RAPD Analysis on Differences between Monokaryotic and Dikaryotic Pleurotus ostreatus
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摘要:目的 探究平菇单双核菌丝体间的差异，为平菇品种培育提供技术理论基础。方法 从平菇TD300的担孢子中分离得到两个单核菌株MK13和MK3，通过交配得到优良双核菌株DK300，进行平板试验和出菇试验，测定4个菌株的菌丝生长状况和出菇产量，再利用随机扩增多态性DNA（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）标记技术检测4个菌株之间的遗传差异性。结果 DK300与亲本TD300在菌丝生长状况和产量上没有显著性差异，但MK13、MK3和交配所得的DK300与亲本TD300间存在较大的遗传差异性，而MK13、MK3和DK300间遗传差异性较小，尤其是MK3和DK300间遗传差异性最小。结论 经过减数分裂形成担孢子时可能发生有基因重组，而通过两个单核菌株交配得到双核菌株过程则较少发生基因重组。Abstract:Objective Differences between uni- and bi-nucleate mycelia of Pleurotus ostreatus were studied to aid the mushroom breeding and cultivation.Method Monokaryons MK13 and MK3 were isolated from basidiospores of P. ostreatus TD300 and mated to obtain the dikaryotic DK300. Conventional plate and fruiting tests were applied to compare the mycelial growth and fruiting body yield of the 4 strains. Genetic differences of the strains were determined by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers.Result There were no significant differences in mycelial growth and fruiting body yield between DK300 and TD300. However, a significant genetic difference existed between the offspring (i.e., MK13, MK3, and DK300) and parent TD300. The differences among MK13, MK3, and DK300 were minute, especially between MK3 and DK300.Conclusion Gene recombination might occur during the basidiospore formation by meiosis, but less likely in the mating of two monokaryotic strains to generate a dikaryotic offspring.
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Keywords:
- Pleurotus ostreatus /
- monokaryon /
- dikaryon /
- yield /
- genetic diversity
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0. 引言
【研究意义】单宁是一类水溶性多酚类物质，广泛分布于油菜、高粱和豆科植物中[1]。根据其化学结构，分为三大类，即水解单宁、缩合单宁和褐藻多酚[2]。单宁酸（tannic acid, TA）是单宁的次生代谢物，是水解单宁中最典型的物质[3]。TA具有收敛抗腹泻[4- 5]、抗菌[6]、抗病毒[6]、抗寄生虫[2]等作用，因此将TA开发作为饲料添加剂具有重要意义。【前人研究进展】TA可应用于反刍动物和单胃动物。例如，TA可减少泡沫性瘤胃鼓气和控制消化道寄生虫[2]。饲粮中添加低剂量的单宁可以提高单胃动物的健康度和生长性能[7-8]。此外，TA具有改善肠道结构的功能。有文献报道，添加2.5 mg·kg−1 TA可改善小鼠的空肠形态学，促进紧密连接蛋白ZO-1基因的表达[9]。【本研究切入点】不同的化学结构、提取来源和添加浓度均会导致TA应用效果的差异[10]。此外，TA能够与蛋白质、淀粉、矿物质和消化酶结合，通常被认为是一种抗营养因子[11]，其在畜禽上的应用存在争议。关于TA对肉鸡的生长性能、屠宰性能和肠道菌群的影响有待深入研究。【拟解决的关键问题】本试验旨在研究饲粮中添加TA对肉鸡的生长性能、屠宰性能和肠道菌群的影响，为TA在家禽生产上的应用提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
TA由中鲨动物保健品（厦门）有限公司提供，由五倍子水解TA提纯至鞣酸含量98%，再将98%的TA添加沸石粉稀释至TA含量50%。
1.2 试验动物与试验设计
1日龄白羽肉鸡（公）购于福建圣农集团有限公司。试验采用单因素设计，将384只1日龄健康且体重相近的肉鸡随机分成4个组，每组12个重复，每个重复8只。空白对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中分别添加100、150、200 mg·kg−1的TA。试验期为42 d。
1.3 基础饲粮及饲养管理
采用玉米-豆粕型粉状饲粮，参照NRC（1994）和NY/T 33-2004肉仔鸡营养需求配制，基础饲粮组成及营养水平见表1。试验在福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物营养试验基地开展。试验鸡采用笼养模式（95 cm×60 cm×65 cm）。入雏前一天将鸡舍温度升高至32～35 ℃，随后温度每周降低2～3 ℃，直至降至23～25 ℃为止。光照、通风和免疫程序等其他管理措施按照白羽肉鸡生产管理手册执行。
表 1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1. Composition and nutrient levels of basal diet used in trial (on air-dry basis)% 原料
Ingredients含量
Content1～3周
1–3 weeks4～6周
4–6 weeks玉米 Corn 52.00 58.00 豆粕 Soybean meal 34.70 27.30 膨化大豆 Extruded soybean 3.00 3.00 国产鱼粉 Domestic fish meal 2.00 1.50 豆油 Soybean oil 4.00 6.00 石粉 Limestone 1.21 1.21 磷酸氢钙 CaHPO4 1.53 1.43 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.26 0.26 预混料 Premix1） 1.00 1.00 氯化钠 NaCl 0.30 0.30 合计 Total 100.00 100.00 营养水平 Nutrient levels 2） 代谢能 ME/（MJ·kg−1） 12.46 13.23 粗蛋白 CP 22.14 19.17 钙 Ca 1.05 0.98 有效磷 AP 0.51 0.44 赖氨酸 Lys 1.16 0.97 蛋氨酸+半胱氨酸 Met + Cys 1.08 0.99 注：① 预混料为每千克饲粮提供：VA 9500 IU，VD 3 000 IU，VE 22.5 mg，VK 3.0 mg，VB1 3.0 mg，VB2 7.5 mg，VB6 3.0 mg，VB12 0.22 mg，泛酸钙 15.0 mg，烟酸 30.0 mg，叶酸 1.5 mg，生物素 0.12 mg，胆碱 400 mg，碘 0.40 mg。② 营养水平均为计算值。
Note: ① The premix provided the following per kg of the diet: VA 9500 IU，VD 3 000 IU，VE 22.5 mg，VK 3.0 mg，VB1 3.0 mg，VB2 7.5 mg，VB6 3.0 mg，VB12 0.22 mg，calcium pantothenate 15.0 mg，nicotinic acid 30.0 mg，folic acid 1.5 mg，biotin 0.12 mg，chloride 400 mg，I 0.40 mg. ② Nutrient levels were calculated.1.4 指标测定与方法
1.4.1 生长性能测定
试验第3和6周，禁食10 h后，以重复为单位称量鸡只重量，统计耗料量，计算肉鸡不同生长阶段的平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）。
1.4.2 屠宰性能
试验第42 d，肉鸡禁食12 h后，各组每个重复选取接近平均体重的4只鸡，称重后颈静脉放血致死，按照相关手册进行屠宰测定，计算屠宰率、全净膛率、胸肌率和腿肌率。
1.4.3 盲肠微生物多样性分析
试验第42 d，每个重复选取接近平均体重的4只鸡进行屠宰，将盲肠内容物挤压至无菌离心管中。液氮速冻后运至实验室，置−70 ℃冰箱保存。
采用E.Z.N.A.® soil DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）提取盲肠内容物中的微生物基因组DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。对扩增细菌16S rRNA 基因的高度可变的V3-V4区进行测序。引物分别为338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。反应体系：20 μL mixture containing，4 μL 5 × FastPfu Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L−1），上下游引物各0.8 μL（5 μmol·L−1），0.4 μL FastPfu Polymerase，1 μL模板DNA，双蒸水补足至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 45 s，共27个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经过纯化后，通过Illumina Mi Seq PE 300平台进行高通量测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
分别使用FLASH软件和Trimmonmatic软件对每个样品的数据进行拼接，随后用UCHIME软件鉴定并去除嵌合体序列，得到有效的数据用于后续的生物信息学分析。测序片段在97%相似度的，再用QIIME软件进行聚类、划分操作分类单元（operational taxonomic units, OTU），利用Silva分类学数据库得到每个OTU的分类学信息。基于以上结果，再进行其他分析。
1.5 统计学分析
采用SPSS 23.0统计软件对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），组间采用Duncan's法进行多重比较。结果以“平均数±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。
2. 结果与分析
2.1 TA对肉鸡生长性能的影响
由表2可知，饲粮中添加200 mg·kg−1 TA的末重显著大于其他各组（P＜0.05）。1～3周龄，与对照组相比，各试验组的ADG、ADFI和F/G差异均不显著（P＞0.05）。4～6周龄，与对照组相比，添加200 mg·kg−1 TA的组别的ADFI显著大于对照组（P＜0.05）；与对照组相比，添加200 mg·kg−1 TA的组别的F/G显著低于对照组（P＜0.05）；各组间ADG差异均不显著（P＞0.05）。1～6周龄，与对照组相比，添加200 mg·kg−1 TA的ADFI显著高于对照组（P＜0.05），各组间的ADG和F/G差异均不显著（P＞0.05）；随着TA添加量的增加（100～200 mg·kg−1），ADFI呈现上升的趋势，F/G呈现下降的趋势。可见，饲粮中添加200 mg·kg−1 的TA可显著提高肉鸡的生产性能。
表 2 TA对白羽肉鸡生长性能的影响Table 2. Effect of feeding TA-containing diets on growth of broilers项目
Items0（CK） 100 mg·kg−1 TA 150 mg·kg−1 TA 200 mg·kg−1 TA P值
P value初重 IBM/g 47.00±0.47 47.78±1.26 48.00±1.15 46.89±0.51 0.125 末重 FBM/g 2303.41±248.95 c 2327.67±255.48 ab 2343.07±261.72 ab 2476.67±230.78 a 0.031 1～3周 1–3 weeks 日采食量 ADFI/g 36.09±2.49 37.00±2.66 36.99±3.47 38.47±2.38 0.149 日增重 ADG/g 41.91±1.18 41.41±3.72 40.95±2.16 42.75±2.25 0.216 料重比 F/G 1.16±0.17 1.12±0.12 1.11±0.24 1.11±0.16 0.067 4～6周 4–6 weeks ADFI 73.59±4.96 b 73.84±3.34 b 74.58±5.26 ab 79.51±4.15 a 0.021 ADG 118.10±6.15 115.65±3.55 115.69±6.13 118.47±4.87 0.061 F/G 1.60±0.25 a 1.57±0.18 ab 1.55±0.14 ab 1.49±0.22 b 0.046 1～6周 1–6 weeks ADFI 53.72±2.76 b 54.28±2.31 b 54.64±2.52 b 57.85±3.19 a 0.016 ADG 78.44±1.95 77.62±2.33 76.50±3.83 79.26±2.71 0.379 F/G 1.46±0.21 1.43±0.14 1.40±0.11 1.37±0.16 0.631 注：同行数据后的不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同或无字母表示差异不显著（P＞0.05）。下表同。
Note: Within a row, values with different small letters indicate significantly different between dietary treatments (P＜0.05), while with the same letter or no letter means no significant difference (P＞0.05). The same as below.2.2 TA对肉鸡屠宰性能的影响
由表3可知，与对照组相比，各试验组肉鸡的屠宰重、屠宰率、全净膛率和胸肌率差异均不显著（P＞0.05）；饲粮中添加150 mg·kg−1 TA的腿肌率显著高于其他各组（P＜0.05），其他各组间差异不显著（P＞0.05）。
表 3 TA对肉鸡屠宰性能的影响Table 3. Effect of dietary TA supplement on slaughter performance of broilers项目
Items0（CK） 100 mg·kg−1 TA 150 mg·kg−1 TA 200 mg·kg−1 TA P值
P value屠宰重 Dressing weight/g 2190.67±87.46 2287.33±59.68 2322±85.84 2556.67±80.05 0.761 屠宰率 Dressing rate/% 94.9±1.66 93.55±0.72 93.47±1.07 94.61±1.08 0.218 全净膛率 All eviscerated rate/% 81.97±4.66 78.5±1.26 77.16±1.97 80.01±0.77 0.126 胸肌率 Breast muscle rate/% 27.08±3.45 27.95±3.97 24.98±1.85 28.32±2.34 0.433 腿肌率 Leg muscle rate/% 12.06±0.48 b 12.36±0.78 b 13.43±1.03 a 12.56±0.98 b 0.037 2.3 TA对肉鸡肠道菌群结构的影响
2.3.1 Alpha多样性分析
由表4可知，各样品的覆盖度指数均大于0.999，说明该测序结果已经基本覆盖样本的多样性。与对照组相比，各试验组肉鸡的ACE指数、Chao 1指数、Shannon指数、Simpson指数差异均不显著（P＞0.05）。表明，在基础饲粮中添加TA对肉鸡的盲肠微生物的Alpha多样性无显著影响。
表 4 TA对肉鸡肠道微生物Alpha多样性指数的影响Table 4. Effect of dietary TA supplement on α diversity of enteric microbiota in broilers项目
Items0（CK） 100 mg·kg−1 TA 150 mg·kg−1 TA 200 mg·kg−1 TA P值
P valueACE指数 ACE index 259.88±13.25 251.53±17.97 265.62±14.03 259.42±16.98 0.634 Chao 1指数 Chao 1 index 261.70±11.70 257.64±18.58 270.01±15.19 257.58±17.08 0.494 Shannon指数 Shannon index 2.44±0.05 2.61±0.43 2.57±0.19 2.39±0.39 0.332 Simpson指数 Simpson index 0.26±0.05 0.23±0.05 0.21±0.03 0.25±0.06 0.235 覆盖度指数 Coverage index 0.999 0.999 0.999 0.999 0.270 2.3.2 肠道菌群结构组成
在门分类水平上，4个组的肠道菌群均主要由拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes、放线菌门Actinobacteria和软壁菌门Tenericutes组成，其中拟杆菌门的相对丰度最高，拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度总和达到90%以上（图1）。
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图 1 肉鸡肠道菌群结构在门分类水平上的组成注：A、B、C、D代表分别在基础饲粮中添加0（对照组）、100、150和200 mg·kg-1TA的剂量，下图同。Figure 1. Composition of enteric microbiota in broilers at phylum levelNote: A, B, C, and D represent groups supplemented with 0 (control), 100, 150, and 200 mg·kg−1 TA in basal diet, respectively. The same as below.在科分类水平上，4个组的肠道菌群主要由理研菌科Rikenellaceae、Barnesiellaceae、疣微菌科Ruminococcaceae、毛螺菌科Lachnospiraceae、乳杆菌科Lactobacillaceae、梭菌科Clostridiales_vadinBB60_group和拟杆菌科Bacteroidaceae组成（图2）。
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图 2 肉鸡肠道菌群结构在科分类水平上的组成Figure 2. Composition of enteric microbiota in broilers at family level在属分类水平上，4个组的肠道菌群主要由理研菌属Alistipes、Barnesiella、疣微菌属Ruminococcaceae_UCG014、瘤胃球菌属Ruminococcus1_torques_group、乳酸菌属Lactobacillus、梭菌属norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、理研菌科中未分类的属unclassified-1-Rikenellaceae和粪杆菌属Faecalibacterium组成（图3）。
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图 3 肉鸡肠道菌群结构在属分类水平上的组成Figure 3. Composition of enteric microbiota in broilers at genus level2.3.3 差异物种分析
LefSe用于寻找组间具有统计学差异的物种。由图4可知，经LefSe分析，在科分类水平上，饲粮中添加150 mg·kg−1的TA可显著提高Family_XIII的相对丰度。添加200 mg·kg−1 TA的组别在纲、目、科、属的分类水平上都发现了差异显著的肠道菌群，其中，科和属的分类水平的肠道菌群中，乳杆菌科Lactobacillaceae和乳杆菌属Lactobacillus的相对丰度显著升高。
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图 4 LEfSe分析差异物种注：圆圈由里到外表示物种分类水平由门到属，差异物种用彩色圆圈和扇形表示，每个圆圈的直径与该物种的相对丰度成比例，黄色圆圈表示差异不显著。Figure 4. LEfSe analysis on different microbesNote: Concentric circles represent phylum (inside) to genus (outside). Biomarker taxa are shown with colored circles and shaded areas. Diameter of a circle is proportional to relative abundance of that taxa in a community. Yellow circle indicates no significance.3. 讨论与结论
生长性能是反映动物营养状态的重要指标。TA对肉鸡生长性能的影响存在争议。有研究报道，基础饲粮中添加5 g·kg−1的水解TA可提高肉鸡的生长性能[8]。基础饲粮中添加5%或10%的葡萄渣（主要含缩合TA和酚类化合物）对1～21日龄肉鸡的生长性能无显著影响[12]。而基础饲粮中添加10 g·kg−1的水解TA则降低肉鸡的增重和料肉比[13]。有研究表明，添加一定剂量的TA可提高肉鸡的生长性能，但是过高剂量的TA反而会抑制生长。这可能是由于适量的TA与肠道细胞壁结合形成保护层，从而阻断细菌与肠道受体结合，改善肠道微生态内环境，提高蛋白酶活性，促进营养物质的吸收[14]；或者通过影响肠道菌群的组成进而提高动物的代谢水平[15]；还有可能通过改善动物的肠道组织形态，促进肠道对营养物质的吸收[16]。但是饲粮中添加过高剂量的TA则变为抗营养因子，抑制动物生长[4]。在本试验前期阶段（1～3周），基础饲粮中添加TA对生长性能无显著影响；在后期阶段（4～6周），饲粮中添加200 mg·kg−1的TA可显著提高日采食量、降低料肉比；在整个试验阶段，饲粮中添加TA呈现提高肉鸡体重的趋势，添加200 mg·kg−1的TA可显著提高肉鸡的日采食量，且呈现降低料肉比的趋势。由表2可知，基础饲粮中添加200 mg·kg−1的TA可促进肉鸡生长。
屠宰性能是衡量胴体品质的重要指标，其中屠宰率和全净膛率是反映屠宰性能的两个重要指标。畜禽的日龄、环境、营养组成和饲喂方式等因素均可影响屠宰性能[16]。在本试验中，基础饲粮中添加TA对肉鸡屠宰率、全净膛率和胸肌率无显著影响，添加150 mg·kg−1的TA能显著提高腿肌率。由表3可知，饲粮中添加150 mg·kg−1 的TA可促进养分在肉鸡腿部沉积。
动物的生长与肠道内的微生物菌群密不可分。动物的肠道中寄居着数以万计的微生物，包括细菌、古生菌、病毒、真菌，其中大部分是细菌。这些微生物与宿主共同进化，形成互惠共利的关系[17]。正常的肠道菌群具有多种生理作用，例如，生理营养作用，免疫调节作用，拮抗作用，参与代谢等[17]。
Alpha多样性用于反映样品间物种的丰富度和多样性，衡量的指标包括ACE指数、Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数等。ACE指数和Chao 1指数反映物种的丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映物种的多样性[18]。在本试验中，各组间Alpha多样性的四个指标差异均不显著，表明TA促进白羽肉鸡生长并非通过提高肠道菌群的Alpha多样性而实现的。
动物的肠道菌群具有相对稳定性。有文献报道，爱拔益加（AA）父母代肉种鸡的肠道菌群中86%以上是由拟杆菌门和厚壁菌门组成，约7%由梭杆菌门和变形菌门组成[19]。蛋鸡盲肠菌群的优势菌群为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门[18]。在本试验中，各组的肠道菌群在门水平上均主要由拟杆菌门、厚壁菌门、放线菌门和软壁菌门组成，表明基础饲粮中添加100～200 mg·kg−1的TA在门水平上不会影响肠道菌群的组成。此外，本试验中白羽肉鸡的肠道菌群组成与爱拔益加种鸡和蛋鸡的肠道菌群组成略有不同，这可能是由于品种、饲料和环境不同导致的[20]。不同类型的菌群对宿主的作用也不一样。例如，拟杆菌门具有维持肠道微生态平衡的作用[18]，而厚壁菌门可促进营养物质的吸收[21]。LefSe是一种用于寻找不同组间差异显著物种的分析方法。采用该分析方法，结果表明，基础饲粮中添加200 mg·kg−1的TA可使肉鸡肠道中的乳酸杆菌科和乳酸杆菌属的相对丰度显著升高。有文献也报道，在仔猪饲粮中添加TA可促进空肠中乳酸杆菌增殖[22]，本研究与前人的研究结果一致。乳酸杆菌属是人类和动物肠道重要的生理性菌群之一，具有维持肠道菌群平衡的作用，肠道中的乳酸菌可能通过阻止大肠杆菌的肠受肽和分泌有毒代谢物来抑制大肠杆菌和空肠弯曲杆菌在肠道的定植[23]。因此饲粮中添加适量的TA可促进肠道益生菌的定植。
本试验研究表明，饲粮中添加适量TA可促进肉鸡采食，提高生长性能和腿肌率；添加100～200 mg·kg−1 的TA对肉鸡的盲肠菌群多样性无显著影响，添加200 mg·kg−1的TA可促进肉鸡肠道中乳酸杆菌属的生长。
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图 2 DNA电泳检测结果
M为λ-Hind Ⅲ。
Figure 2. DNA electrophoresis of 4 mushroom strains
M: λ-Hind III.
表 1 供试随机引物
Table 1 Random primers applied
引物编号
Primer number引物序列（5′-3′）
Primer sequence(5′−3′)S10 CTGCTGGGAC S22 TGCCGAGCTG S23 AGTCAGCCAC S28 GTGACGTAGG S36 AGCCAGCGAA S39 CAAACGTCGG S43 GTCGCCGTCA S62 GTGAGGCGTC S75 GACGGATCAG S78 TGAGTGGGTG S79 GTTGCCAGCC S124 GGTGATCAGG S126 GGGAATTCGG 
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表 2 菌株的菌丝形态
Table 2 Mycelium morphology of tested strains
菌株
Bacterial
strain菌落形态
Colonial
morphology菌丝长势
Mycelium
growth
vigor菌丝颜色
Color of
myceliumTD300 半气生型 Semi-air type + 浅白 Light white DK300 半气生型 Semi-air type ++ 白 White MK13 匍匐型 Prostrate type +++ 白 White MK3 匍匐型 Prostrate type +++ 白 White +++：粗壮浓密；++：较粗壮浓密；+：纤细稀疏。
+++: thick; ++: thick and dense; +: slender sparse.
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表 3 菌株出菇情况及子实体性状
Table 3 Germination and fruiting body properties of mushrooms
菌株
Bacterial strain出菇情况
Mushroom-budding子实体形状
Fruit-body
shape子实体颜色
Fruit-body
colorTD300 出菇 Producing mushroom 贝壳状
Conchoid type深褐色
Dark brownDK300 出菇 Producing mushroom 扇叶状
Fan leaf type浅褐色
Light brownMK13 不出菇 No mushrooms – – MK3 不出菇 No mushrooms – – –：不出菇。
–: No mushrooms.
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表 4 菌株出菇产量
Table 4 Yields of mushrooms
菌株
Strain第一茬均产量
Average yield
of the first crop/
（kg·袋−1）第二茬均产量
Average yield
of the second crop/
（kg·袋−1）平均总产量
Average total
output/
（kg·袋−1）TD300 0.273 a 0.139 a 0.412 a DK300 0.285 a 0.114 b 0.399 a MK13 – – – MK3 – – – 表中不同字母表示差异显著（P＜0.05）；–：不出菇。
Different letters indicate significant difference at P＜0.05; –: no mushrooms.
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