Formation and Gene Expression of Pigments in Eggplant Pericarp
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摘要:目的 探讨茄子果实生长发育过程中果皮主要色素含量变化及色素合成过程中相关基因的表达，为茄子生长发育过程中果皮颜色变化机理研究奠定基础。方法 以2份高代自交系茄子（绿色果皮启董和紫黑色果皮8果）为试验材料，分别于授粉后15、20、25、30、35 d进行花青素相对含量、叶绿素和类胡萝卜素含量的测定，同时对花青素生物合成结构基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS及转录因子MYB75、JAF13、WD40，叶绿素合成关键基因HEMA1, 类胡萝卜素合成关键基因PSY1进行表达分析。结果 启董茄子的花青素相对含量、叶绿素和类胡萝卜素含量均呈先升高后降低的趋势，分别在授粉后20 、25 、20 d达到峰值；8果茄子的花青素相对含量呈先升高再降低的变化趋势，在25 d时达到峰值，叶绿素和类胡萝卜素含量一直升高。与启董相比，8果茄子的花青素相对含量较高，叶绿素含量在15～25 d较低， 类胡萝卜素含量在30～35 d较高。启董中花青素合成结构基因和转录因子MYB75、JAF13、WD40在不同生长发育时期的表达相较于8果总体偏低且变化趋势相对稳定。8果中花青素合成相关结构基因的表达均在20 d达到顶峰，随后开始降低，转录因子MYB75、WD40表达量整体呈现先升高后降低的趋势，这与花青素相对含量的变化趋势一致。启董和8果中HEMA1、PSY1的表达量均与叶绿素、类胡萝卜素含量的变化趋势存在差异。结论 生长发育过程中，主要色素的含量及变化趋势在绿色果皮茄子启董和紫黑色果皮茄子8果之间差异明显，并且花青素、叶绿素和类胡萝卜素相关基因的表达模式不同，可进一步通过遗传学方法挖掘导致果色差异的主要基因。Abstract:Objective Changes in contents of main pigments and the expressions of related genes in pericarp of eggplant fruit during growth and development were studied concerning the color formation.Method Contents of anthocyanin, chlorophyll, and carotenoid in the fruits of two high-generation eggplant inbred lines, green Qidong and purple-black 8 guo, were measured at 15, 20, 25, 30, and 35 d after pollination. Expressions of the structural genes PAL, CHS, CHI, F3H, DFR, and ANS and the transcription factors MYB75, JAF13, and WD40 related to anthocyanin synthesis, as well as the key gene, HEMA1, in chlorophyll synthesis and PSY1 in carotenoid synthesis were analyzed.Result The contents of 3 categories of pigments in Qidong increased initially followed by a decline during the test period with peaks on the 20 d on anthocyanin, 25 d on chlorophyll, and 20 d on carotenoid. For 8 guo, the anthocyanin peaked on the 25 d, but chlorophyll and carotenoid continuously increased throughout the fruit development. 8 guo had higher relative contents of anthocyanin, lower chlorophyll from 15 d to 25 d, and higher carotenoid between 30 d and 35 d than Qidong. The expressions of anthocyanin synthesis structural genes and transcription factors MYB75, JAF13 and WD40 in Qidong were generally lower and relatively stable than those in 8 guo at different growth and development stages. The expression of anthocyanin synthesis structural genes in 8 guo reached a maximum on the 20 d and then began to decrease, while the expression of transcription factors MYB75 and WD40 rose at first and then decreased, which was similar to the trend observed on the anthocyanin. The expressions of HEMA1 and PSY1 in Qidong and 8 guo differed in the changing patterns of chlorophyll and carotenoid.Conclusion During growth and development, the two eggplant varieties of different colored skins underwent significantly different changes on the 3 pigments. The expressions of the pigment-related genes differed significantly as well, which could be studied from a genetic perspective to reveal the underline mechanisms of the observed color formation and differentiation.
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Keywords:
- Solanum melongena L. /
- pericarp color /
- anthocyanin /
- chlorophyll /
- carotenoid
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0. 引言
【研究意义】果实是植物的重要器官之一，鲜明的果实色泽能够吸引昆虫、鸟类等动物为植物散播种子[1-2]。而对育种者和消费者来说，果色不仅影响果实的外观品质，也是判断果实是否成熟的标准之一[3]，优良的品种需要充分表现出应有的色泽才能在市场上具有竞争力[4]。茄子作为一种重要的园艺作物，其果实颜色的种类、深浅以及均匀程度直接影响了茄子的商品价值和观赏价值。因此，研究果实生长发育过程中果皮主要色素含量的变化及相关基因表达对茄子优质品种的培育具有重要意义。【前人研究进展】自然界中决定果实颜色的色素主要包括花青素、叶绿素、类胡萝卜素和甜菜素，它们相对含量的改变引起了植物果实在生长发育过程中颜色的转变[5]。花青素作为植物中的一类次生代谢物，是影响颜色的主要因素[6]，在生物合成过程中受到关键结构基因苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）、花青素合成酶（ANS）以及转录因子MYB75、JAF13、WD40等的调控[7]。自然状态下，花青素不能稳定地单独存在，一般与糖类结合，以花色苷的形式存在于植物液泡中，并随着含量以及pH值的变化使植物器官呈现出不同的颜色[8-9]。叶绿素是植物参与光合作用的重要色素，其中σ-氨基酮戊酸（ALA）的合成是叶绿素合成途径的重要节点之一，直接影响叶绿素的合成，而HEMA基因编码谷氨酰-tRNA还原酶在ALA的合成中起关键作用[10-11]。类胡萝卜素也是一类重要的天然色素，在园艺植物中主要通过2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸（MEP）途径进行合成与积累，八氢番茄红素合成酶（PSY）是该过程中的重要限速酶[12]。茄子（Solanum melongena L.）原产于热带地区，目前在中国各地均广泛栽培，是夏季的主要蔬菜作物之一，含有丰富的营养物质。茄子果实的颜色多样，通常表现为绿色、紫色和白色，不同地域消费习惯的不同导致对茄子商品果颜色外观的要求不同，北方以紫黑茄为主，南方各种颜色均占一定的市场份额[13]。其中紫黑色果皮茄子中的花青素含量高且结构稳定，而绿色果皮和白色果皮茄子中的花青素含量较少[14]。【本研究切入点】虽然茄子果皮中色素的种类及代谢通路已有相关研究，但目前对茄子生长发育中果皮色素含量变化和相关基因表达的规律还鲜有报道。【拟解决的关键问题】以绿色果皮茄子启董和紫黑色果皮茄子8果为试验材料，对果实发育不同阶段的花青素、叶绿素和类胡萝卜素的含量进行检测，分析不同果色茄子果实中的色素积累模式差异及其与果色形成的关系，并检测与花青素、叶绿素、类胡萝卜素合成相关基因及转录因子的表达情况。初步揭示不同颜色茄子生长发育过程中果皮色素含量和相关基因表达量的变化趋势，为今后茄子果实皮色研究中关键基因和时间点的选择提供有益参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
绿色果皮茄子启董和紫黑色果皮茄子8果均在2021年9月定植于上海市农业科学院庄行试验站同一标准大棚中，保证温度、光照等外界环境因子的一致性，在授粉后 15、20、25、30、35 d分别取3个大小均匀、无明显病虫害的果实，分离果皮且取样部位和大小厚度尽量保持一致，剪碎后混样，锡箔纸包装，液氮速冻存于−80 ℃冰箱备用。
1.2 试验方法
1.2.1 花青素相对含量的测定
提取与计算参照Jeong等[15]和叶小利等[16] 的方法，根据实际情况略作改动。称取0.25 g的果皮组织，液氮研磨后加入5 mL的1%（体积分数）盐酸-甲醇溶液（4 ℃预冷），然后在4 ℃避光提取12 h，离心过滤取上清液，以1%的盐酸-甲醇溶液作为空白对照，测定600 、530 nm处的吸光值，每个时间点测定3个技术重复。以ΔOD=OD530−OD600=0.1作为花青素单位（Unit），花青素相对含量C（U·g−1）=10×ΔOD/m。m 为叶片的鲜重（g）。
1.2.2 叶绿素和类胡萝卜素含量的测定
取0.25 g的果皮样品，液氮研磨后加入5 mL80%的丙酮，在4 ℃黑暗中提取12 h。然后离心取上清，以80%的丙酮作为空白对照，在663 、645 、470 nm分别测定其吸光值，每个时间点测定3个技术重复。参照Porra的方法[17]计算叶绿素a，叶绿素b以及总叶绿素的含量。
计算公式：
Ct（mg·kg−1）=（8.02×OD663+20.21×OD645）×V/m。
Ca（mg·kg−1）=12.7×OD663−2.69×OD645。
Cb（mg·kg−1）=22.9×OD645−4.68×OD663。
其中Ct为总叶绿素含量，V为提取液的体积（mL），m为叶片的鲜重（g），Ca为总叶绿素a含量，Cb为总叶绿素b含量。
类胡萝卜素含量（mg·kg−1）=（4.367×OD470−0.014×Ca−0.454×Cb）×V/m。其中Ca为叶绿素a的质量浓度（mg·L−1），Cb为叶绿素b的质量浓度（mg·L−1）。
1.2.3 RNA提取以及反转录
根据Accurate Biotechnology（AG）公司的RNA提取试剂盒提取果皮的RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计检测RNA浓度，参照Evo M-MLV反转录试剂说明书（AG公司），20 μL反应体系合成cDNA，PCR反应程序设置为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存。
1.2.4 实时荧光定量PCR
选择腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因APRT作为内参。选择叶绿素合成的关键酶基因HEMA1，类胡萝卜素合成相关的八氢番茄红素合成酶基因PSY1，花青素合成通路中的关键酶基因PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS等，以及根据相关文献中发表的茄子花青素合成通路中转录因子MYB75[18]、JAF13[19]、WD40[20]的cDNA序列设计PCR引物（表1）。qRT-PCR使用20 μL体系，2×Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（Low Rox）10 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。在QuantStudio 5 Real-Time PCR Instrument（Applied Biosystems by Thermo Fisher Scientific）上进行qRT-PCR，反应程序设置为：95 ℃，5 min；95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，40个循环；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。最后根据2−ΔΔCT方法[21]计算基因相对表达量，所有数据进行3次重复。
表 1 茄子果皮中色素合成相关基因qRT-PCR引物Table 1. qRT-PCR primer of pigment synthesis-related gene in eggplant pericarp引物名称Primer name 序列（5′ to 3′）Sequence (5′ to 3′) APRT-FAPRT-RPSY1-FPSY1-RHEMA1-FHEMA1-RPAL-FPAL-RCHS-FCHS-RCHI-F GTGACCGTGCACTTGTGGTAGATGATGGCAACTCAATTACACATGCACACTTAACCGCAGCTAGTAGATTCCCCAGGAGGCACAAGAGATTTTGCATACGCCGTTGATGATCTTAGTCGTGGTTGTCTCGAGGCTGAACATCCTATTTCTGAAATCGCAATGGCCTCTTACCGCCACGAGATAGGTTGATGACATGGCAATATGTCAAGTGCTTGTGTTTAAGCAGCAACACTGTGGAGGACATTGTCAGAAGCAGTGTTGGATTCC CHI-R GATAGCCCACTTCCTGGTTTTTCAT F3H-FF3H-RDFR-FDFR-RANS-FANS-RMYB75-FMYB75-RJAF13-FJAF13-RWD40-FWD40-R GGTGAACTCGGATAGCAGCAGATTAATGTTATGGGCTCATCCATTATTGCCCCTTTTCTACCCGAAGCACTCTAGATTTCACCATTGGTCAACTGTCCTGCTACCTGAGACTGTCAATGAGGCTGCTATTTAGATTCTTCGGCAGGAACATAACAAGTGACAAGCAAACTACCGATGCACATTGTTCTTGTTGCATGGAGTTTCAATATGATCGATAAGGAAGTCTCGATTGTTCCAACTGCTACTGTTTTCGATGCCTGTGGCTGAGTTGGAAAGCGTTGTGCAGCAGACCACTGAATT 1.2.5 数据处理
利用Excel 2016软件计算统计试验中获得的数据，SPSS 21单因素方差分析（Duncan's法）对数据进行显著性分析。
2. 结果与分析
2.1 茄子果实生长发育过程中生长指标的变化
授粉后15～30 d两种茄子材料的生长发育趋势一致，且果形和大小相似。单果质量、果实横径和纵径均呈现上升的趋势，单果质量稳步增加，横径增长幅度较小（图1），启董的纵径在15～25 d内增长了12.5 cm；8果的纵径在15～20 d内增长了1 cm，幅度较小，在20～25 d增长了10.3 cm，幅度较大。30 d后各指标变化均趋于稳定（图2）。
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图 2 果实发育时期单果平均质量、横径和纵径的变化不同字母表示两个品种同一指标差异显著（P＜0.05）。下同。Figure 2. Related properties of eggplant at developmental stagesDifferent letters indicate significant difference on same index between two varieties at 0.05 level. Same for below.2.2 茄子果实生长发育过程中主要色素含量的变化
对主要色素含量分析可知，启董的花青素相对含量保持在较低的水平，且在除20 d外的其他时期没有显著性差异；8果的花青素相对含量变化呈现出先升高后降低的趋势，在25 d时达到峰值，并且各时期相对含量与启董相比均有显著性差异（图3-A）。启董的叶绿素含量先升高后降低，在15～30 d均保持较高的水平，20 d和25 d无显著性差异，在35 d含量降低，并与之前时期存在显著性差异，类胡萝卜素含量在20 d时达到峰值，与其他时期相比差异显著；8果的叶绿素和类胡萝卜素含量均随着时间逐渐上升，在35 d达到峰值。8果在花后15～25 d的叶绿素含量显著低于同时期的启董，30～35 d的类胡萝卜素含量显著高于同时期的启董（图3-B、C）。
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图 3 果实发育过程中果皮色素含量的变化Figure 3. Changes on pigment contents in pericarp during fruit development2.3 茄子果皮色素合成相关基因及转录因子的表达分析
为了验证设计的荧光定量引物的适用性，通过琼脂糖凝胶电泳分析了茄子果皮色素合成相关基因及转录因子在果实发育过程中各个时间点的条带，如图4所示，发现在60 ℃的退火温度下PCR产物均能够表现出清晰的条带，表明设计的引物能够用于后续的荧光定量分析。
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图 4 色素合成相关基因及转录因子的荧光定量引物验证Figure 4. Validation on fluorescence quantitative primers of genes and pigment synthesis-related transcription factorsqRT-PCR定量结果显示不同基因在不同材料中的表达模式有所不同（图5）。启董中花青素合成结构基因和转录因子MYB75、JAF13、WD40在不同生长发育时期的表达相较于8果总体偏低，且变化趋势相对稳定。随着果实发育的变化，8果中花青素合成相关结构基因的表达均在20 d达到顶峰，随后开始降低，这与花青素含量的变化趋势一致，转录因子MYB75、WD40表达量整体呈现先升高后降低的趋势，JAF13的表达随着果实发育逐渐下降。
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图 5 色素合成相关基因及转录因子的相对表达量Figure 5. Relative expressions of genes and pigment synthesis-related transcription factors与启董相比，8果材料中授粉后15～20 d的CHS表达量以及15～30 d 的PAL、CHI、F3H、DFR和ANS的表达量均显著高于启董（图5-A、B、C、D、E、F）；转录因子MYB75在除20 d的其他时期表达量显著高于启董，WD40在30 d时表达量显著高于启董，JAF13在各时期表达量显著高于启董（图5-G、H、I）。
对叶绿素和类胡萝卜素合成关键基因的表达进行分析发现，启董中叶绿素相关基因HEMA1表达相对稳定，类胡萝卜素相关基因PSY1表达量随时间升高；而8果中HEMA1呈现出表达量逐渐降低的变化趋势， PSY1表达量先升高后降低。8果的叶绿素相关基因HEMA1在15 d时高于启董，20～35 d低于启董。在15～20 d，8果的类胡萝卜素相关基因PSY1表达量高于启董，25 d之后则低于启董，且各时期均有显著性差异（图5-J、K）。
3. 讨论与结论
茄子果实的颜色主要由花青素、叶绿素和类胡萝卜素决定，花青素的颜色会掩盖叶绿素表现出来的绿色[22]，而当花青素不存在或者浓度很低时，茄子果实则表现为绿色[14]。本研究发现，在生长发育的15～35 d绿色果皮茄子启董的花青素相对含量保持稳定的低水平，紫黑色果皮茄子8果的花青素相对含量先升高后降低，这与王玲平等[23]、吴雪霞等[24]的研究结果相一致。其中紫黑色茄子果皮中的花青素相对含量要显著高于绿色茄子，周宝利等[25]的研究也表明紫茄果皮花青素相对含量比绿茄果皮的花青素相对含量高约 86.48%～82.74%，是提取花青素的理想材料。
花青素合成通路属于类黄酮合成通路的一个重要分支，其中涉及多个关键酶促反应[26-27]。PAL是催化植物次级代谢中苯丙烷途径的关键酶，除类黄酮外还参与了植保素、木质素及酚类物质的合成[28]，陈蒙等[29]在山葡萄的研究中发现PAL基因的表达量在生长发育前期呈现逐渐下降的规律性变化，而在后期变化不规则。在本研究的紫黑色茄子8果中发现PAL表达量在20 d达到峰值后降低，但在25 d后变化不规则，与前人研究结果相似，这种不规则的表达可能是因为PAL基因的表达调控受到多种因素的影响[30]。CHS催化形成花青素合成通路中的有色物质查尔酮，并为后续的合成提供碳骨架，在番茄[31]中下调其基因表达量导致颜色变浅，但在桑葚[32]以及本试验中的紫色果实中其表达量依然较低，表明该基因在不同物种中具有不同的表达模式。CHI是类黄酮化合物生物合成的上游关键基因之一，DFR和ANS是花青素合成后期的基因，3个基因的表达量对植物体内类黄酮含量以及花、叶和果实等器官的呈色有重要影响。试验结果表明，紫色茄子的F3H、CHI、DFR和ANS表达量与花青素相对含量的变化一致，在生长发育前期20 d时的表达量最高，表明这些基因在紫茄的颜色呈现中起到重要作用，相似的表达模式也出现在苹果[33]、越橘[34]中。
除此之外，花青素的合成也受到多种转录因子的调控。有研究发现紫色茄子果皮中MYB基因显著上调[20]，bHLH家族的转录因子TT8参与光诱导的茄子花青素合成[35]，而沉默辣椒中的MYB和WD40基因会导致花青素的含量下降，相关结构基因表达量下调[36]。本研究分别检测了MYB转录因子家族的MYB75，bHLH转录因子家族的JAF13和WDR转录因子家族的WD40表达量，结果发现MYB75和WD40的表达模式与相关结构基因表达量和色素含量的变化一致，但这不能说明JAF13与紫茄花青素合成无关，因为这三类转录因子不仅能够对结构基因单独调控，而且可以相互作用形成复合体共同调控[37]，从而影响各转录因子的相对表达量。
HEMA是调控叶绿素合成的关键基因家族，其中的成员HEMA1基因在苹果中的表达量与果实叶绿素含量变化趋势一致[38]，PSY1是类胡萝卜素合成途径的关键基因，有研究表明其与番茄果实中的类胡萝卜素含量密切相关[39]，但本研究结果发现，启董中叶绿素和类胡萝卜素含量呈现出先升高后降低的变化趋势，8果中叶绿素和类胡萝卜素含量呈现出逐渐上升的变化趋势，而在这两种材料中HEMA1和PSY1的表达量与色素含量的变化趋势均存在差异。叶绿素和类胡萝卜素的相关研究在茄子中还比较少，代谢通路中的相关基因和转录因子如何影响茄子中叶绿素与类胡萝卜素的合成与积累还有待进一步研究。
综上所述，在绿色果皮茄子启董和紫黑色果皮茄子8果生长发育过程中，启董的叶绿素、类胡萝卜素含量及8果的花青素相对含量呈现出先升高后降低的变化趋势，表明其分别与茄子的绿色和紫黑色有关。整体来看，两种材料花青素相关结构基因表达量与花青素相对含量的变化趋势一致，而转录因子的表达调控较为复杂，与花青素变化的关系还需深入研究，叶绿素和类胡萝卜素相关基因表达量与对应色素含量的变化趋势均存在差异。
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图 2 果实发育时期单果平均质量、横径和纵径的变化
不同字母表示两个品种同一指标差异显著（P＜0.05）。下同。
Figure 2. Related properties of eggplant at developmental stages
Different letters indicate significant difference on same index between two varieties at 0.05 level. Same for below.
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图 3 果实发育过程中果皮色素含量的变化
Figure 3. Changes on pigment contents in pericarp during fruit development
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图 4 色素合成相关基因及转录因子的荧光定量引物验证
Figure 4. Validation on fluorescence quantitative primers of genes and pigment synthesis-related transcription factors
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图 5 色素合成相关基因及转录因子的相对表达量
Figure 5. Relative expressions of genes and pigment synthesis-related transcription factors
表 1 茄子果皮中色素合成相关基因qRT-PCR引物
Table 1 qRT-PCR primer of pigment synthesis-related gene in eggplant pericarp
引物名称Primer name 序列（5′ to 3′）Sequence (5′ to 3′) APRT-FAPRT-RPSY1-FPSY1-RHEMA1-FHEMA1-RPAL-FPAL-RCHS-FCHS-RCHI-F GTGACCGTGCACTTGTGGTAGATGATGGCAACTCAATTACACATGCACACTTAACCGCAGCTAGTAGATTCCCCAGGAGGCACAAGAGATTTTGCATACGCCGTTGATGATCTTAGTCGTGGTTGTCTCGAGGCTGAACATCCTATTTCTGAAATCGCAATGGCCTCTTACCGCCACGAGATAGGTTGATGACATGGCAATATGTCAAGTGCTTGTGTTTAAGCAGCAACACTGTGGAGGACATTGTCAGAAGCAGTGTTGGATTCC CHI-R GATAGCCCACTTCCTGGTTTTTCAT F3H-FF3H-RDFR-FDFR-RANS-FANS-RMYB75-FMYB75-RJAF13-FJAF13-RWD40-FWD40-R GGTGAACTCGGATAGCAGCAGATTAATGTTATGGGCTCATCCATTATTGCCCCTTTTCTACCCGAAGCACTCTAGATTTCACCATTGGTCAACTGTCCTGCTACCTGAGACTGTCAATGAGGCTGCTATTTAGATTCTTCGGCAGGAACATAACAAGTGACAAGCAAACTACCGATGCACATTGTTCTTGTTGCATGGAGTTTCAATATGATCGATAAGGAAGTCTCGATTGTTCCAACTGCTACTGTTTTCGATGCCTGTGGCTGAGTTGGAAAGCGTTGTGCAGCAGACCACTGAATT 
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