 1 不同寄主稻虱缨小蜂品系的幼虫形态特征A：褐飞虱品系；B：白背飞虱品系；C：灰飞虱品系；D：小宽头飞虱品系。Figure 1. Morphology of An larvaeA: AnNl；B: AnSf；C: AnLs；D: AnIm.形体大小：不同寄主稻虱缨小蜂品系的体长存在显著差异（F=
238.0670 ，df=3，P=0.0001 ）。寄生在褐飞虱和白背飞虱上的稻虱缨小蜂体长差异不显著，但均极显著长于寄生在灰飞虱和小宽头飞虱上的稻虱缨小蜂，小宽头飞虱上的体长最短（图2）。寄生在4种寄主上稻虱缨小蜂的体长分别为：褐飞虱（728.03±10.85） μm，白背飞虱（715.5±10.89） μm，灰飞虱（633.17±7.92） μm，小宽头飞虱（509.1±14.59） μm。寄生在4种寄主上稻虱缨小蜂的腹部长度差异也存在显著差异（F=81.5090 ，df=3，P=0.0001 ）（图3），腹部由长到短为褐飞虱（145.70±2.91）μm、白背飞虱（141.80±2.41）μm、灰飞虱（141.00±2.33）μm、小宽头飞虱（111.77±4.06）μm。![]()
图 2 不同寄主稻虱缨小蜂品系的成虫体长不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。下同。Figure 2. Length of adult An bodyDifferent lowercase letters indicate significant difference among treatments (P<0.05). Same for below.2.2 不同寄主稻虱缨小蜂品系的怀卵量和寄生力
寄生在不同寄主上的稻虱缨小蜂怀卵量分别为：褐飞虱32.93粒、白背飞虱32.97粒、灰飞虱27.47粒和小宽头飞虱11.83粒，除褐飞虱和白背飞虱寄主的怀卵量无显著差异外，不同品系怀卵量之间存在显著差异（F=
128.5950 ，df=3，P=0.0001 ）（图4），褐飞虱和白背飞虱为寄主的怀卵量是灰飞虱的1.20倍，是小宽头飞虱的2.78倍。经两因素方差分析，稻虱缨小蜂的相同品系（用同一寄主繁殖出来的稻虱缨小蜂）在不同寄主上的寄生力差异不显著（F寄主=1.243，df寄主=3，df品系=3，P寄主=0.310），不同蜂品系对稻虱缨小蜂寄生力的影响有显著差异（F品系=
4053.275 ，df品系=3，df寄主=3，P品系=0.000）。不同蜂品系对稻虱缨小蜂寄生力的影响见图5，以褐飞虱和白背飞虱为寄主繁殖的品系之间的寄生力无显著差异，但均显著高于灰飞虱和小宽头飞虱为寄主的品系，灰飞虱为寄主的品系寄生力显著高于小宽头飞虱品系的寄生力。2.3 不同寄主对羽化率、性比和成虫寿命的影响
4种寄主对稻虱缨小蜂的羽化率、性比和成虫寿命的影响见表1。由表1可知，不同寄主对稻虱缨小蜂羽化率的影响差异不显著（F=
0.1160 ，df=3，P=0.9493 ），稻虱缨小蜂在4种寄主上的羽化率均很高，羽化率在96%以上。不同寄主稻虱缨小蜂的性比差异也不显著（F=1.1900 ，df=3，P=0.3499 ），雌性比例由高到低为小宽头飞虱＞褐飞虱＞灰飞虱＞白背飞虱。不同寄主对稻虱缨小蜂成虫寿命的影响不显著（F寿命=0.1640 ，df寿命=3，P寿命=0.9176 ），成虫寿命在26 ℃条件下均在3 d左右。表 1 不同寄主稻虱缨小蜂品系的羽化率、雌成虫比例和成虫寿命Table 1. Emergence rate, proportion of female adults, and lifespan of Ans寄主
Host羽化率
Eclosion rate/%雌成虫比例
Female percentages/%成虫寿命
Adult lifespan/d褐飞虱
N. lugens96.34±0.49a 51.48±0.17a 3.03±0.02a 白背飞虱
S. furcifera96.48±0.40a 51.19±0.16a 3.00±0.03a 灰飞虱
L. striatellus96.11±0.46a 51.42±0.21a 2.98±0.10a 小宽头飞虱
I. matsuyamensis96.34±0.47a 51.83±0.37a 3.00±0.11a 2.4 不同寄主稻虱缨小蜂品系的寄主偏好性
稻虱缨小蜂的寄主选择试验结果显示，褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱和小宽头飞虱等4种稻虱缨小蜂品系对不同寄主的趋性差异不显著（图6）（经两因素方差分析，F品系=0.229，df品系=3，df寄主=3，P品系=0.876；F寄主=0.405，df寄主=3，df品系=3，P寄主=0.750），表明不同寄主繁育的稻虱缨小蜂对寄主的选择是随机的，并不表现出对某一寄主的偏好。
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图 6 不同寄主卵繁育的稻虱缨小蜂对寄主卵的偏好性Figure 6. Oviposition preference of Ans emerged from different hosts2.5 不同寄主对稻虱缨小蜂种群参数的影响
净增殖率R0表示种群经过一个世代后的增殖倍数，由表2可知，以褐飞虱为寄主的稻虱缨小蜂净增殖率最高，其次是白背飞虱，然后是灰飞虱，小宽头飞虱的最小。内禀增长率rm和周限增长率λ也是褐飞虱＞白背飞虱＞灰飞虱＞小宽头飞虱，褐飞虱和白背飞虱品系是小宽头飞虱品系的3倍以上。
表 2 不同寄主稻虱缨小蜂品系的种群参数Table 2. Population parameters of Ans寄主
Host净增
殖率R0
Net
reproductive
rate平均世代
周期T
Mean
generation
time/d内禀
增长率rm
Intrinsic
rate of
increase周限
增长率λ
Finite rate of
increase褐飞虱
N. lugens5.3144 10.91 0.1531 1.1654 白背飞虱
S. furcifera5.0064 10.87 0.1482 1.1598 灰飞虱
L. striatellus4.1934 10.96 0.1307 1.1397 小宽头飞虱
I. matsuyamensis1.5931 10.91 0.0427 1.0436 3. 讨论与结论
寄主种类和大小对寄生蜂有较大影响。寄生蜂的发育与寄主的营养量有关[25−26]，个体较大的寄主通常繁殖出来的寄生蜂个体也更大[27,28]。以大卵繁育的稻螟赤眼蜂个体大于以小卵繁育的个体[29,30]。松毛虫凸腿小蜂在蛹体质量较大的寄主蛹上繁育出的体长长于个体较小的寄主蛹[31]。本研究也表明，稻虱缨小蜂的个体发育受寄主的影响，寄主个体越大则稻虱缨小蜂的个体也越大，以褐飞虱和白背飞虱为寄主的稻虱缨小蜂个体显著长于灰飞虱和小宽头飞虱为寄主的个体。稻虱缨小蜂不仅个体大小受寄主影响，其体色也明显受寄主影响。以褐飞虱、白背飞虱为寄主的稻虱缨小蜂个体体色较淡，偶有少数幼虫期体色呈黄绿色，但以小宽头飞虱为寄主却未发现有黄绿色的稻虱缨小蜂个体，这种现象是否跟寄主植物有关？黄绿色个体的生物学有无特殊之处？这些问题都有待进一步研究。
寄生蜂的寄主选择偏好受多种因素影响，有多种表现形式。有的寄生蜂会偏好选择寄生与繁殖寄主相同的寄主[32,33]。有的寄生蜂寄主选择性受繁殖寄主种类的影响较小，王娟等[34]报道，2种不同繁殖寄主来源的丽蚜小蜂均偏好寄生温室白粉虱。有的寄生蜂会优先寄生个体较大的寄主[35]。比如日本平腹小蜂偏向于寄生体积较大的柞蚕卵，在体积较小的家蚕卵上则寄生较少[36]。但在本研究中，稻虱缨小蜂在寄主选择上没有表现出偏好性，不同寄主品系稻虱缨小蜂对不同寄主均为随机选择寄生，没有受到繁殖寄主种类和寄主个体大小的影响，这可能是由于褐飞虱、白背飞虱、灰飞虱和小宽头飞虱均是稻虱缨小蜂的自然寄主。
研究表明，以褐飞虱和白背飞虱为寄主的稻虱缨小蜂品系具有体长较长，怀卵量大，内禀增长力高的特点，两者羽化率、性比和寿命差异不显著，且对寄主无明显偏好，是适合的繁殖寄主。灰飞虱和小宽头飞虱虽然内禀增长力较低，但灰飞虱可以以小麦为寄主植物，小麦具有较强的耐寒性；小宽头飞虱的寄主植物沟叶结缕草同样具有较强的耐寒性，而褐飞虱和白背飞虱是单食性昆虫，只以水稻为寄主植物，而水稻不耐冷，不适合于冷藏。冷藏是天敌规模化生产和远距离运输以及延长货架期的关键性环节，可以解决稻虱缨小蜂羽化高峰期与寄主飞虱的产卵期不相遇，造成成蜂的浪费的问题；可以通过冷藏调节缨小蜂的发育进度，使得每一批寄主飞虱卵都可以与缨小蜂的羽化期相吻合，提高繁蜂效率，确保天敌种群数量的充足和稳定；还可以延长货架期保障长距离运输，并且可在稻飞虱迁入产卵期实现同步释放。因此，应以褐飞虱或白背飞虱为寄主进行大规模扩繁，以灰飞虱为寄主小麦为寄主植物或小宽头飞虱为寄主沟叶结缕草为寄主植物进行冷藏，以实现稻虱缨小蜂的室内人工规模化饲养。
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图 1 不同信号肽对目的蛋白的影响
注：图中小写字母表示不同处理在P＜0.05水平下差异显著。下图同。
Figure 1. Effects of signal peptides on target protein production
Note: Data with different letters indicate significant differences among treatments at P＜0.05. Same for following figures.
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图 2 不同信号肽SDS-PAGE 电泳结果
注：M：protein marker；1：对照；2：aprE；3：citH；4：ybdG；5：amyE； 6：nprE； 7：bpr； 8：bglS； 9：bglC； 10：sacB； 11：yweA。
Figure 2. SDS-PAGE analysis on signal peptides
Note: M: protein marker; 1: control; 2: aprE; 3: citH; 4: ybdG；5: amyE; 6: nprE； 7: bpr; 8: bglS； 9：bglC； 10：sacB； 11：yweA.
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图 3 citH信号肽Gly2饱和突变对α-环糊精酶分泌表达的影响
Figure 3. Effect of Gly2 saturation mutation of citH on α-CGTase activity
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图 4 citH信号肽Asn3饱和突变对α-环糊精酶分泌表达的影响
Figure 4. Effect of Asn3 saturation mutation of citH on α-CGTase activity
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图 5 citH信号肽Thr4饱和突变对α-环糊精酶分泌表达的影响
Figure 5. Effect of Thr4 saturation mutation of citH on α-CGTase activity
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图 6 citH信号肽多重突变对α-环糊精酶分泌表达的影响
Figure 6. Effect of multiple mutation of citH on α-CGTase activity
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图 7 不同信号肽的SDS-PAGE 电泳图分析
注：M：Protein Marker；1：对照；2：citH；3：G2R；4：N3K；5：T4L；6：G2R/N3K；7:G2R/T4L；8:N3K/ T4L；9：G2R/N3K/T4L。
Figure 7. SDS-PAGE analysis on signal peptide mutant
Note: M: Protein Marker; 1: control; 2: citH; 3: G2R; 4: N3K；5:T4L; 6: G2R/N3K； 7:G2R/T4L; 8:N3K/ T4L；9：G2R/N3K/T4L.
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图 11 不同金属离子及抑制剂对α-环糊精酶活力的影响
Figure 11. Effect of metal ions and inhibitors on α-CGTase activity
表 1 citH信号肽第二位Gly饱和突变引物
Table 1 Primers for saturated mutation of G2
突变体
Muntants引物名称
Primer name引物序列
Primer sequence(5′–3′)G2F G2F-F
G2F-RAGAGGGACGCGTATGTTCAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTGAACATACGCGTCCCTCTG2M G2M-F
G2M-RAGAGGGACGCGTATGATGAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTCATCATACGCGTCCCTCTG2P G2P-F
G2P-RAGAGGGACGCGTATGCCGAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTCGGCATACGCGTCCCTCTG2A G2A-F
G2A-RAGAGGGACGCGTATGGCAAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTTGCCATACGCGTCCCTCTG2Y G2Y-F
G2Y-RAGAGGGACGCGTATGTATAATACTCGTAAAAAAG
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G2I-RAGAGGGACGCGTATGATTAATACTCGTAAAAAAG
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CTTTTTTACGAGTATTTTCCATACGCGTCCCTCTG2R G2R-F
G2R-RAGAGGGACGCGTATGCGGAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTCCGCATACGCGTCCCTCTG2W G2R-F
G2R-RAGAGGGACGCGTATGTGGAATACTCGTAAAAAAG
CTTTTTTACGAGTATTCCACATACGCGTCCCTCT注：带下划线的碱基序列为突变氨基酸的碱基密码子。
Note: the underlined base is the base codon of the mutant amino acid.
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表 2 信号肽氨基酸序列表
Table 2 Amino acid sequence of signal peptide
信号肽名称
Signal peptide信号肽氨基酸序列
Signal peptide amino acid sequencepBE-aprE-CGT MRSKKLWISLLFALTLIFTMAFSNMSVQA pBE-citH-CGT MGNTRKKVSVIGAGFTGATTAFLIAQKELADV pBE-ybdG-CGT MKTLWKVLKIVFVSLAALVLLVSVS pBE-amyE-CGT MFAKRFKTSLLPLFAGFLLLFHLVLAGPAAASA pBE-nprE-CGT MGLGKKLSVAVAASFMSLSISLPGVQA pBE-bpr-CGT MRKKTKNRLISSVLSTVVISSLLFPGAAGA pBE-bglS-CGT MPYLKRVLLLLVTGLFMSLFAVTATASA pBE-bglC-CGT MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASA pBE-sacB-CGT MNIKKFAKQATVLTFTTALLAGGATQAFA pBE-yweA-CGT MLKRTSFVSSLFISSAVLLSILLPSGQAHA
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期刊类型引用(1)
1. 张居念，施龙清，连玲，吴春珠，董萌，解振兴，姜照伟. 稻虱缨小蜂规模饲养与冷藏技术规程. 福建稻麦科技. 2025(01): 30-33 . 
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