Prediction and Verification of sRNA SdsR Target Genes in Salmonella typhimurium
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摘要:目的 筛选鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR的靶基因，为明确sRNA与靶基因的互作以及沙门菌的致病机制奠定基础。方法 利用TargetRNA2软件预测sRNA SdsR的靶标，基于前期的sRNA SdsR敲除后转录组测序结果，将预测到的基因注释到GO、KEGG以及eggNOG数据库中进行分析，通过RT-qPCR对预测到的杂交能量较高的部分靶基因进行验证。结果 TargetRNA2软件预测到29个靶标，其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC的杂交能量较高，且能与sRNA SdsR有连续的碱基匹配，分别与鼠伤寒沙门菌血红素合成、氧化还原过程、草酰乙酸脱羧酶的合成、膜的组成部分、细胞质蛋白的合成有关。RT-qPCR结果显示，相对于野生菌株3409，敲除sRNA SdsR后hemA、mreC的表达分别下调0.70和0.39倍；STM0951、STM1252、dcoC的表达分别上调0.51、0.35和1.86倍。结论 hemA、 STM0951 、mreC、STM1252 、dcoC基因很可能受sRNA SdsR的直接调控且对某些靶基因的表达有促进作用。
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关键词:
- 鼠伤寒沙门菌 /
- sRNA SdsR /
- TargetRNA2 /
- 靶基因 /
- 转录组测序
Abstract:Objective Target genes of Salmonella Typhimurium sRNA SdsR were investigated to further understand the interactions between the sRNA and the target genes as well as the pathogenic mechanism of S. typhimurium.Method The TargetRNA2 software was used to predict the target of sRNA SdsR in the pathogen. According to the results obtained in a previous sRNA SdsR knock-out transcriptome sequencing study, the predicted genes were annotated into GO, KEGG, and eggNOG databases for analysis. Those with high hybridization energy were further verified by RT-qPCR.Result There were 29 targets predicted by TargetRNA2. Among them, hemA, STM0951, mreC, STM1252, and dcoC showed high hybridization energy with a possibility of having a continuous base to match the sRNA SdsR. They might be associated with the heme synthesis, redox process, oxaloacetate decarboxylase synthesis, and membrane components and cytoplasmic protein synthesis in S. typhimurium. The RT-qPCR showed, after sRNA SdsR knockout, hemA to be downregulated by 0.70 times and mreC 0.39 times, while STM0951, STM1252, and dcoC upregulated by 0.51, 0.35 and 1.86 times, respectively, over the wild strain 3409.Conclusion It appeared that the genes identified in this study, including hemA, STM0951, mreC, STM1252 and dcoC, could directly be regulated by the sRNA SdsR and might affect the expressions of some target genes.-
Keywords:
- Salmonella Typhimurium /
- sRNA SdsR /
- TargetRNA2 /
- target gene /
- transcriptome sequencing
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0. 引言
【研究意义】鼠伤寒沙门菌是一种常见的人畜共患病原菌，对我国的畜禽产业造成了严重的威胁。转录后水平的调控是调节细菌基因表达的重要方式，sRNA通过分子内碱基配对与靶mRNA相互作用，通常通过隔离靶mRNA的核糖体结合位点（RBS）来调节翻译起始[1]。揭示sRNA与靶基因的调控理论，找到沙门氏菌防控新方式，对保障人与畜牧业的健康发展具有重要意义。【前人研究进展】sRNA SdsR以两种形式存在，一种是全长 100 nt sRNA，另一种是经过加工的 70 nt 分子[2]。作为一种基因转录后调节因子，SdsR影响细菌对压力条件的适应、毒力及生物膜形成[3]。SdsR是固定相 sigma 因子 (σS) 调节子的成员，通过有限且不完美的碱基互补配对与靶mRNA结合[4]，结合区域常为相邻的6～8个碱基[5]。Fröhlich等 [6]确定并验证了ompD mRNA为SdsR的直接目标。之后通过SdsR 脉冲表达与全基因组转录组学相结合，发现了 20 个以前未知的 SdsR 候选靶标，其中有18个靶标受SdsR的依赖性调节[7]。【本研究切入点】sdsR基因几乎存在于所有肠杆菌基因组中，说明sRNA一定存在额外的、保守的靶基因。TargetRNA2是建立在TargetRNA[8]、IntaRNA[9]、RNApredator[10]之上的用于识别细菌中被sRNA 调控的mRNA 靶标，其特点是既准确又有效[11]。然而有关鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR靶基因的预测及验证的研究还有待深入进行。【拟解决的关键问题】本研究利用TargetRNA2软件预测sRNA SdsR的潜在靶标，结合前期对sRNA SdsR敲除后的转录组数据，将预测到的部分基因注释到GO、KEGG以及eggNOG数据库中进行分析，并利用RT-qPCR对部分预测靶基因进行验证，筛选出可能受sRNA SdsR直接调控的靶基因，为进一步明确鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR的调控机理奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株及质粒
野生型鼠伤寒沙门菌标准株3409由法国国家科学研究中心（CNRS）分子遗传学Bossi实验室惠赠；SdsR敲除株（基因型为△sdsR::cat）由本实验室构建。
1.1.2 主要试剂及仪器
试剂：RNA提取试剂盒购自贵州卓一生物科技有限公司，反转录试剂盒[Recombinant NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）]及荧光染料AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix均购自宏达尔生物科技有限公司，试剂均为分析纯。
仪器：荧光定量PCR仪（CFX Connect optics Module），美国Bio-RAD 公司；微量核酸测定仪（Nano Photometer NP80），德国Implen公司。
1.2 TargetRNA2预测SdsR靶标
进入TargetRNA2靶基因预测网站（http://cs.wellesley.edu/~btjaden/TargetRNA2/），输入sRNA SdsR序列，分析对象为沙门氏菌肠道亚种，鼠伤寒沙肠杆菌血清型LT2染色体。勾选sRNA conservation and accessibilty。目标参数为从上游80 NTs到mRNA 翻译起始位点下游的20 NTs，sRNA窗口大小为13，杂交种子数为7，P值阈值为0.05，过滤器尺寸为400。点击search，将预测到的结果导出并选择杂交能量最高的5个基因进行后续的试验。
1.3 预测基因的生物学信息分析
本实验室前期已经将鼠伤寒沙门菌sRNA SdsR基因敲除后进行转录组测序。转录组测序结果已注释到GO、KEGG以及eggNOG数据库中。将预测到的靶标定位在测序结果中，分析其涉及的信号通路、所行使的生物学功能、蛋白质功能及其分类。
1.4 预测基因的RT-qPCR验证
选择杂交能量较高的5个预测到的靶基因hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC，对其进行RT-qPCR验证。根据GenBank提供的基因序列设计相应的RT-qPCR引物（表1），送上海生工生物工程有限公司进行合成。以SdsR敲除株为试验组、3409标准株为对照组，提取总RNA样本，反转录成cDNA后进行RT-qPCR试验，反应体系为：2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，50×ROX Reference Dye 1 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.8 μL；反应程序为：95 ℃ 0.5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 0.5 min，39个循环，每个样本重复3次。数据采用2−ΔΔCT法进行处理。将得到的结果结合转录组数据进行分析。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequence引物名称
Primer name序列（5′-3′）
Sequence (5′-3′)预扩增片段长度
Pre-amplified
fragment
length/bphemA-F ACGAATCTGCTCCGACTGAC 200 hemA-R GCAAACTGGCGAACGCTTAT STM0951-F ACATTGAGCGGCGAGAAAGT 116 STM0951-R ACCCACGATGTTATCCCGAC mreC-F ACAACAGCAGCAGATAGCGT 173 mreC-R CGATATTCGCGTTGGCGATG STM1252-F ATGGCGAATCATGGCTACCG 85 STM1252-R ATGCCGCCCTCGCTAATAAT dcoC-F CGGTGCTATTAGGTGAAGGCT 87 dcoC-R GGATGGCGAAAATCAGCAGG GAPDH-F CCCAGATGGGATTAGCTAGTTG 133 GAPDH-R ATTCCCCACTGCTGCCTCCCGT 2. 结果与分析
2.1 sRNA SdsR靶标预测结果
Target RNA2软件预测到29个靶标（表2），其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC的杂交能量较高。hemA编码谷氨酰-tRNA还原酶（Glutamyl-tRNA reductase），STM0951编码细胞质蛋白（Cytoplasmic protein），mreC编码杆状决定蛋白MreC（Rod shape-determining protein MreC），STM1252编码细胞质蛋白（Cytoplasmic protein），dcoC编码草酰乙酸脱羧酶亚基γ（Oxaloacetate decarboxylase subunit gamma）。
表 2 TargetRNA2软件预测结果Table 2. Prediction by TargetRNA2排名
Rank基因ID
Gene ID符号
Symbol能量
EnergyP值
P value1 STM1777 hemA −16.51 0.000 2 STM0951 — −15.39 0.000 3 STM3373 mreC −14.91 0.001 4 STM1252 — −12.84 0.004 5 STM0766 dcoC −11.91 0.008 6 STM3127 — −11.74 0.009 7 STM4500 yjhP −11.69 0.009 8 STM0715 — −11.03 0.013 9 STM1088 pipB −10.89 0.015 10 STM4583 trpR −10.75 0.016 11 STM4599 yjjY −10.68 0.016 12 STM1625 ydcI −10.52 0.018 13 STM0691 — −10.52 0.018 14 STM3543 gntR −10.2 0.021 15 STM0317 gpt −10.2 0.021 16 STM3533 — −10.1 0.022 17 STM0246 metI −10.08 0.022 18 STM1445 slyB −9.89 0.025 19 STM0720 — −9.7 0.027 20 STM4520 — −9.67 0.027 21 STM3888 yieP −9.66 0.027 22 STM2193 folE −9.22 0.034 23 STM1440 sodC −9.2 0.034 24 STM4089 menG −9.14 0.035 25 STM0529 fdrA −8.69 0.042 26 STM3203 ygiM −8.66 0.043 27 STM3803 yidF −8.54 0.045 28 STM3563 livH −8.52 0.046 29 STM0051 rihC −8.43 0.047 杂交能量较高的5个基因的靶位点的预测结果（表3）显示：STM0951与dcoC在5′UTR区域与sRNA SdsR形成了4个连续的碱基互补配对，而hemA、mreC、STM1252则是在CDS区域与sRNA SdsR发生大于7个碱基的连续或不连续的互补配对。该结果说明所选择的5个基因均能与sRNA SdsR形成连续的碱基互补配对，且可能存在其他有待发现的作用机制。
表 3 靶位点预测结果Table 3. Predicted target sitesmRNA 功能
Function靶位点预测
Target site predictionhemA 谷氨酰-tRNA还原酶
Glutamyl-tRNA reductaseSdsR 
59 hemA 20 STM0951 细胞质蛋白
Cytoplasmic proteinSdsR 
61 STM0951 −65 mreC 棒状决定蛋白质
MreC Rod shape-determining protein MreCSdsR 
63 mreC 20 STM1252 细胞质蛋白
Cytoplasmic proteinSdsR 
58 STM1252 19 dcoC 草酰乙酸脱羧酶γ亚基
Oxaloacetate decarboxylase subunit gammaSdsR 
75 dcoC −45 2.2 预测靶基因GO、KEGG和eggNOG数据库注释
将筛选到的5个潜在靶基因注释到GO、KEGG和eggNOG数据库中（表4）。GO数据库注释结果显示，在生物过程方面，hemA主要参与原卟啉原IX生物合成过程、氧化还原过程，STM0951只参与氧化还原过程，mreC影响细胞形状的调节，dcoC参与脂质代谢过程；在细胞成分方面，merC和dcoC同时与膜的组成部分质膜相关；在分子功能方面，hemA和STM0951同时涉及槲皮素 2,3-双加氧酶活性，而dcoC涉及钠离子跨膜转运蛋白活性、草酰乙酸脱羧酶活性、水解酶活性。STM1252的生物学功能未被富集到。KEGG数据库注释结果显示hemA与dcoC分别富集到卟啉和叶绿素代谢途径与丙酮酸代谢途径。eggNOG数据库注释结果显示，筛选出的5个基因均可注释到eggNOG数据库中的直系同源蛋白功能分类。其中hemA、STM0951、mreC、STM1252、dcoC分别注释到辅酶转运和代谢、仅一般功能预测、细胞壁/膜/包膜生物发生、碳水化合物运输和代谢以及能源生产和转化几个分类中。表明上述基因可能参与细菌的新陈代谢以及基本的生命活动。结合转录组数据，sRNA SdsR敲除后hemA、mreC分别下调0.23和0.39倍；STM0951、STM1252、dcoC分别上调0.51、0.35和1.86倍。由此可见，dcoC基因表达差异倍数最大，但表达倍数小于2且未达到差异阈值，其差异性需要进一步验证。
表 4 预测靶基因GO、KEGG和eggNOG数据库注释结果Table 4. Annotation of predicted target genes by GO, KEGG, and eggNOG databases基因ID
Gene ID长度
Length/bplog2变化倍数
log2FC符号
SymbolGO富集分析
GOKEGG富集
分析
KEGG直系同源蛋白
分组比对
eggNOGeggNOG 蛋白
功能分类
eggNOG ClassSTM1777 1276 —0.236124007 hemA 生物过程（原卟啉原IX生物合成过程、氧化还原过程）；细胞成分（−）；分子功能（槲皮素2,3-双加氧酶活性）； 卟啉与
叶绿素代谢proNOG01837 H：辅酶转运与代谢 STM0951 868 0.509384983 STM0951 生物过程（氧化还原过程）；细胞成分（−）；分子功能（槲皮素2,3-双加氧酶活性）； — proNOG03931 R：仅适用于一般功能预测 STM3373 1069 —0.391500147 merC 生物过程（细胞形状的调节）；
细胞成分（膜的组成部分；质膜）；分子功能（−）；— COG1792; proNOG06657 M：细胞壁/
膜/包膜生物发生STM1252 1049 0.346239576 STM1252 生物过程（−）；细胞成分（−）；分子功能（−）； — proNOG13117 G：碳水化合物运输和代谢 STM0766 245 1.855584795 dcoC 生物过程（脂质代谢过程）；细胞成分（质膜；膜的组成部分）；分子功能（钠离子跨膜转运蛋白活性、草酰乙酸脱羧酶活性、水解酶活性）； 丙酮酸代谢 proNOG71341 C：能源生产和转换 2.3 预测靶基因的RT-qPCR验证
对预测到的杂交能量较高的5个潜在靶基因进行RT-qPCR验证，结果（图1）显示，hemA、mreC、STM0951、STM1252、dcoC与野生型沙门菌LT2相比转录水平分别下调0.70倍、下调0.59倍、上调1.34倍、上调0.47倍和上调2.46倍。以上结果表明，hemA、mreC、STM0951、STM1252、dcoC是本研究筛选被sRNA SdsR调控的靶基因。
3. 讨论
sRNA SdsR是伴侣蛋白Hfq依赖性sRNA中的一员，它在肠杆菌的保守性以及经过验证的靶标的生物学作用使得 SdsR成为sRNA研究领域中深入研究的主题。Choi等[12]对sRNA SdsR进行RNA-seq来寻找SdsR驱动的细胞死亡的靶基因。虽然此方法能筛选到大量的潜在靶基因，但由于筛选到的基因总数太大，验证sRNA直接调控的靶基因有着很大程度上的不确定性，导致直接调控靶基因的确定较困难。TargetRNA2在sRNA 目标预测系统中具有独特的能力，可以整合RNA-seq数据以提高预测结果。本研究采用TargetRNA2预测到29个靶基因，选择其中的5个基因进行RT-qPCR验证，结果发现RT-qPCR与DESeq的上下调趋势均相符，但差异倍数不完全符合，这可能与验证方法不同及仪器灵敏度差异有关，且RT-qPCR检测结果整体高于DESeq检测结果，说明荧光定量PCR的敏感性高于DESeq测序方法。以上结果表明这些基因可能受SdsR直接调控。很明显，这种针对研究对象特性并结合软件预测的研究方法具有较高的筛选效率，同时结合转录组测序的数据能极大提高靶基因的筛选效率。
SdsR是Hfq依赖性sRNA，Hfq相关sRNA 通常通过反式编码调节靶mRNA，导致在翻译、RNA稳定性或两者水平上抑制或激活靶标[13]。反式编码调控小RNA对靶mRNA的调控作用以负调节作用最为常见[14]。在本次研究中，筛选出的5个靶基因中hemA、merC的表达量下调，说明在沙门菌中，SdsR对某些靶基因的表达有促进作用，其调控机制值得进一步深入研究。SdsR与靶mRNA互补配对的位置通常位于其5′UTR靠近翻译的起始位点的区域，而预测结果显示SdsR与hemA、mreC、STM1252的结合位点为起始密码子的CDS区，这种结合方式并不常见。Verena Pfeiffer[15]验证了与Hfq相关的sRNA MicC通过CDS（密码子23–26）中的r12-bp RNA双链体沉默鼠伤寒沙门氏菌ompD mRNA，此外，ArcZ- TPX[16]、RybB-fdaL[17]、 SgrS- manX [18]等都属于sRNA与靶基因的CDS区域相互作用。此机制已被证明是一种比以前认为的更为常见的机制。这些研究支撑了hemA、mreC、STM1252作为SdsR靶标的可能性。
TargetRNA2预测到的5个基因中，hemA编码谷氨酰-tRNA还原酶[19]，该酶是催化血红素生物合成途径中的第一个关键步骤。血红素可作为一种主要的铁来源，铁是大多数生物包括细菌生命的必需营养元素[20]。STM0951基因GO富集到氧化还原过程，鼠伤寒沙门菌作为需氧及兼性厌氧型细菌，细菌的许多生命活动都会进行着复杂的氧化还原反应，如呼吸作用、固氮作用及生物体内许多代谢活动。merC与膜的组成部分质膜相关，STM1252编码细胞质蛋白。dcoC编码草酰乙酸脱羧酶亚基γ，草酰乙酸脱羧酶还有α、β另外两个亚基，其具备钠离子转运功能；另外，研究还发现草酰乙酸脱羧酶对细菌的致病性及毒力起重要作用，如在军团菌中草酰乙酸脱羧酶突变导致其在宿主体内的增殖能力减弱[21]。沙门菌作为重要的人畜共患病原菌，掌握其sRNA与靶基因的互作方式及了解其靶基因的组织结构、生理功能等有利于人们应对沙门氏菌的威胁，保证人类和动物的健康。
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表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称
Primer name序列（5′-3′）
Sequence (5′-3′)预扩增片段长度
Pre-amplified
fragment
length/bphemA-F ACGAATCTGCTCCGACTGAC 200 hemA-R GCAAACTGGCGAACGCTTAT STM0951-F ACATTGAGCGGCGAGAAAGT 116 STM0951-R ACCCACGATGTTATCCCGAC mreC-F ACAACAGCAGCAGATAGCGT 173 mreC-R CGATATTCGCGTTGGCGATG STM1252-F ATGGCGAATCATGGCTACCG 85 STM1252-R ATGCCGCCCTCGCTAATAAT dcoC-F CGGTGCTATTAGGTGAAGGCT 87 dcoC-R GGATGGCGAAAATCAGCAGG GAPDH-F CCCAGATGGGATTAGCTAGTTG 133 GAPDH-R ATTCCCCACTGCTGCCTCCCGT 
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表 2 TargetRNA2软件预测结果
Table 2 Prediction by TargetRNA2
排名
Rank基因ID
Gene ID符号
Symbol能量
EnergyP值
P value1 STM1777 hemA −16.51 0.000 2 STM0951 — −15.39 0.000 3 STM3373 mreC −14.91 0.001 4 STM1252 — −12.84 0.004 5 STM0766 dcoC −11.91 0.008 6 STM3127 — −11.74 0.009 7 STM4500 yjhP −11.69 0.009 8 STM0715 — −11.03 0.013 9 STM1088 pipB −10.89 0.015 10 STM4583 trpR −10.75 0.016 11 STM4599 yjjY −10.68 0.016 12 STM1625 ydcI −10.52 0.018 13 STM0691 — −10.52 0.018 14 STM3543 gntR −10.2 0.021 15 STM0317 gpt −10.2 0.021 16 STM3533 — −10.1 0.022 17 STM0246 metI −10.08 0.022 18 STM1445 slyB −9.89 0.025 19 STM0720 — −9.7 0.027 20 STM4520 — −9.67 0.027 21 STM3888 yieP −9.66 0.027 22 STM2193 folE −9.22 0.034 23 STM1440 sodC −9.2 0.034 24 STM4089 menG −9.14 0.035 25 STM0529 fdrA −8.69 0.042 26 STM3203 ygiM −8.66 0.043 27 STM3803 yidF −8.54 0.045 28 STM3563 livH −8.52 0.046 29 STM0051 rihC −8.43 0.047
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表 3 靶位点预测结果
Table 3 Predicted target sites
mRNA 功能
Function靶位点预测
Target site predictionhemA 谷氨酰-tRNA还原酶
Glutamyl-tRNA reductaseSdsR 59 hemA 20 STM0951 细胞质蛋白
Cytoplasmic proteinSdsR 61 STM0951 −65 mreC 棒状决定蛋白质
MreC Rod shape-determining protein MreCSdsR 63 mreC 20 STM1252 细胞质蛋白
Cytoplasmic proteinSdsR 58 STM1252 19 dcoC 草酰乙酸脱羧酶γ亚基
Oxaloacetate decarboxylase subunit gammaSdsR 75 dcoC −45
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表 4 预测靶基因GO、KEGG和eggNOG数据库注释结果
Table 4 Annotation of predicted target genes by GO, KEGG, and eggNOG databases
基因ID
Gene ID长度
Length/bplog2变化倍数
log2FC符号
SymbolGO富集分析
GOKEGG富集
分析
KEGG直系同源蛋白
分组比对
eggNOGeggNOG 蛋白
功能分类
eggNOG ClassSTM1777 1276 —0.236124007 hemA 生物过程（原卟啉原IX生物合成过程、氧化还原过程）；细胞成分（−）；分子功能（槲皮素2,3-双加氧酶活性）； 卟啉与
叶绿素代谢proNOG01837 H：辅酶转运与代谢 STM0951 868 0.509384983 STM0951 生物过程（氧化还原过程）；细胞成分（−）；分子功能（槲皮素2,3-双加氧酶活性）； — proNOG03931 R：仅适用于一般功能预测 STM3373 1069 —0.391500147 merC 生物过程（细胞形状的调节）；
细胞成分（膜的组成部分；质膜）；分子功能（−）；— COG1792; proNOG06657 M：细胞壁/
膜/包膜生物发生STM1252 1049 0.346239576 STM1252 生物过程（−）；细胞成分（−）；分子功能（−）； — proNOG13117 G：碳水化合物运输和代谢 STM0766 245 1.855584795 dcoC 生物过程（脂质代谢过程）；细胞成分（质膜；膜的组成部分）；分子功能（钠离子跨膜转运蛋白活性、草酰乙酸脱羧酶活性、水解酶活性）； 丙酮酸代谢 proNOG71341 C：能源生产和转换
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