鸭骨形态发生蛋白SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

刘鸿威; 林昶; 王劭; 肖世峰; 程晓霞; 郑敏; 陈少莺; 曾显成; 陈仕龙

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2022.012.001

鸭骨形态发生蛋白SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

刘鸿威^{1, 2,},
林昶^{1, 2},
王劭^{2, 3},
肖世峰^{2, 3},
程晓霞^{2, 3},
郑敏^{2, 3},
陈少莺^{2, 3},
曾显成^1, ,,
陈仕龙^{2, 3, ,}

1.
福建农林大学动物科学学院（蜂学学院），福建　福州　350002
2.
福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建　福州　350013
3.
福建省农业科学院莆田分院，福建　莆田　351100

基金项目: 福建省农业科学院科技创新团队建设项目（CXTD2021034）；福建省农业高质量发展超越“5511”协同创新工程项目（XTCXGC2021018、XTCXGC2021012）；中央引导地方科技发展专项（2022L3019）

详细信息

作者简介:
刘鸿威（1997−），男，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究（E-mail：845369928@qq.com）

通讯作者:
曾显成（1974−），男，博士，高级实验师，主要从事动物病原微生物及免疫学研究（E-mail：zxc206@163.com）

陈仕龙（1979−），男，博士，研究员，主要从事动物病毒病研究（E-mail：CSL6116@163.com）

中图分类号: S 834
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出版历程
- 收稿日期: 2022-09-27
- 修回日期: 2022-11-30
- 网络出版日期: 2022-12-27
- 刊出日期: 2022-03-27

A SYBR Green I-based qRT-PCR Assay for Detecting Duck BMPs

LIU Hongwei^{1, 2,},
LIN Chang^{1, 2},
WANG Shao^{2, 3},
XIAO Shifeng^{2, 3},
CHENG Xiaoxia^{2, 3},
ZHENG Min^{2, 3},
CHEN Shaoying^{2, 3},
ZENG Xiancheng^1, ,,
CHEN Shilong^{2, 3, ,}

1.
College of Animal Sciences (College of Bee Science), Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou, Fujian　350002, China
2.
Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agriculture Sciences, Fuzhou, Fujian　350013, China
3.
Putian Branch, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian　351100, China

摘要

摘要:
目的旨在建立一种检测鸭骨形态发生蛋白（BMPs）mRNA转录水平的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法。
方法根据GenBank中BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的核苷酸序列设计并合成特异性引物进行PCR扩增，产物回收后克隆至pMD-18-T载体，构建阳性重组质粒作为标准品，优化SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR反应条件，建立其标准曲线，对建立的方法进行特异性、敏感性和重复性试验。
结果建立的BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15基因实时荧光定量检测方法特异性强，无引物二聚体及非特异性产物，熔解曲线为单峰，相关系数R²均大于0.998，组间和组内变异系数均小于1%。应用该方法检测BMPs基因在半番鸭组织中的表达水平，结果显示，BMP1、BMP2、BMP5和BMP7基因在心脏中表达量较高，分别为5.5×10⁴、1.1×10⁵、5.1×10⁵和7.7×10⁵拷贝·μL⁻¹；BMP6和BMP10基因在肝脏中表达量较高，分别为7.5×10⁴和7.6×10³拷贝·μL⁻¹；而BMP3、BMP4、BMP8a和BMP15分别在法氏囊、胸腺、喙和脾脏中表达量最高，分别为1.5×10⁵、2.1×10⁴、1.8×10³和3.3×10³拷贝·μL⁻¹。
结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法特异性强、重复性好，为检测鸭BMPs表达水平提供了技术手段。
- 鸭 /
- 骨形态发生蛋白（BMPs） /
- 荧光定量PCR /
- SYBR Green I
Abstract:
Objective An assay for detecting mRNA transcription of bone morphogenetic proteins (BMPs) in ducks using the SYBR Green Ⅰ-based qRT-PCR was developed.
Methods Specific primers were designed and synthesized according to the nucleotide sequences of duck BMPs in GenBank. The PCR amplified products were cloned into pMD-18-T vector, and the recombinant plasmids DNA used to establish standard curves. Specificity, sensitivity, and repeatability of the methodology were examined.
Result The newly developed qRT-PCR assay showed singe specific melting peaks of BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP10, and BMP15 separately with correlation coefficients (R²) higher than 0.998. The coefficients of variation within and between groups were less than 1%. The mRNA expressions of the BMPs were detected in different tissues of hybrid Muscovy ducks. The expressions of BMP1, BMP2, BMP5, and BMP7 in the heart were significantly higher than those in other tissues at 5.5×10⁴, 1.1×10⁵, 5.1×10⁵, and 7.7×10⁵ copies·μL⁻¹, respectively. BMP6 and BMP10 were highly expressed in the liver at 7.5×10⁴ and 7.6×10³ copies·μL⁻¹, respectively, while BMP3 in Bursa of Fabricius, BMP4 in the thymus, BMP8a in the beak, and BMP15 in the spleen at 1.5×10⁵, 2.1×10⁴, 1.8×10³, and 3.3×10³ copies·μL⁻¹, respectively.
Conclusion The newly developed qRT-PCR assay for the determination of mRNA expression of BMPs in ducks was specific, sensitive, repeatable, and applicable.
- Duck /
- bone morphogenetic proteins /
- qRT-PCR /
- SYBR Green I

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0. 引言

【研究意义】骨形态发生蛋白（Bone morphogenetic proteins，BMPs）家族除BMP1属于金属肽链内切酶家族外，其他均属于转化生长因子超家族。它们广泛存在，与两类特异受体结合组成信号传导通路诱导细胞内的一系列生理活动并参与生物体内多种功能，包括骨和喙的形成、羽毛发育、卵泡发育和癌症发生等^[1-2]。检测骨形态发生蛋白在宿主细胞的表达水平能反应宿主的发育生长状态，在临床应用中有着重要的价值。【前人研究进展】研究发现，BMP家族蛋白除了均对骨骼发育起作用外，BMP1、4、6、8a和15还在哺乳动物卵巢发育及卵泡发生过程的阶段中起作用^[3-7]；BMP家族蛋白基因还对动物体的发育有不同程度的调控作用，BMP2对胚胎心脏和羊膜发育起重要作用^[8]，BMP5可在动物急性损伤中被激活，从而促进动物不同器官和组织的修复^[9]，BMP7和BMP8a在肾的发育^[10]以及精子形成^[6]的过程中有重要作用；BMP3在成骨组织的形成，对骨组织中的其他BMP具有拮抗作用^[11]；BMP10主要表达于胚胎心脏发育，已证明可抑制多种癌症的发展^[12-14]。目前，在人（Homo）^[15]、大鼠（Rattus）^[16]、麻羊（Capra hircus）^[17]、军曹鱼（Rachycentron canadum）^[18]、兔（Oryctolagus cuniculus）^[19]等动物中均有构建部分BMP家族蛋白的SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR的检测方法。基因的mRNA表达水平的检测方法包括实时荧光定量RT-PCR技术和转录组测序（RNA-seq），但目前最常用的方法是实时荧光定量RT-PCR，其优势在于可以更加简便、快速、准确地进行定量表达。【本研究切入点】而目前用SYBR Green Ⅰ 荧光定量RT-PCR方法测定鸭BMP家族蛋白mRNA表达水平还未见报道。【拟解决的关键问题】本研究旨在建立一种用于检测鸭BMPs蛋白mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法，从而快速、精确检测鸭细胞和体内的BMPs蛋白mRNA转录水平，为BMPs蛋白的功能研究奠定基础。

1. 材料与方法

1.1 样本与细胞

无菌采集7日龄健康半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、上喙、肌肉组织，分别称量100 mg，加入1 mL Trizol后用高通量组织研磨仪研磨捣碎，提取RNA，−70 ℃保存备用；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；鸭胚成纤维细胞传代细胞系（DEFs）购自美国ATCC细胞库。

1.2 主要试剂

SYBR Green Ⅰ qPCR MIX和RNA提取试剂盒及RNA纯化试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，RT-PCR反转录试剂盒、胶回收试剂盒和Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DNase购自天根生化科技（北京）有限公司，质粒小提试剂盒购自QIAGEN公司，pMD-18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司，2×Dream Taq Green PCR Master Mix购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank登录的鸭BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15基因序列，应用Oligo 6软件，分别设计一对特异性的引物（表1），均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表 1 BMP基因的扩增引物

Table 1. BMP amplification primers

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence	扩增长度 Amplification length/bp	参考序列编号 GenBank No.
BMP1-F	CTTGAAGATGGAGCCGGAG	182	XM038166990
BMP1-R	TGTCTCCTTTGCTCAGCCTC	182	XM038166990
BMP2-F	CCACGAAGAAGTTTTGGAAG CTGTTGTTCTCAAAGGCTCC	156	XM027453308
BMP2-R	CCACGAAGAAGTTTTGGAAG CTGTTGTTCTCAAAGGCTCC	156	XM027453308
BMP3-F	ATGAACTTCTGATCGGTGTC	170	XM038178529
BMP3-R	GACCCTTGTCAGAGGATTAC	170	XM038178529
BMP4-F	CCACCATGAAGAGCACCTGG TTTATCCGGTGGAAGCCCCT	180	XM038179087
BMP4-R	CCACCATGAAGAGCACCTGG TTTATCCGGTGGAAGCCCCT	180	XM038179087
BMP5-F	CCCAACAGGGATGCAGACTT ACTTCGACCGTCCCCAGTTT	165	XM038177391
BMP5-R	CCCAACAGGGATGCAGACTT ACTTCGACCGTCCCCAGTTT	165	XM038177391
BMP6-F	CAAACAGATCCTCTGACCTG TTTACACTGAAACCGTCCTG	169	XM027451601
BMP6-R	CAAACAGATCCTCTGACCTG TTTACACTGAAACCGTCCTG	169	XM027451601
BMP7-F	AAAGCATAGACGGGCAAAGC TTTGGATCGATTCTGGCTCC	167	XM005010474
BMP7-R	AAAGCATAGACGGGCAAAGC TTTGGATCGATTCTGGCTCC	167	XM005010474
BMP8a-F	GCACCCTGCACATCAGCATC AGCCCATCATCCGTCTCCAC	202	XM038167176
BMP8a-R	GCACCCTGCACATCAGCATC AGCCCATCATCCGTCTCCAC	202	XM038167176
BMP10-F	TCCTGGACTTGGAGAACCTG	181	XM038167140
BMP10-R	GAATCCCAGCCAATCTCCTT	181	XM038167140
BMP15-F	ACGCCGTGGTGCAGAACTTGGT	157	XM027465364
BMP15-R	CAGGACTCTGCGATCATGTTCT	157	XM027465364

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1.4 cDNA样品的制备

用总RNA提取试剂盒按操作说明书分别提取鸭DEFs细胞的总RNA，提取的RNA经DNase消化后，用RNA纯化试剂盒纯化，溶于35 μL DEPC水，用于合成cDNA。按20 μL反应体系：总RNA 1 μg，5×Super Mix 4 μL，gDNA Remove 1 μL，加水补至20 μL，按说明书反应程序50 ℃ 5 min、85 ℃ 2 min，合成cDNA后用于PCR扩增及荧光定量PCR检测，剩余的cDNA放置于−20 ℃保存备用。

1.5 标准品的制备

用引物做常规PCR扩增组织样品基因，回收PCR产物，经试剂盒纯化后连接入pMD-18-T载体，转化至DH5α大肠杆菌，提取阳性质粒经PCR鉴定和通过序列测定分析验证后，测定DNA浓度，按公式计算标准品的拷贝数，以10倍系列稀释质粒标准品到下限至10⁻¹ 拷贝·μL⁻¹。

1.6 标准曲线的建立

以10倍稀释好的标准品为模板，使用SYBR Green I荧光定量PCR法进行测定。反应体系：SYBR Green Ⅰ Real-time PCR Master Mix 10 μL，上游/下游引物各0.5 μL，模板1 μL，ddH₂O 8 μL。

1.7 特异性和敏感性试验

应用1.4制备的cDNA样品，用常规PCR和荧光定量PCR验证所设计的BMP家族蛋白qPCR引物的特异性，对PCR产物进行核酸凝胶电泳及荧光定量PCR产物的熔解曲线进行分析，对扩增产物进行测序分析；将10¹～10³ 拷贝·μL⁻¹的阳性标准质粒作为模板，其qPCR的Ct值变异系数均小于1%的样本最低浓度即为检出限。

1.8 重复性试验

分别用所建立的qPCR方法检测半番鸭脾脏组织样品BMP家族蛋白的mRNA表达水平，组间、组内各进行3次重复性试验，并计算变异系数。

1.9 组织样品的BMPs基因荧光定量PCR检测

无菌采集3只雏半番鸭心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、喙和肌肉等组织，用总RNA提取试剂盒提取的组织RNA，用DNase去除基因组DNA后进行反转录合成cDNA，按照已确定的反应条件进行荧光定量PCR，计算各组织中BMPs基因的拷贝数，并进行统计分析。

2. 结果与分析

2.1 标准阳性质粒的制备

由DEFs细胞提取的总RNA经反转录成cDNA后，用表1中的特异性引物对BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15基因进行PCR扩增，3%琼脂糖凝胶电泳得到与目的片段大小一致的产物，大小介于156～202 bp（图1）。产物回收后与pMD-18-T载体连接，并转化DH5α感受态细胞。经PCR及测序鉴定，与预期结果一致。重组质粒DNA的测序结果表明，插入片段与原始片段的序列同源性为100%，表明成功构建了质粒标准品。

图 1 BMPs基因PCR扩增结果

M：DNA DL 500 相对分子质量标准；1～10分别为BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15。

Figure 1. PCR amplification of BMPs

M: DL500 DNA marker; 1-10: BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP10, and BMP15, respectively.

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2.2 荧光定量PCR检测

以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板进行qPCR，得到BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的扩增曲线（图2）、标准曲线（图3）及熔解曲线（图4）。结果表明，标准品起始模板浓度与Ct值呈现良好的线性关系，相关系数均达到0.998以上，熔解曲线扩增产物形成单一的特异性熔解峰。

图 2 BMP基因的SYBR Green I荧光定量PCR扩增曲线

A：1～6分别为6.03×10⁸～6.03×10³ copies·μL⁻¹，7为DEPC水；B：1～6分别为6.41×10⁸～6.41×10³ copies·μL⁻¹，7为DEPC水；C：1～6分别为1.73×10⁸～1.73×10³ copies·μL⁻¹，7为DEPC水；D：1～6分别为6.22×10⁷～6.22×10² copies·μL⁻¹，7为DEPC水；E：1～6分别为1.84×10⁸～1.84×10³ copies·μL⁻¹，7为DEPC水；F：1～6分别为1.85×10⁷～1.85×10² copies·μL⁻¹，7为DEPC水；G：1～6分别为1.49×10⁷～1.49×10² copies·μL⁻¹，7为DEPC水；H：1～6分别为7.01×10⁷～7.01×10² copies·μL⁻¹，7为DEPC水；I：1～6分别为6.03×10⁸～6.03×10³ copies·μL⁻¹，7为DEPC水；J：1～6分别为2.86×10⁷～2.86×10² copies·μL⁻¹，7为DEPC水。

Figure 2. Amplification curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

A: 1–6 represent 6.03×10⁸–6.03×10³ copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; B: 1–6 represent 6.41×10⁸–6.41×10³ copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; C: 1–6 represent 1.73×10⁸–1.73×10³ copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; D: 1–6 represent 6.22×10⁷–6.22×10² copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; E: 1–6 represent 1.84×10⁸–1.84×10³ copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; F: 1–6 represent 1.85×10⁷–1.85×10² copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; G: 1–6 represent 1.49×10⁷–1.49×10² copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; H: 1–6 represent 7.01×10⁷–7.01×10² copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; I: 1–6 represent 6.03×10⁸–6.03×10³ copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water; J: 1–6 represent 2.86×10⁷–2.86×10² copies·μL⁻¹, respectively, 7 represents DEPC water.

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图 3 BMP基因SYBR Green I荧光定量PCR的标准曲线

Figure 3. Standard curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

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图 4 BMP基因SYBR Green I荧光定量PCR的熔解曲线

Figure 4. Melting curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

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2.3 特异性试验

应用所设计的10个BMP家族基因引物对鸭胚成纤维细胞样品进行常规PCR扩增，仅出现单条带；应用引物进行qPCR检测，熔解曲线为单峰，无杂峰（图4），且扩增测序结果与对应目的基因的同源性为100%，表明本研究设计的引物特异性好。

2.4 敏感性检测

取含量为10¹～10³ 拷贝·μL⁻¹阳性标准重组质粒作为模板，每个样品组内重复3次，进行qPCR检测，计算各不同浓度样品的Ct值（ $\overline { x}\pm { \rm {SD}}$ ）。结果（表2）表明，BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15的检测下限分别为6.03×10²、6.41×10²、1.73×10²、6.22×10²、1.84×10²、1.85×10²、1.49×10²、7.01×10²、1.34×10²、2.86×10² 拷贝·μL⁻¹。

表 2 实时荧光定量PCR敏感性检测

Table 2. Sensitivity of qRT-PCR assay

基因 Gene	质粒浓度 Concentration of plasmid standard / (拷贝·μL⁻¹)	Ct值( $\overline { x}\pm { \rm {SD}}$ ) Ct value ( $\overline { x}\pm { \rm {SD}}$ )	变异系数 Coefficient of variation/%
BMP1	6.03×10³	26.48±0.05	0.18
	6.03×10²	29.94±0.10	0.33
	6.03×10¹	33.63±0.56	1.67
BMP2	6.41×10³	28.93±0.03	0.11
	6.41×10²	32.36±0.23	0.71
	6.41×10¹	33.97±0.62	1.83
BMP3	1.73×10³	26.11±0.03	0.12
	1.73×10²	29.40±0.21	0.72
	1.73×10¹	33.10±0.72	2.20
BMP4	6.22×10³	29.07±0.10	0.34
	6.22×10²	32.09±0.10	0.34
	6.22×10¹	33.94±0.55	1.64
BMP5	1.84×10³	28.38±0.16	0.58
	1.84×10²	30.10±0.24	0.82
	1.84×10¹	31.17±0.42	1.36
BMP6	1.85×10³	28.45±0.02	0.08
	1.85×10²	31.92±0.09	0.27
	1.85×10¹	36.35±0.46	1.28
BMP7	1.49×10³	29.39±0.07	0.25
	1.49×10²	32.72±0.10	0.31
	1.49×10¹	36.30±0.58	1.59
BMP8a	7.01×10³	26.44±0.04	0.15
	7.01×10²	30.10±0.07	0.24
	7.01×10¹	33.98±0.48	1.41
BMP10	1.34×10⁴	24.53±0.07	0.31
	1.34×10²	27.43±0.18	0.68
	1.34×10¹	30.44±0.53	1.74
BMP15	2.86×10³	28.11±0.07	0.23
	2.86×10²	32.14±0.19	0.58
	2.86×10¹	35.93±0.80	2.23

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2.5 重复性试验

将采集的半番鸭脾脏用所建立的方法分别对BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15进行重复性试验，计算变异系数，结果（表3）表示，组内变异系数为0.06%～0.28%，组间变异系数为0.32%～0.74%，变异系数均小于1%，表明重复性良好。

表 3 荧光定量PCR重复性试验结果

Table 3. Reproducibility of qRT-PCR assay

基因 Gene	组内重复性试验Ct值 The Ct values of intra-assay		组间重复性试验Ct值 The Ct values of inter-assay
基因 Gene	平均值±标准差 Means ± SD	变异系数 CV/%	平均值±标准差 Means ± SD	变异系数 CV/%
BMP1	20.19±0.02	0.12	20.04±0.08	0.42
BMP2	26.71±0.03	0.11	26.90±0.19	0.69
BMP3	28.88±0.08	0.28	28.79±0.12	0.41
BMP4	29.20±0.08	0.28	29.32±0.16	0.56
BMP5	31.06±0.06	0.20	31.37±0.23	0.72
BMP6	26.87±0.04	0.13	26.81±0.20	0.74
BMP7	23.40±0.03	0.12	23.52±0.11	0.47
BMP8a	32.14±0.07	0.22	32.11±0.19	0.60
BMP10	27.81±0.07	0.24	27.69±0.18	0.65
BMP15	25.13±0.01	0.06	25.17±0.08	0.32

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2.6 组织样品BMPs表达水平的qRT-PCR检测

提取半番鸭中各个组织RNA，反转录后进行荧光定量PCR检测，计算BMPs基因的拷贝值。结果（图5）表明，所检测的基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、上喙、肌肉中均有表达。BMP1、BMP2、BMP5和BMP7基因在心脏中表达量较高，分别为5.5×10⁴、1.1×10⁵、5.1×10⁵和7.7×10⁵ 拷贝·μL⁻¹；BMP6和BMP10基因在肝脏中表达量较高，分别为7.5×10⁴、7.6×10³ 拷贝·μL⁻¹；而BMP3、BMP4、BMP8a和BMP15分别在法氏囊、胸腺、喙和脾脏中表达量较高，分别为1.5×10⁵、2.1×10⁴、1.8×10³和3.3×10³ 拷贝·μL⁻¹。

图 5 荧光定量PCR检测不同组织中BMPs表达量

Figure 5. Expressions of BMPs in different tissues detected by qRT-PCR

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3. 讨论

目前为止，已确定的BMP家族成员约20个，但对于鸭BMP蛋白功能应用的研究较少。BMPs通过其分子的抗原决定簇与细胞表面的BMP Ⅰ型受体和Ⅱ型受体结合形成异源三聚体复合物，其中BMP配体与BMP Ⅱ型受体结合，使其氨基酸残基发生次磷酸化，激活Ⅱ型受体并磷酸化 Ⅰ 型受体的GS区（Glycine and serine-rich domain），激活 Ⅰ 型受体，并进一步将信号传递给细胞内的Smad蛋白。通过激活受体调节型Smad蛋白（Receptor regulate smad，R-smad）将信号传递至胞浆内，再和共同调节型Smad蛋白（Common mediator smad，Co-smad）结合后转移至细胞核，与靶基因结合诱导BMP蛋白合成^{[2, 20-21]}，参与诸如中胚层形成、神经系统分化、软骨、牙齿、骨骼发育以及癌症发生等许多重要的生物学过程。

通过本研究建立的qRT-PCR检测方法进行检测，发现鸭BMPs基因在已检测的8个组织中均有表达并呈现出一定的差异性。总体来看，BMP1～BMP7基因在各组织中拷贝量高于BMP8a、BMP10和BMP15基因；BMP1、BMP2、BMP5和BMP7基因在心脏中检测表达量较高，BMP6和BMP10基因在肝脏中的表达量较高，而BMP3、BMP4、BMP8a和BMP15基因分别在法氏囊、胸腺、喙和脾脏中的检出量最高。Somi等^[20]发现通过抑制BMP2、4、5、6、7蛋白的合成，会导致体外培养的鸡心肌细胞的形成数量下降，证明BMP蛋白对鸡心肌形成至关重要；Huang等^[22]发现BMP4基因具有调节人CD4⁺ T细胞中的糖酵解和干扰素γ的产生的机制； Wang等^[23]确定BMP6是内皮细胞与肝细胞间串扰的主要调节因子，并进一步影响小鼠体内游离铁离子的调节代谢，BMPs基因还有可能参与调控鸭的繁殖生长、疾病产生和发展等方面，具体有待深入研究探讨。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术相较于TaqMan实时RT-PCR的检测方法，成本低、无需设计探针；相较于常规PCR，减少了复杂的加样和电泳步骤，能够有效缩短样品的检测时间。本研究所设计的BMPs引物在常规PCR扩增出156～202 bp目的片段，均为单一条带，且无引物二聚体，荧光定量PCR所检测出的熔解曲线均为单峰，表明设计的引物特异性强；所绘制的标准曲线相关系数R²均大于0.998，组内变异系数为0.06%～0.28%，组间变异系数为0.32%～0.74%，均小于1%，表明该方法建立的标准曲线线性拟合度高，重复性良好，可以快速、精确、简便检测样品中BMPs的mRNA表达量。本研究建立的检测方法还可以通过同步检测BMPs和内参基因，得到BMPs mRNA的相对表达水平，为明确BMP家族蛋白在组织和细胞间的表达差异以及致病过程中BMP家族蛋白的表达机制研究奠定基础。

综上，本研究建立的鸭BMP家族蛋白mRNA转录水平的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性高、敏感性强、重复性好，可研究鸭不同组织和细胞中BMPs的差异，为检测鸭BMPs表达水平提供了技术手段。

图 1 BMPs基因PCR扩增结果

M：DNA DL 500 相对分子质量标准；1～10分别为BMP1、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8a、BMP10和BMP15。

Figure 1. PCR amplification of BMPs

M: DL500 DNA marker; 1-10: BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP10, and BMP15, respectively.

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图 2 BMP基因的SYBR Green I荧光定量PCR扩增曲线

Figure 2. Amplification curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

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图 3 BMP基因SYBR Green I荧光定量PCR的标准曲线

Figure 3. Standard curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

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图 4 BMP基因SYBR Green I荧光定量PCR的熔解曲线

Figure 4. Melting curves of BMPs by SYBR Green I qRT-PCR

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图 5 荧光定量PCR检测不同组织中BMPs表达量

Figure 5. Expressions of BMPs in different tissues detected by qRT-PCR

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表 1 BMP基因的扩增引物

Table 1 BMP amplification primers

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence	扩增长度 Amplification length/bp	参考序列编号 GenBank No.
BMP1-F	CTTGAAGATGGAGCCGGAG	182	XM038166990
BMP1-R	TGTCTCCTTTGCTCAGCCTC	182	XM038166990
BMP2-F	CCACGAAGAAGTTTTGGAAG CTGTTGTTCTCAAAGGCTCC	156	XM027453308
BMP2-R	CCACGAAGAAGTTTTGGAAG CTGTTGTTCTCAAAGGCTCC	156	XM027453308
BMP3-F	ATGAACTTCTGATCGGTGTC	170	XM038178529
BMP3-R	GACCCTTGTCAGAGGATTAC	170	XM038178529
BMP4-F	CCACCATGAAGAGCACCTGG TTTATCCGGTGGAAGCCCCT	180	XM038179087
BMP4-R	CCACCATGAAGAGCACCTGG TTTATCCGGTGGAAGCCCCT	180	XM038179087
BMP5-F	CCCAACAGGGATGCAGACTT ACTTCGACCGTCCCCAGTTT	165	XM038177391
BMP5-R	CCCAACAGGGATGCAGACTT ACTTCGACCGTCCCCAGTTT	165	XM038177391
BMP6-F	CAAACAGATCCTCTGACCTG TTTACACTGAAACCGTCCTG	169	XM027451601
BMP6-R	CAAACAGATCCTCTGACCTG TTTACACTGAAACCGTCCTG	169	XM027451601
BMP7-F	AAAGCATAGACGGGCAAAGC TTTGGATCGATTCTGGCTCC	167	XM005010474
BMP7-R	AAAGCATAGACGGGCAAAGC TTTGGATCGATTCTGGCTCC	167	XM005010474
BMP8a-F	GCACCCTGCACATCAGCATC AGCCCATCATCCGTCTCCAC	202	XM038167176
BMP8a-R	GCACCCTGCACATCAGCATC AGCCCATCATCCGTCTCCAC	202	XM038167176
BMP10-F	TCCTGGACTTGGAGAACCTG	181	XM038167140
BMP10-R	GAATCCCAGCCAATCTCCTT	181	XM038167140
BMP15-F	ACGCCGTGGTGCAGAACTTGGT	157	XM027465364
BMP15-R	CAGGACTCTGCGATCATGTTCT	157	XM027465364

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表 2 实时荧光定量PCR敏感性检测

Table 2 Sensitivity of qRT-PCR assay

基因 Gene	质粒浓度 Concentration of plasmid standard / (拷贝·μL⁻¹)	Ct值( $\overline { x}\pm { \rm {SD}}$ ) Ct value ( $\overline { x}\pm { \rm {SD}}$ )	变异系数 Coefficient of variation/%
BMP1	6.03×10³	26.48±0.05	0.18
	6.03×10²	29.94±0.10	0.33
	6.03×10¹	33.63±0.56	1.67
BMP2	6.41×10³	28.93±0.03	0.11
	6.41×10²	32.36±0.23	0.71
	6.41×10¹	33.97±0.62	1.83
BMP3	1.73×10³	26.11±0.03	0.12
	1.73×10²	29.40±0.21	0.72
	1.73×10¹	33.10±0.72	2.20
BMP4	6.22×10³	29.07±0.10	0.34
	6.22×10²	32.09±0.10	0.34
	6.22×10¹	33.94±0.55	1.64
BMP5	1.84×10³	28.38±0.16	0.58
	1.84×10²	30.10±0.24	0.82
	1.84×10¹	31.17±0.42	1.36
BMP6	1.85×10³	28.45±0.02	0.08
	1.85×10²	31.92±0.09	0.27
	1.85×10¹	36.35±0.46	1.28
BMP7	1.49×10³	29.39±0.07	0.25
	1.49×10²	32.72±0.10	0.31
	1.49×10¹	36.30±0.58	1.59
BMP8a	7.01×10³	26.44±0.04	0.15
	7.01×10²	30.10±0.07	0.24
	7.01×10¹	33.98±0.48	1.41
BMP10	1.34×10⁴	24.53±0.07	0.31
	1.34×10²	27.43±0.18	0.68
	1.34×10¹	30.44±0.53	1.74
BMP15	2.86×10³	28.11±0.07	0.23
	2.86×10²	32.14±0.19	0.58
	2.86×10¹	35.93±0.80	2.23

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表 3 荧光定量PCR重复性试验结果

Table 3 Reproducibility of qRT-PCR assay

基因 Gene	组内重复性试验Ct值 The Ct values of intra-assay		组间重复性试验Ct值 The Ct values of inter-assay
基因 Gene	平均值±标准差 Means ± SD	变异系数 CV/%	平均值±标准差 Means ± SD	变异系数 CV/%
BMP1	20.19±0.02	0.12	20.04±0.08	0.42
BMP2	26.71±0.03	0.11	26.90±0.19	0.69
BMP3	28.88±0.08	0.28	28.79±0.12	0.41
BMP4	29.20±0.08	0.28	29.32±0.16	0.56
BMP5	31.06±0.06	0.20	31.37±0.23	0.72
BMP6	26.87±0.04	0.13	26.81±0.20	0.74
BMP7	23.40±0.03	0.12	23.52±0.11	0.47
BMP8a	32.14±0.07	0.22	32.11±0.19	0.60
BMP10	27.81±0.07	0.24	27.69±0.18	0.65
BMP15	25.13±0.01	0.06	25.17±0.08	0.32

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参考文献(23)

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施引文献(4)

期刊类型引用(3)

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其他类型引用(1)

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图(5) / 表(3)

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0. 引言
1. 材料与方法
1.1 样本与细胞
1.2 主要试剂
1.3 引物设计与合成
1.4 cDNA样品的制备
1.5 标准品的制备
1.6 标准曲线的建立
1.7 特异性和敏感性试验
1.8 重复性试验
1.9 组织样品的BMPs基因荧光定量PCR检测
2. 结果与分析
2.1 标准阳性质粒的制备
2.2 荧光定量PCR检测
2.3 特异性试验
2.4 敏感性检测
2.5 重复性试验
2.6 组织样品BMPs表达水平的qRT-PCR检测
3. 讨论

0. 引言
1. 材料与方法
1.1 样本与细胞
1.2 主要试剂
1.3 引物设计与合成
1.4 cDNA样品的制备
1.5 标准品的制备
1.6 标准曲线的建立
1.7 特异性和敏感性试验
1.8 重复性试验
1.9 组织样品的BMPs基因荧光定量PCR检测
2. 结果与分析
2.1 标准阳性质粒的制备
2.2 荧光定量PCR检测
2.3 特异性试验
2.4 敏感性检测
2.5 重复性试验
2.6 组织样品BMPs表达水平的qRT-PCR检测
3. 讨论

参考文献(23)

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鸭骨形态发生蛋白SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

作者简介: 刘鸿威（1997−），男，硕士研究生，主要从事分子病毒学研究（E-mail：845369928@qq.com）

通讯作者: 曾显成（1974−），男，博士，高级实验师，主要从事动物病原微生物及免疫学研究（E-mail：zxc206@163.com） 陈仕龙（1979−），男，博士，研究员，主要从事动物病毒病研究（E-mail：CSL6116@163.com）

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