62份紫花风铃木的表型多样性分析

黄稚清; 吴林源; 高筱钰; 丁释丰; 肖观康; 秦新生; 冯志坚

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.009.006

62份紫花风铃木的表型多样性分析

黄稚清^{1, 2,},
吴林源^{1, 3},
高筱钰¹,
丁释丰¹,
肖观康¹,
秦新生¹,
冯志坚^1, ,

1.
华南农业大学林学与风景园林学院，广东　广州　510642
2.
广东生态工程职业学院生态工程学院，广东广州　510520
3.
广东职业技术学院轻工与材料学院，广东　佛山　528041

基金项目: 国家自然科学基金项目（31870699）：广东省林业科技创新项目（2018KJCX030）

详细信息

作者简介:
黄稚清（1995−），女，硕士，研究方向：风景园林（园林植物应用与城市绿化）和森林培育（E-mail：starlight0715@foxmail.com）

通讯作者:
冯志坚（1962−），男，博士，副教授，主要从事野生植物种质资源保护与利用研究（E-mail:11293409@qq.com）

中图分类号: S 685.99
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出版历程
- 收稿日期: 2022-06-14
- 修回日期: 2022-07-29
- 刊出日期: 2022-09-29

Phenotypic Diversity of 62 Handroanthus impetiginosus Plants

1.
College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong　510642, China
2.
College of Ecological Engineering, Guangdong Eco-engineering Polytechnic, Guangzhou, Guangdong　510520, China
3.
School of Light Industry and Materials, Guangdong Vocational and Technical College, Foshan, Guangdong　528041, China

摘要

摘要:
目的紫花风铃木（Handroanthus impetiginosus）是我国南方广泛应用的一种园林观赏乔木，其表型性状存在较大的个体差异。通过对紫花风铃木表型多样性进行分析，了解其表型性状差异，可为紫花风铃木优质种质资源发掘和科学育种提供重要理论基础。
方法以广东省内6个城市12个群体62份紫花风铃木样本为材料，选取20个表型形状对样本进行变异度、Shannon多样性指数、相关性及主成分分析，并基于表型性状进行聚类分析。
结果紫花风铃木20个表型性状的变异系数为13.53%～59.13%，Shannon指数为0.79～4.08，表型性状变异性和多样性较高，具有丰富的表型性状多样性。相关性分析显示，叶性状相关的数量指标之间相互关联。主成分分析显示，从20个表型性状中提取6个主成分，其中叶宽、叶面积、小叶柄长、叶长、叶柄长等叶性状指标和胸径、枝下高等枝条与树干指标贡献较大。采用Hierarchical法进行表型性状聚类分析可将62份紫花风铃木材料划分为4大类群。
结论紫花风铃木具有较为丰富的表型变异性和多样性，其中与枝条和树干有关的指标变异系数最高，而叶性状相关指标的多样性较高。主成分分析显示贡献较大的为叶表型性状指标和枝条与树干指标。通过聚类分析可知第II类群中包含的个体花量较大，花色较深；而第I类群中存在开白花的个体，花色比较独特，均具有较好的观赏效果，可从中进一步筛选和繁殖优良品种。
- 紫花风铃木 /
- 表型性状 /
- 表型多样性 /
- 表型变异性
Abstract:
Objective A popular ornamental tree for landscaping, Handroanthus impetiginosus tends to differ in phenotypic traits between individual plants. This study aimed to collect information on the resources for selection and cultivation.
Method Twenty different phenotypic traits of 62 H. impetiginosus plants collected from 12 population groups in 6 cities of Guangdong Province were used to calculate coefficient of variation (CV) and Shannon diversity index as well as conduct correlation, principal component, and clustering analysis.
Result The CVs of these phenotypic traits varied between 13.53%–59.13%, while the Shannon diversity index between 0.79–4.08. High CV and diversity index connotated richness in phenotype diversity of the species. Their qualitative indices differentiated more greatly than quantitative ones, and the qualitative indices correlated with one another. Among the 6 principal components in the 20 traits, the indices associated with leaf, including width, area, length, petiolule length, and petiole length, were the major contributors which were followed by those related to the branch and trunk diameters at breast height and under branch height. A hierarchical clustering analysis divided the 62 H. impetiginosus plants into 4 population groups based on their phenotypic characteristics.
Conclusion H. impetiginosus was richly diverse phenotypically. The indices related to branch and trunk ranked highest on CV, while those associated with leaf greatest on diversity index. The principal components of the traits, such as leaf-, branch-, and trunk-related indices, largely determined the phenotype of H. impetiginosus plants. The population Group II plants as classified by the cluster analysis had more dark color flowers, whereas Group I carried distinctive, attractive white blossoms that were valued generally for landscaping, cultivation, and breeding purposes.
- Handroanthus impetiginosus /
- phenotypic traits /
- phenotypic diversity /
- phenotypic variability

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0. 引言

【研究意义】沙门氏菌是最主要的病原微生物之一，由其引起的食物中毒占食物中毒病例的第1或第2位^[1]。仅在2005—2011年，国外发生的19起蔬菜因病原微生物污染而引起的食源性疾病案例中，有11起是由沙门氏菌污染引起的，占比高达58%^[2]。沙门氏菌也是我国食源性疾病的主要病原体，我国发生的细菌性食源性中毒事件中有80%左右由沙门氏菌引起^[3]。国内已有多篇研究文献发现胡萝卜、香菜、香葱、生菜等新鲜蔬菜中存在沙门氏菌污染风险^[4-6]。蔬菜的沙门氏菌污染可能发生在从农田到餐桌的每个环节^[7-8]，近年来，随着对蔬菜供应链主要环节中沙门氏菌污染风险和来源的深入研究，发现沙门氏菌污染风险虽然贯穿供应链的每个主要环节，但仍以栽培环节，特别是蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染风险最大，也是沙门氏菌检测和风险控制的重点^[8-11]。【前人研究进展】目前环介导等温扩增技术（loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）已经运用到多种食品中沙门氏菌的快速检测中，因其具有快速、灵敏的优点备受关注。Hara-Kudo等^[12]采用环介导等温扩增技术，可以检出沙门氏菌最低含量为2.2 CFU·管⁻¹，并在1 h以内获得检测结果；张宏伟等^[13]采用环介导等温扩增技术检测食品样品中沙门氏菌最低检出限为1.5 CFU·hg⁻¹；王瑾等^[14]采用实时荧光环介导等温扩增技术，可检测沙门氏菌最低含量为6 CFU·管⁻¹，人工污染鸡肉的检出限为450 CFU·g⁻¹，全程用时约7 h；Wu等^[15]利用实时荧光定量环介导等温扩增技术对生菜中沙门氏菌进行检测，灵敏度达到了4 CFU.g⁻¹，而检测过程仅需3 h左右；庞心怡等^[16]采用环介导等温扩增技术快速检测肉类中沙门氏菌，对人工污染的沙门氏菌肉样检测灵敏度达98 CFU·mL⁻¹，而全程仅用时15 h。【本研究切入点】目前对沙门氏菌检测多采用国标《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）方法，但该方法需要对待检样品进行预增菌、选择性分离和生化试验鉴定，操作繁琐，耗时费力，仅筛选出沙门氏菌可疑菌落就需要3～4 d，后续的生化试验还需2～3 d^[17]，满足不了沙门氏菌快速检测的要求。而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早在2000年由日本科学家Notomi^[18]发明，该技术可在恒温条件下（60～65 ℃）1h内完成核酸的高倍扩增，灵敏度比PCR技术高2～7个数量级，反应产物不仅可以通过琼脂糖电泳、浊度仪和定量PCR进行检测，也可以通过钙黄绿素、羟基萘酚蓝、SYBR Green I显色后观察^{[19, 20]}，目前已成功应用于沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌等多种病原微生物的检测^{[14, 21-23]}，但国内尚未见有关蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测方法的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以沙门氏菌特有侵袭蛋白A （invA）基因序列设计可视化LAMP检测引物，建立基于钙黄绿素显色的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌可视化快速检测方法，以期为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的防控提供技术支撑。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤

供试蔬菜栽培土壤样品集自闽清县东桥镇绿辉蔬菜种植农场，样品按S型多点采集土壤表层（0～20 cm）的混合样，采样后立即用冰袋包装新鲜样品带回实验室，人工除去植物残体、根系和石头，过2 mm筛后测定土壤理化指标。供试蔬菜栽培土壤具体理化指标如下：土壤类型为黄红壤，0～20 cm土层pH值5.31，有机质含量16.61 g·kg⁻¹，碱解氮含量126.54 mg·kg⁻¹，速效磷含量18.25 mg·kg⁻¹，速效钾含量113.79 mg·kg⁻¹。

1.1.2 材料与试剂

胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（北京陆桥技术有限责任公司），DL2000 Marker、dNTP（Takara公司），Bst 2.0 DNA polymerase（美国NEB公司），琼脂糖（西班牙Biowest），Betaine、Tween-20（上海生工），MnCl₂、NaCl、Calcein（阿拉丁公司），FastDNA^® Spin Kit for Soil试剂盒（美国MP Bio公司），无菌均质袋（北京陆桥）。

1.1.3 仪器与设备

PCR仪（BIO-RAD^TM S1000），凝胶成像系统（BIO-RAD^TM Gel Doc XR+），FastPrep^TM FP120核酸提取仪（美国MP Bio公司），easyMix^TM拍击式均质器（法国AES Chemunex公司），电泳仪及电源（北京六一仪器厂），恒温水浴锅（上海一恒），恒温培养箱（上海一恒）。

1.1.4 菌株

表1为供试7种微生物菌株，分别来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）和美国典型培养物保存中心（ATCC）。

表 1 供试菌株

Table 1. Bacteria used for testing

菌株名称 Strains name	拉丁学名 Scientific name of strains	菌株编号 Strains number	菌株来源 Source of strains
鼠伤寒沙门氏菌	Salmonella typhimurium	1.1174	CGMCC
金黄色葡萄球菌	Staphylococcus aureus	25923	ATCC
大肠埃希氏菌	Escherichia coli	25922	ATCC
产气肠杆菌	Enterobacter aerogenes	1.0876	CGMCC
大肠埃希氏菌O157:H7	Escherichia coli O157:H7	10907	CICC
单核细胞增生李斯特氏菌	Listeria monocytogenes	1.9136	CGMCC
英诺克李斯特氏菌	Listeria innocua	1.7730	CGMCC

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1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

根据Genbank登录的沙门氏菌特有侵袭蛋白A （invasion protein A，invA）基因序列（Accession: M90846.1），在网站（http://primerexplorer.jp/e/）上使用Primer Explorer 5.0在线软件设计3对LAMP引物用于沙门氏菌检测，包括1对外引物（F3/B3）、1对内引物（FIP/BIP）和1对环引物（Loop F/Loop B）。检测引物交由上海生工合成。具体检测引物序列见表2。

表 2 环介导等温扩增引物

Table 2. Primers of LAMP

引物 Primer	序列 Sequence
FIP	5′-GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACA GATGAGT-3′
BIP	5′-GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTC AAAGGAA-3′
F3	5′-CGGCCCGATTTTCTCTGG-3′
B3	5′-CGGCAATAGCGTCACCTT-3′
Loop F	5′-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3′
Loop B	5′-AAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3′

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1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取

将TSA平板内活化的沙门氏菌，挑取单个菌落接种于5 mL TSB液体培养基中，37 ℃、180 r·min⁻¹过夜培养15～18 h，以1∶100比例转接于100 mL TSB液体培养基，37 ℃、180 r·min⁻¹培养3 h左右至细菌对数生长期（OD₆₀₀≈0.55）。菌液使用生理盐水按10倍梯度依次稀释后，分别取100 μL不同浓度稀释液涂于TSA平板上，37 ℃倒置培养18～24 h计数。

沙门氏菌DNA模板采用热裂解法提取，取1 mL沙门氏菌菌液在台式离心机上10 000 r·min⁻¹离心5 min，弃上清液，沉淀重悬于0.5 mL生理盐水，加入等体积2×TZ裂解液，于99.5 ℃加热10 min，冰上冷却2 min后，在10 000 r·min⁻¹离心5 min，取上清液即为沙门氏菌DNA模板，−20 ℃保存备用。

1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化

分别对LAMP反应体系中dNTPs浓度、MgSO₄浓度以及Betaine浓度，反应条件中反应温度和反应时间进行优化，其中dNTPs终浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L⁻¹，MgSO₄终浓度分别为2、4、6、8、10、12 mmol·L⁻¹，Betaine终浓度分别为0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mol·L⁻¹；反应温度分别设置58、59、60、61、62、63、64、65 ℃，反应时间分别为30、40、50、60、70、80、90 min。选用50 μmol·L⁻¹ Calcein-500 μmol·L⁻¹ MnCl₂作为指示剂^[24]，阳性反应显绿色，阴性反应显橘黄色，每个因子设置3个重复，以确定最佳反应体系和反应条件。

1.2.4 LAMP反应特异性检测

分别以鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌株为材料，以热裂解法制备各菌株DNA，验证所建立LAMP检测方法的特异性。取1 μL各菌株的DNA作为模板，采取已优化的反应体系和条件进行特异性分析，反应结束后，以管内颜色变化来判断阴阳性，阳性为绿色，阴性为橘黄色；或将扩增产物在1.5%琼脂糖电泳上检测，阳性反应可观察到特征性梯形带，阴性反应则没有出现扩增条带。

1.2.5 LAMP反应灵敏度检测

以10倍递减将沙门氏菌浓度稀释为7×10⁸～7×10²CFU·mL⁻¹ 7个梯度，以热裂解法提取沙门氏菌DNA，然后取1 μL不同含量的沙门氏菌DNA作为模板，对LAMP反应灵敏度进行检测。结果直接肉眼观察，阳性反应显绿色，阴性反应显橘黄色，同时在2%琼脂糖凝胶电泳上检测。

1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测

取10 g经国标方法检测沙门氏菌阴性的蔬菜栽培土壤样品，置于装有90 mL蛋白胨缓冲水（BPW）的无菌均质袋中，分别加入灭菌生理盐水稀释至适宜含量的沙门氏菌0.5 mL，以制备含沙门氏菌含量为0、5×10¹、4×10²、1×10³、4×10³、1×10⁴、4×10⁴、1×10⁵CFU·g⁻¹的人工污染样品，将均质袋放置在拍击式均质器中拍打1 min，置37 ℃的恒温培养箱中预增菌4 h。预增菌后重新混匀土壤样品，吸取1 mL混匀土壤样品至FastDNA^® Spin Kit for Soil试剂盒中的土壤裂解管中，12 000 r·min⁻¹离心3 min，吸弃上清，然后在FastPrep^TM FP120核酸提取仪上提取土壤微生物总DNA，100 μL溶解土壤微生物总DNA，取1 μL作为LAMP反应扩增模板。

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测

利用所建立的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测方法对采自全省不同蔬菜产区的41份土壤样品进行沙门氏菌检测，同时采用国标方法（GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》）进行检测分析。

2. 结果与分析

2.1 LAMP检测方法的建立

通过反应温度和时间进行优化，确定LAMP最适反应温度为65 ℃，反应时间为1 h。优化后蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测最佳反应体系25 μL包括：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.4 mmol·L⁻¹ dNTPs，0.2 μmol·L⁻¹ F3-B3，1.6 μmol·L⁻¹ FIP-BIP，0.4 μmol·L⁻¹ Loop F～Loop B，0.8 mol·L⁻¹ Betaine，6.0 mmol·L⁻¹ MgSO₄，8 U Bst 2.0 DNA polymerase，50 μmol·L⁻¹ Calcein和500 μmol·L⁻¹ MnCl₂，DNA模板1 μl，灭菌超纯水补足25 μL体积。优化的LAMP反应效果如图1所示。

图 1 LAMP体系检测沙门氏菌

注：A: LAMP产物琼脂糖电泳检测结果; B: LAMP产物钙黄绿素显色结果M: DL2 000 DNA Marker, 1: 鼠伤寒沙门氏菌, 2: 阴性对照

Figure 1. Detection of Salmonella using optimized LAMP assay

Note: A: LAMP products shown on 2.0% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: S. typhimurium; 2: Negative control.

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2.2 特异性检测结果

分别以鼠伤寒沙门氏菌菌株和非沙门氏菌菌株的DNA为模板进行LAMP反应特异性分析，结果表明，在Calcein-MnCl₂指示剂的作用下，65 ℃温育1 h后，鼠伤寒沙门氏菌LAMP反应产物显绿色，而供试6个非沙门氏菌菌株的LAMP反应产物均显橘黄色（图2-A）。进一步取2 μL扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果除鼠伤寒沙门氏菌LAMP扩增产物出现梯形条带外，其他6个菌株均未出现任何条带（图2-B）。结果表明，本研究所建立的可视化LAMP检测方法对沙门氏菌具有良好的特异性。

图 2 LAMP方法检测沙门氏菌的特异性

注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果，B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2：鼠伤寒沙门氏菌，3：金黄色葡萄球菌，4：大肠埃希氏菌，5：产气肠杆菌，6：大肠埃希氏菌O157:H7，7：单核细胞增生李斯特氏菌，8：英诺克李斯特氏菌

Figure 2. Specificity of LAMP assay in detecting Salmonella

Note: A: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2: S. typhimurium; 3: Staphylococcus aureus; 4: Escherichia coli; 5: Enterobacter aerogenes; 6: E. coli O157:H7; 7: Listeria monocytogenes; 8: Listeria innocua.

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2.3 灵敏度检测结果

分别以7个不同含量沙门氏菌DNA为模板进行扩增来验证LAMP体系的灵敏度，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在每管25 μL LAMP反应体系中沙门氏菌DNA含量为7×10⁵～7 CFU时均可以出现LAMP产物特有的梯形条带（图3-A），而当沙门氏菌DNA含量为7 ×10⁻¹CFU时没有出现任何条带。可视化显色结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致（图3-B），说明LAMP反应体系可以检测到7 CFU沙门氏菌DNA。

图 3 LAMP方法检测沙门氏菌的灵敏度

注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果，B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2～8：每管反应体系中分别含有7×10⁵ CFU、7×10⁴ CFU、7×10³ CFU、7×10²CFU、7×10¹CFU、7 CFU、7 ×10⁻¹CFU

Figure 3. Sensitivity of LAMP assay in detecting Salmonella

Note: A: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2-8: Amplified products using DNA at concentration of 7×10⁵ CFU, 7×10⁴ CFU, 7×10³ CFU, 7×10² CFU, 7×10¹ CFU, 7 CFU, and 0.7 CFU, respectively, in LAMP reaction tube.

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2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果

人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品经37 ℃预增菌4 h后，提取土壤微生物总DNA进行扩增检测。分别设置0、5×10¹、4×10²、1×10³、4×10³、1×10⁴、4×10⁴、1×10⁵CFU·g⁻¹共7组不同梯度进行LAMP扩增检测。琼脂糖电泳结果显示，当LAMP反应体系中沙门氏菌含量为4×10²～1×10⁵ CFU·g⁻¹时均可以出现LAMP产物特有的梯形条带（图4-A），而当沙门氏菌含量为5×10¹ CFU·g⁻¹时没有出现任何条带。可视化显色结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致（图4-B），说明本LAMP反应体系检测蔬菜栽培土壤样品灵敏度为4×10² CFU·g⁻¹。

图 4 LAMP方法检测人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品

注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果；B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2~8：不同含量人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品扩增产物（0~1×10⁵ CFU·g⁻¹）

Figure 4. LAMP assay for detecting artificially inoculated Salmonella in soil samples

Note: a: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2-8: Amplified products on different concentrations of Salmonella in artificially inoculated soil samples (0-1×10⁵ CFU·g⁻¹).

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2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果

应用上述LAMP检测方法和国标检测法，同时对全省不同蔬菜产区的41份土壤样品进行沙门氏菌检测，结果见表3。2种方法都检测到2份沙门氏菌阳性样品和39份沙门氏菌阴性样品，LAMP检测方法与国标方法（GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》）检测结果一致，而LAMP检测将国标方法检测时间由5～7 d缩短至8 h内，大幅减轻了检测强度，提高了检测效率。

表 3 2种方法对比检测蔬菜栽培土壤沙门氏菌污染结果

Table 3. Salmonella detection in soil by two different methods

方法 Method	土壤样品 Soil samples	阳性 Positive	阴性 Negative
国标方法 National standard method	41	2	39
LAMP方法 LAMP method	41	2	39

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3. 讨论与结论

快速检测技术是监测和防控沙门氏菌等食源性疾病最重要的环节之一，而衡量快速检测技术性能最关键指标是检测用时与灵敏度。目前采用的国标检测方法《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016），需要对待检样品进行预增菌、选择性分离和生化试验鉴定等步骤，操作繁琐；最终拿到鉴定结果需要5～7d，耗时费力，难以满足沙门氏菌快速检测的要求。PCR方法虽然具有检测时间短、灵敏度高的特点，但需要专门的检测仪器（普通PCR仪或荧光定量PCR仪)，而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有更高的灵敏度和视觉判断性的优点，且检测过程不需要专门的检测仪器，弥补了国标检测方法和PCR方法检测沙门氏菌的不足。

沙门氏菌侵袭蛋白（invasion protein）基因簇是沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因，与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因，其中以invA基因应用最为广泛，目前根据invA基因序列设计特异性引物已成功应用于乳品、肉类、蔬菜等食品中沙门氏菌的检测^{[14, 15, 21]}。本研究根据沙门氏菌侵袭蛋白A （invA）基因序列设计特异性LAMP引物，建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的快速检测方法，对沙门氏菌纯菌检测灵敏度可达7 CFU/25 μL，人工污染的栽培土壤样品检测灵敏度为4×10² CFU·g⁻¹。采用该LAMP方法与国标检测方法对比检测蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染，结果表明LAMP检测结果与国标方法检测结果一致，说明该方法能成功应用于蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的快速检测，可为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的及时防控提供技术支撑。

图 1 紫花风铃木的不同花色

Figure 1. Different flower colors of H. impetiginosus

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图 2 紫花风铃木树皮的不同状态

Figure 2. Different conditions of tree barks of H. impetiginosus

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图 3 紫花风铃木不同的叶形

Figure 3. Different foliage shapes of H. impetiginosus

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图 4 62份紫花风铃木材料的表型性状聚类分析结果

Figure 4. Clustering map of 62 H. impetiginosus samples based on phenotypic traits

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表 1 62份紫花风铃木材料编号及来源

Table 1 Codes and origins of sampled 62 H. impetiginosus plants

来源 Origin	地理坐标 Geographic coordinate	城市 City	样品名称 Name	样品数量 Amounts of samples	树龄 Ages/年	花色 Color
顺德区顺峰山 Mountain Shunfeng , Shunde District	22°49′357″N 113°17′509″E	佛山 Foshan	sf1,sf2,sf3,sf4,sf5	5	12−14	深粉红、粉红 Dark pink,pink
三水区 Sanshui District	23°19′181″N 112°59′137″E	佛山 Foshan	fs1,fs2,fs4,fs5	4	12−16	深粉红、紫红 Dark pink,fuchsia
增城区 Zengcheng District	23°24′375″N 113°34′393″E	广州 Guangzhou	zc1,zc2,zc3,zc4	4	6−8	白、紫红 White,fuchsia
南沙区 Nansha District	22°46′312″N 113°26′489″E	广州 Guangzhou	ns1,ns3,ns4,ns5	4	5−12	深粉红、紫红 Dark pink,fuchsia
天河区天河公园 Tianhe Park,Tianhe District	23°07′768″N 113°21′810″E	广州 Guangzhou	th1,th2,th3,th4,th5	5	10	粉白、粉红、深粉红、紫红 Pinkish white,pink,dark pink,fuchsia
天河区龙洞 Longdong,Tianhe District	23°12′356″N 113°22′440″E	广州 Guangzhou	ld2,ld5,ld6,ld7,ld8	5	10−12	深粉红 Dark pink
天河区华南农业大学 SCAU,Tianhe District	23°09′168″N 113°21′215″E	广州 Guangzhou	sd1,smy2	2	5−10	粉红 Pink
天河区华南农业大学 SCAU,Tianhe District	23°09′271″N 113°21′566″E	广州 Guangzhou	smy3	1	5	紫红 Fuchsia
龙岗区金龙路 Jinlong Road,Longgang District	22°35′838″N 114°02′594″E	深圳 Shenzhen	jl5,jl6, jl7,jl8,jl9,jl10	6	11	粉红、深粉红、紫红 Pink,dark pink,fuchsia
福田区香蜜湖路 Xiangmihu Road, Futian District	22°32′468″N 114°01′643″E	深圳 Shenzhen	xm1,xm4,xm5,xm6,xm7, xm8	6	13−15	深粉红、紫红 Dark pink,fuchsia
共和镇 Gonghe Town	22°34′406″N 112°50′863″E	江门 Jiangmen	jm1,jm2	2	10−14	紫红 Fuchsia
新会镇 Xinhui Town	22°32′128″N 112°58′853″E	江门 Jiangmen	jm3,jm4	2	8−12	深粉红 Dark pink
新会镇 Xinhui Town	22°31′593″N 112°59′533″E	江门 Jiangmen	jm5,jm6,jm7,jm8	4	6	深粉红 Dark pink
惠东县 Huidong County	22°56' 210"N 114°32' 380"E	惠州 Huizhou	hd1,hd2	2	5	粉红 Pink
翠沙路 Cuisha Road	22°32′295″N 113°20′710″E	中山 Zhongshan	zs1,zs2,zs3,zs4,zs5,zs6, zs7, zs8,zs9,zs10	10	12−20	粉红、深粉红 Pink,dark pink
总计 Total				62

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表 2 紫花风铃木表型性状数量指标测定标准

Table 2 Scoring criteria on quantitative indices for phenotype traits of H. impetiginosus

性状 Phenotypic trait	评价标准 Evaluation criterion
叶面积 Leaf area/cm²	一片完整的复叶叶片所占的面积 The area of a fully expanded compound leaf
叶长 Leaf length/cm	一片完整复叶叶片的最长小叶叶尖到叶柄基部的距离 The length between leaf apex of the longest leaflet and the base of petiole in a fully expanded compound leaf
叶宽 Leaf width/cm	一片完整复叶叶片中宽度最大的位置 The largest stage of width in a fully expanded compound leaf
叶宽长比 Leaf width/leaf length	叶宽与叶长之比 Ratio of leaf width to leaf length
形状系数 Leaf shape coefficient	参照文中所述的公式进行计算 Follow the formula in the passage for calculating
叶柄长 Petiole length/cm	复叶叶轴基部到叶片基部的距离 The length between rachis base of a compound leaf and leaf base
小叶柄长 Petiolule length/cm	组成复叶的小叶基部的柄长 The footstalks length of the base of leaflet on a fully expanded compound leaf
小叶柄长/叶长 Petiolule length/leaf length	小叶柄长与叶长之比 Ratio of petiolule length and leaf length
枝下高 Under branch height/cm	从地表面到树冠第一层分枝点的高度 The height between the floor and first layer of branch node
胸径 Diameter at breast height/cm	主干离地表面胸高处（1.3 m）的直径；断面畸形时，测取最大值和最小值的平均值 Diameter around the trunk at 1.3 meters above the floor. If the testing section is deformed,the average of maximum and minimum results is used
花长 Flower length/cm	在一朵完整的单花上，长度为花瓣边缘到花基部的距离 The length between the margin of petal and the base of the flower within a full single flower
花量 Amounts of flowers	测定时在一个完整的花序上单花的数量 Amounts of every single flower in a full inflorescence when observed

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表 3 紫花风铃木表型性状质量指标赋值标准

Table 3 Scoring criteria on qualitative indices for phenotype traits of H. impetiginosus

性状 Phenotypic trait	赋值标准 Scoring criterion
性状 Phenotypic trait	1	2	3	4	5	6	7	8	9
叶尖 Leaf apex	急尖 Acute	渐尖 Acuminate	长渐尖 Long acuminate	骤尖 Cuspidate	细尖 Apiculate	尾尖 Caudate	具芒 Aristate
叶形 Leaf shape	卵形 Oval		卵圆 Ovoid		椭圆 Ellipsoidal		长椭圆 Oblong oval
叶缘 Leaf margin	光滑 Entire		细锯齿 Serrulate		锯齿 Serrate
叶基 Leaf base	偏斜 Oblique		平滑 Glabrate		楔形 Cuneate		圆滑 Smooth
花色 Flower color	白色 White		粉白 Pinkish white		粉红 Pink		深粉红 Dark pink		紫红 Fuchsia
开花时间/ （月−日） Time of blossom	11-15前 Before November 15^th	11-15至 11-30 November 15^th to November 30^th	12-01至 12-15 December 1^st to December 15^th	12-16至 12-31 December 16^th to December 31^st	次年01-01 至01-15 January 1^stto January 15^th in next year	次年01-16 至01-31 January 16^th to January 31^st in next year	次年02-01 至02-15 February 1^st to February 15^thin next year	次年02-16 至02-28 February 16^th to February 28^th in next year	次年03-01 以后 After March 1^st in next year
树皮颜色 Color of tree bark	灰白 Greyish white		灰棕 Greyish brown		浅灰褐 Putty		灰褐 Taupe		灰黑 Ash black
树皮状态 Condition of tree bark	光滑 Smooth		浅纵裂 Mild longitudinal crack		纵裂 Longitudinal crack		深纵裂 Deep longitudinal crack

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表 4 紫花风铃木表型性状的变异系数和Shannon多样性指数

Table 4 CVs and Shannon diversity indices of phenotype traits of H. impetiginosus

性状 Phenotypic trait	极小值 Minimum	极大值 Maximum	平均值 Average	标准差 SD	变异系数 CV	Shannon 多样性指数 Shannon diversity index
数量指标 Qualitative indices
叶面积 Leaf area/cm²	9.550	78.020	31.942	16.887	52.87%	4.08
叶长 Leaf length /cm	4.740	16.770	9.450	2.582	27.33%	4.06
叶宽 Leaf width /cm	2.420	7.620	4.515	1.310	29.02%	4.08
叶宽长比 Leaf width/leaf length	0.350	0.650	0.492	0.073	14.91%	3.17
形状系数 Leaf shape coefficient	0.400	0.710	0.535	0.072	13.53%	2.96
叶柄长 Petiole length/cm	3.100	20.000	9.155	3.085	33.70%	3.70
小叶柄长 Petiolule length/cm	0.820	6.560	2.467	0.869	35.23%	3.76
小叶柄长/叶长 Petiolule length/leaf length	0.140	0.470	0.266	0.073	27.46%	3.07
枝下高 Under branch height/cm	25.000	400.000	189.194	103.457	54.68%	3.10
胸径 Diameter at breast height/cm	2.000	40.000	14.806	7.368	49.76%	2.78
花长 Flower length/cm	7.000	18.000	12.548	2.386	19.02%	1.98
花量 Amounts of flowers	8.000	40.000	16.581	6.911	41.68%	2.48
质量指标 Quantitative indices
叶尖 Leaf apex	1.000	6.000	3.226	1.562	48.42%	1.26
叶缘 Leaf margin	1.000	5.000	3.419	1.542	45.10%	1.10
叶形 Leaf shape	1.000	7.000	4.452	2.086	46.85%	1.06
叶基 Leaf base	1.000	7.000	4.613	1.692	36.69%	0.79
树皮颜色 Color of tree bark	1.000	9.000	4.645	2.747	59.13%	1.21
树皮状态 Condition of tree bark	1.000	7.000	3.903	2.252	57.70%	1.58
花色 Flower color	1.000	9.000	6.419	1.860	28.98%	1.41
开花时间 Time of blossom	1.000	9.000	5.806	1.809	31.16%	1.36

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表 5 紫花风铃木表型质量性状的频率分布

Table 5 Frequency distribution of qualitative phenotype traits of H. impetiginosus

性状 Phenotypic trait	频率分布 Frequency distribution
性状 Phenotypic trait	1	2	3	4	5	6	7	8	9
叶尖 Leaf apex	0.016	0.419	0.323	0.016	0.016	0.210	0.000
叶形 Leaf shape	0.210		0.080		0.484		0.226
叶缘 Leaf margin	0.210		0.371	—	0.419
叶基 Leaf base	0.145		0.016		0.742		0.097
花色 Flower color	0.048		0.016		0.274		0.500		0.162
开花时间 Time of blossom	0.032	0.082	0.000	0.016	0.258	0.129	0.419	0.032	0.032
树皮颜色 Color of tree bark	0.178		0.371		0.032		0.290		0.129
树皮状态 Condition of tree bark	0.290		0.177		0.323		0.210

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表 6 紫花风铃木表型性状相关性分析

Table 6 Correlation of phenotype traits of H. impetiginosus

指标 Indices	叶面积 Leaf area	叶长 Leaf length	叶宽 Leaf width	叶宽长比 Leaf width/leaf length	形状系数 Leaf shape coefficient	叶柄长 Petiole length	小叶柄长 Petiolule length	小叶柄长/叶长 Petiolule length/leaf length	枝下高 Under branch height	胸径 Diameter at breast height	花长 Flower length	花量 Amounts of flowers	叶尖 Leaf apex	叶缘 Leaf margin	叶形 Leaf shape	叶基 Leaf base	树皮颜色 Color of tree bark	树皮状态 Condition of tree bark	花色 Flower color	开花时间 Time of blossom
叶面积 Leaf area	1.000	0.923 * *	0.951 * *	0.091	−0.103	0.452 * *	0.594 * *	−0.116	0.070	−0.051	0.209	0.081	0.138	0.024	−0.291 *	−0.313 *	0.049	−0.073	0.004	0.357 * *
叶长 Leaf length		1.000	0.837 * *	−0.197	−0.247	0.480 * *	0.554 * *	−0.229	0.112	0.099	0.266 *	0.104	0.128	−0.037	−0.162	−0.199	0.046	−0.049	0.047	0.205
叶宽 Leaf width			1.000	0.322 *	−0.059	0.409 * *	0.596 * *	−0.048	0.055	0.089	0.170	−0.020	0.202	0.086	−0.384 * *	−0.368 * *	0.121	−0.035	−0.016	0.410 * *
叶宽长比 Leaf width/leaf length				1.000	0.443 * *	−0.126	0.074	0.237	−0.097	−0.007	−0.144	−0.178	0.065	0.193	−0.355 * *	−0.316 *	0.210	0.003	−0.013	0.343 * *
形状系数 Leaf shape coefficient					1.000	−0.066	−0.027	0.175	−0.062	0.014	−0.026	0.105	−0.200	0.049	0.166	−0.153	0.133	−0.019	0.111	0.002
叶柄长 Petiole length						1.000	0.784 * *	0.474 * *	−0.002	0.059	0.250	0.037	−0.016	0.109	0.054	0.024	−0.003	0.014	−0.062	0.192
小叶柄长 Petiolule length							1.000	0.651 * *	0.137	0.230	0.310 *	0.065	0.014	0.001	−0.143	−0.129	0.179	0.148	0.022	0.291 *
小叶柄长/叶长 Petiolule length/leaf length								1.000	0.046	0.177	0.136	0.025	−0.071	0.095	−0.048	−0.013	0.161	0.223	−0.047	0.117
枝下高 Under branch height									1.000	0.592 * *	0.220	−0.089	−0.031	−0.034	−0.011	−0.016	0.378 * *	0.458 * *	0.067	0.076
胸径 Diameter at breast height										1.000	0.181	−0.094	0.178	−0.128	−0.086	−0.040	0.589 * *	0.558 * *	0.159	0.082
花长 Flower length											1.000	0.436 * *	−0.249	−0.072	0.246	−0.052	−0.020	0.199	0.139	−0.059
花量 Amounts of flowers												1.000	−0.190	−0.146	0.091	−0.177	−0.129	0.063	0.363 * *	−0.104
叶尖 Leaf apex													1.000	0.205	−0.122	0.071	0.157	0.053	0.068	0.184
叶缘 Leaf margin														1.000	−0.254 *	−0.213	0.113	−0.054	−0.302 *	0.171
叶形 Leaf shape															1.000	0.422 * *	−0.298 *	−0.018	0.153	−0.341 * *
叶基 Leaf base																1.000	−0.072	0.248	−0.010	−0.185
树皮颜色 Color of tree bark																	1.000	0.498 * *	0.100	−0.047
树皮状态 Condition of tree bark																		1.000	0.127	0.060
花色 Flower color																			1.000	−0.122
开花时间 Time of blossom																				1.000
“”表示在P＜0.05水平上显著相关，“”表示在P＜0.01水平上显著相关。 denotes significant correlation at P＜0.05. ** denotes significant correlation at P＜0.01.

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表 7 紫花风铃木表型性状的主成分分析

Table 7 Principal components of phenotype traits of H. impetiginosus

性状 Phenotypic trait	主成分1 PC1	主成分2 PC2	主成分3 PC3	主成分4 PC4	主成分5 PC5	主成分6 PC6
叶面积 Leaf area	0.880	−0.284	0.174	−0.183	0.130	0.060
叶长 Leaf length	0.803	−0.202	0.370	−0.340	0.057	0.004
叶宽 Leaf width	0.900	−0.272	−0.019	−0.128	0.144	0.096
叶宽长比 Leaf width/leaf length	0.199	−0.116	−0.668	0.389	0.287	0.212
形状系数 Leaf shape coefficient	−0.089	0.092	−0.235	0.576	0.391	0.211
叶柄长 Petiole length	0.624	0.031	0.323	0.336	−0.468	0.066
小叶柄长 Petiolule length	0.815	0.168	0.175	0.352	−0.278	0.099
小叶柄长/叶长 Petiolule length/leaf length	0.240	0.364	−0.129	0.716	−0.373	0.062
枝下高 Under branch height	0.222	0.645	−0.077	−0.280	0.053	−0.318
胸径 Diameter at breast height	0.306	0.756	−0.191	−0.240	0.071	−0.004
花长 Flower length	0.290	0.311	0.537	0.207	0.197	−0.319
花量 Flowers	0.046	0.073	0.498	0.261	0.517	−0.078
叶尖 Leaf apex	0.176	−0.043	−0.302	−0.427	−0.194	0.496
叶缘 Leaf margin	0.134	−0.213	−0.444	0.119	−0.210	−0.351
叶形 Leaf shape	−0.402	0.195	0.568	0.133	−0.137	0.224
叶基 Leaf base	−0.367	0.270	0.259	−0.169	−0.527	0.340
树皮颜色 Color of tree bark	0.271	0.595	−0.447	−0.143	0.124	−0.001
树皮状态 Condition of tree bark	0.142	0.779	−0.120	−0.116	−0.032	−0.008
花色 Flower color	0.001	0.289	0.265	−0.015	0.521	0.528
开花时间 Time of blossom	0.480	−0.170	−0.337	0.051	−0.073	0.085
贡献率 Contribution rate/%	21.429	13.496	12.374	9.617	8.485	5.755
累计贡献率 Cumulative contribution rate/%	21.429	34.925	47.299	56.916	65.401	71.156

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施引文献(1)

期刊类型引用(1)

高洁，陈伟，洪婷，姚帮本，姚丽，徐建国. 亚甲基蓝介导的电化学传感界面PCR鼠伤寒沙门氏菌检测方法. 合肥工业大学学报(自然科学版). 2023(12): 1706-1710 .

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图(4) / 表(7)

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0. 引言
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 蔬菜栽培土壤
1.1.2 材料与试剂
1.1.3 仪器与设备
1.1.4 菌株
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取
1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化
1.2.4 LAMP反应特异性检测
1.2.5 LAMP反应灵敏度检测
1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测
1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测
2. 结果与分析
2.1 LAMP检测方法的建立
2.2 特异性检测结果
2.3 灵敏度检测结果
2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果
2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果
3. 讨论与结论

0. 引言
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 蔬菜栽培土壤
1.1.2 材料与试剂
1.1.3 仪器与设备
1.1.4 菌株
1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取
1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化
1.2.4 LAMP反应特异性检测
1.2.5 LAMP反应灵敏度检测
1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测
1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测
2. 结果与分析
2.1 LAMP检测方法的建立
2.2 特异性检测结果
2.3 灵敏度检测结果
2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果
2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果
3. 讨论与结论

参考文献(22)

施引文献(1)

资源附件(0)

62份紫花风铃木的表型多样性分析

作者简介: 黄稚清（1995−），女，硕士，研究方向：风景园林（园林植物应用与城市绿化）和森林培育（E-mail：starlight0715@foxmail.com）

通讯作者: 冯志坚（1962−），男，博士，副教授，主要从事野生植物种质资源保护与利用研究（E-mail:11293409@qq.com）

计量

出版历程

Phenotypic Diversity of 62 Handroanthus impetiginosus Plants

0. 引 言

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤

1.1.2 材料与试剂

1.1.3 仪器与设备

1.1.4 菌株

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取

1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化

1.2.4 LAMP反应特异性检测

1.2.5 LAMP反应灵敏度检测

1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测

2. 结果与分析

2.1 LAMP检测方法的建立

2.2 特异性检测结果

2.3 灵敏度检测结果

2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果

2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果

3. 讨论与结论

期刊类型引用(1)

其他类型引用(0)

计量

出版历程

目录

0. 引 言

1. 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤

1.1.2 材料与试剂

1.1.3 仪器与设备

1.1.4 菌株

1.2 试验方法

1.2.1 引物设计

1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取

1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化

1.2.4 LAMP反应特异性检测

1.2.5 LAMP反应灵敏度检测

1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测

2. 结果与分析

2.1 LAMP检测方法的建立

2.2 特异性检测结果

2.3 灵敏度检测结果

2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果

2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果

3. 讨论与结论

作者简介:
黄稚清（1995−），女，硕士，研究方向：风景园林（园林植物应用与城市绿化）和森林培育（E-mail：starlight0715@foxmail.com）

通讯作者:
冯志坚（1962−），男，博士，副教授，主要从事野生植物种质资源保护与利用研究（E-mail:11293409@qq.com）

0. 引言

0. 引言