Morphological and SRAP Markers-based Genetic Diversity Determination on Phaseolus lunatus L. Germplasms
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摘要:目的 探明莱豆种质资源遗传多样性和亲缘关系，为莱豆种质资源优良基因深度发掘和新品种选育提供科学依据。方法 利用形态标记和SRAP分子标记两种方法对22份莱豆资源的26个数量性状和 18个质量性状进行测定、分析。结果 筛选出的28对SRAP引物扩增多态性条带158条，平均多态性比率为77.75%。两种标记方法聚类结果显示，根据莱豆荚果大小可以将22份莱豆资源分为三大类群体。其中，“上横山10-2-6”和“下横山10-3-3”亲缘关系较近，推测可能存在频繁的基因交流。结论 22份莱豆资源遗传多样性丰富，形态标记和SRAP分子标记两种聚类方法基本支持根据荚果大小划分莱豆资源，为莱豆种质资源的创新利用奠定基础。Abstract:Objective Genetic diversity and relationship of Phaseolus lunatus L. germplasms were determined using the morphological and SRAP markers.Method Twenty-six quantitative and 18 quality traits of 22 lima bean germplasms were analyzed based on the morphological as well as the SRAP molecular markers.Result Twenty-eight pairs of SRAP primers were selected to obtain 158 amplified polymorphic bands with an average polymorphism ratio of 77.75%. The two methods applying different markers clustered the 22 varieties into 3 categories. Genetically, Shanghengshan10-2-6 and Xiahengshan 10-3-3 were relatively close. They might have gone through numerous gene exchanges in the past.Conclusion The 22 lima bean germplasms were rich in genetic diversity. The morphological and SRAP molecular markers-based clustering essentially agreed with the classification by the pod size.
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0. 引言
【研究意义】火龙果（Pitaya）又名仙蜜果，属仙人掌科，原产于中美洲热带沙漠地区，目前在广东、广西、云南、贵州、海南等省大规模种植[1-2]。火龙果茎中含有植物性多糖、VE、多种矿物质元素和甾醇等物质[3]。在火龙果栽培过程中，果农要不断修剪分枝，只需要保留1条主茎，不仅可以提高果实的产量和品质，还可以方便果实采摘运输，但由此产生大量修剪下来的火龙果枝条，又因为这些枝条在目前除了少量用于栽种，大部分的枝条都还没有得到合理的开发和利用，所以对火龙果茎多糖进行提取利用，可以提高火龙果种植的附加值。【前人研究进展】马若影等[4]对亚临界水提取火龙果茎多糖的工艺进行研究，通过单因素和正交试验得到最佳工艺参数为：温度140 ℃，时间25 min，液料比50∶1。徐曼旭等[5]研究薏米多糖亚临界水萃取发现亚临界水提取多糖得率和提取时间比水浸法有优势。包怡红等[6]提出压力为1.0 MPa，多糖提取率达到最高。刘焕燕等[7]通过试验证实了压力的主要作用是用来保持水的液体状态，它的变化对水的极性影响较小，所以对提取效果的影响不明显。据报道，部分多糖在稀酸条件下对其提取有一定的优势，能使多糖的提取率有所提高，然而酸性环境并不能够适合所有的多糖，只能针对某些植物多糖的提取。因为多糖中的糖苷键在酸性环境中会发生断裂，因此在试验中要求对多糖提取酸碱度的把控要精准。【本研究切入点】亚临界水适于萃取各种难萃取的天然产物和各种固体样品中的被测物，通过控制温度和压力还可以测定挥发性较强的物质和强极性物质[8-10],但目前关于亚临界水提取火龙果茎多糖的研究少见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用亚临界水提取火龙果茎多糖 ，并使用响应面法对试验数据进行优化，为后续火龙果茎多糖开发利用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试原料由海南省东方市北纬十八度果业有限公司提供。主要试剂：葡萄糖、浓硫酸、苯酚、盐酸，购于广州化学试剂厂；氢氧化钠、无水乙醇，购于西陇科学股份有限公司。以上试剂均为分析纯。主要仪器设备及来源：FDU-2100冷冻干燥机，上海爱朗仪器有限公司；中草药粉碎机（FW-177），天津市泰斯特仪器有限公司；离心机（GL-20G-Ⅱ），上海安亭科学仪器厂；HT-250FC亚临界水提取装置，上海霍桐实验仪器有限公司；752-N可见紫外分光光度计，上海精密仪器科学有限公司；EV-321旋转薄膜蒸发仪，北京莱伯泰科仪器股份有限公司；KQ-800KDE超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 原料预处理
称取清洗干净的红心火龙果茎1 200 g，将红心火龙果茎切成小块后放入培养皿中，在冻干机里冷冻干燥72 h后，将干燥后的火龙果茎粉碎，过42 目筛。取过筛后的固体粉末按10∶1的液料比（mL·g−1） 加蒸馏水，并将配好后的样品调节至合适的酸碱度，在250 W的超声频率下处理30 min备用[11-12]。
1.2.2 工艺流程
（1）工艺流程：火龙果茎冻干粉→过筛→调节pH→亚临界水提取→离心→上清液→浓缩→乙醇沉淀→静置→离心→冷冻干燥→火龙果茎多糖。
（2）操作要点： 预处理后的样品，按所需料液比加蒸馏水，置于亚临界水提取装置中，按着设定的液料比、温度、pH值和提取时间，对其进行提取，提取结束后以8 000 r·min−1离心10 min，取上清液，旋转蒸发仪浓缩，加入无水乙醇至体积分数为80%，经充分搅拌后，于4 ℃下 静置12 h，再在8 000 r·min−1条件下离心5 min，取沉淀冷冻干燥得火龙果茎多糖。
1.2.3 葡萄糖标准曲线的建立
采用史伟国等[13]的方法，称葡萄糖粉末10 mg用蒸馏水溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg·mL−1葡萄糖标准液。标准液按梯度浓度测吸光度，用Excel做出图表，横坐标为葡萄糖浓度C，纵坐标为490 nm处吸光度A，根据所测得数据绘制出标准曲线。得标曲方程为Y=47.72X+0.008 2，相关系数为 0.994 1。
1.2.4 多糖的测定
称取火龙果茎多糖5 mg，定容至50 mL，得0.1 mg·mL−1的溶液，再根据1.2.3的方法测定火龙果茎粗多糖的吸光度，利用葡萄糖标准曲线由吸光度算出火龙果茎多糖含量C。
Y=[(C×V)/W]×100% 式中：Y为火龙果茎多糖提取率，%；C为火龙果茎多糖含量，mg·mL−1；V为提取液体积，mL；W为火龙果茎粉质量，mg。
1.2.5 提取火龙果茎多糖的单因素试验
亚临界水萃取的影响因素[14]包括温度、液料比、时间、改良剂及压力。根据Bin Li等[15]研究结果表明亚临界水萃取中萃取温度对萃取效率影响最大，赵健等[16]研究表明亚临界水萃取时间也是重要的因素之一，本试验在液料比为30∶1，提取时间为20 min，pH为5，温度为140 ℃时，控制变量让温度以20 ℃ 为梯度从100 ℃增加至180 ℃；时间以5 min为梯度从10 min增加至30 min；液料比 （mL·g−1）以10为梯度从20∶1增加至60∶1 ；pH值以1为梯度从4增至8提取。
1.2.6 响应面分析试验
根据单因素探究的数据，用Design Expert 10.0软件对提取温度（A）、时间（B）、液料比（C）、pH值（D）等4因素的3个水平用Box-Behnken设计试验，以多糖提取率为响应值优化火龙茎多糖的提取工艺，因素水平见表1。
表 1 响应面分析试验因素与水平Table 1. Response surface test factors and levels水平
LevelA温度
Temperature/℃B时间
Time/minC液料比
Liquid-to-material ratio/
（mL·g−1）D pH 1 160 25 50 6 0 150 20 40 5 −1 140 15 30 4 1.3 数据处理
单因素研究中的数据选用Excel软件做出折线图，采用Design Expert 10.0软件对数据进行分析。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 提取温度对火龙果茎多糖提取率的影响
如图1所示，100~140 ℃，温度与多糖的提取率成正比，至140 ℃时提取率达到21.45%，然而在140 ℃出现拐点，此温度以后，火龙果茎多糖的提取率和温度呈反比例的关系，因为在温度过高的条件下火龙果茎多糖糊化。温度过低，随着温度升高，水的介电常数、黏度、表面张力明显下降，分子的扩散速率有所增加[17]。140~160 ℃阶段趋于平衡，但是考虑到高温导致多糖糊化的因素，选择提取温度136~160 ℃ 比较合适。
2.1.2 提取时间对火龙果茎多糖提取率的影响
根据图2可知，从提取时间为10 min开始，多糖的提取率也随之增加，当时间达到15 min时，提取率达到最大。但随着提取时间的增加，在15 min以后的提取率先是逐渐下滑后又处于平缓。以13~20 min的提取时间较为合适。
2.1.3 液料比对火龙果茎多糖提取率的影响
试验结果图3可看出，从20∶1（mL·g−1） 的液料比开始，加水量的增加对多糖的提取率产生有利的影响使得提取率与液料比正相关，直到加水至液料比达30∶1（mL·g−1） 时多糖的提取率相对高。然而在30∶1（mL·g−1） 后，随着液料比升高多糖的提取率下跌。液料比过低的条件下多糖不能完全被溶解从而对提取率产生不利影响，反之加水量过多不仅会降低浓度，同时也会造成难以浓缩。所以选择液料比为30∶1（mL·g−1） 左右较为适宜。
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图 3 液料比对多糖提取率的影响Figure 3. Effect of Liquid-to-material ratio on polysaccharide extraction2.1.4 pH对火龙果茎多糖提取率的影响
由图4可看出，pH在4~8时多糖提取率先升后降，pH 值5时多糖提取率出现了拐点，此时的提取率为21.45%。在pH值5以后，提取率开始呈现出下降的趋势。因为过酸过碱的条件都会导致多糖的水解，所以选择pH值5为最适条件。
2.2 响应面优化提取的结果及分析
2.2.1 回归模型的建立
响应面试验设计及结果如表2所示，以多糖提取率（Y）为响应值，经过多元回归拟合，得到回归方程：Y（%）=21.954.54A−2.86B−2.69C+0.44D−1.76AB+1.36AC−0.73AD+0.29BC+0.29BD+0.14CD−3.34A2−2.24B2−0.60C2−0.72D2。
表 2 响应面试验设计及结果Table 2. Design and results of Box-Behnken experiment序号
No.A温度
Temperature/
℃B时间
Time/
minC液料比
Liquid-to-material
ratio/（mL·g−1）DpH Y提取率
Extraction
rate/%1 0 0 0 0 20.57 2 −1 1 0 0 21.62 3 −1 −1 0 0 22.52 4 −1 0 0 −1 19.42 5 0 −1 1 0 20.69 6 1 0 1 0 10.39 7 0 1 −1 0 16.78 8 0 0 1 −1 17.98 9 −1 0 1 0 17.17 10 0 0 0 0 22.12 11 0 1 0 1 14.62 12 1 0 0 −1 12.48 13 0 −1 0 1 18.48 14 1 1 0 0 8.74 15 1 0 −1 0 14.21 16 0 0 0 0 23.65 17 −1 0 0 1 24.62 18 0 0 1 1 20.12 19 0 0 −1 1 25.04 20 0 0 0 0 22.62 21 1 −1 0 0 16.68 22 0 −1 −1 0 25.67 23 0 0 −1 −1 23.46 24 0 1 1 0 12.98 25 0 0 0 0 20.78 26 1 0 0 1 14.76 27 0 −1 0 −1 22.01 28 0 1 0 −1 17.00 29 −1 0 −1 0 26.43 2.2.2 显著性检验
由表3可看出模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），方程的相关系数为 0.902 3，则方程拟合度较好，可用得出的回归方程描述各个因素与多糖提取率的关系，对火龙果茎多糖提取率进行预测。由表中各个因素的P值可得出温度、时间、液料比3个因素对火龙果茎多糖提取率影响极显著，pH因素对多糖提取率影响不显著。在所选的因素条件范围内，由F值可知，对火龙果茎多糖提取率的影响程度顺序为：温度＞时间＞液料比＞pH。
表 3 回归模型方差分析结果Table 3. Analysis of variance for fitted regression model项目
Source平方和
Sum of
squares自由度
df均方
Mean
squareF P 显著性
Signi
ficanceModel 527.00 14 39.14 9.24 ＜0.0001 ** A-温度 247.61 1 247.70 58.46 ＜0.0001 ** B-时间 98.10 1 98.1 23.15 0.0003 ** C-液料比 86.73 1 86.73 20.47 0.0005 ** D-pH 2.33 1 2.33 0.55 0.4704 AB 12.39 1 12.39 2.92 0.1093 AC 7.40 1 7.40 1.75 0.2076 AD 2.13 1 2.13 0.50 0.4898 BC 0.35 1 0.35 0.082 0.7786 BD 0.33 1 0.33 0.078 0.7841 CD 0.078 1 0.078 0.019 0.8937 A2 72.30 1 72.30 17.06 0.0010 ** B2 32.69 1 32.69 7.71 0.0148 * C2 2.36 1 2.36 0.56 0.4675 D2 3.36 1 3.36 0.79 0.3882 残差 Residual 59.32 14 4.24 失拟项 Lack of fit 52.68 10 5.27 3.17 0.1385 误差项 Pure error 6.64 4 1.66 注：*表示显著影响（P＜0.05），**表示极显著影响（P＜0.01）。
Note:* :significant influence（P＜0.05），** : extremely significant influence（P＜0.01）.2.2.3 不同因素间的响应面分析
图5显示了提取温度（A）、提取时间（B）、液料比（C）、pH值（D）4个因素对火龙果茎多糖提取率的3D 响应面图和等高线图。响应曲面图中曲面反映了各因素对响应值的影响大小，响应曲面越陡峭，则表示该因素对响应值影响较大，反之则较小[18]。图中响应面趋势较为陡峭，表明提取温度、提取时间、液料比的影响具有显著性，但pH值及各因素的交互作用不明显，响应面趋势较为平缓，交互作用不显著。
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图 5 各因素交互作用的响应面图注：A－时间和温度对多糖提取率影响的曲面图；B－液料比和温度对多糖提取率影响的曲面图；C－pH和温度对多糖提取率影响的曲面图；D－液料比和时间对多糖提取率影响的曲面图；E-时间和pH对多糖提取率影响的曲面图；F-液料比和pH对多糖提取率影响的曲面图。Figure 5. Response plot of interactions between factorsNote: A: surface plot of time and temperature effects on polysaccharide extraction rate; B: surface plot of liquid-to-material ratio and temperature effects on polysaccharide extraction rate; C: surface plot of pH and temperature effects on polysaccharide extraction rate; D: surface plot of liquid-to-material ratio and time effects on polysaccharide extraction rate; E: surface plot of time and pH effects on polysaccharide extraction rate; F: surface plot of liquid-to- material ratio and pH effects on polysaccharide extraction rate.2.3 验证试验
为了验证响应面法分析所得到的结果是否可靠，用Design-Expert软件优化回归模型进行的工艺参数，确定亚临界水提取多糖的工艺条件为：液料比31.25∶1（mL·g−1） 、pH值 5.86、温度143.64 ℃、时间19.04 min时，预测火龙果茎多糖提取率为26.528%。在优化条件下做3 次平行试验验证火龙果茎多糖提取率为26.46%，验证试验所得到的数据和响应面法预测得到的数据是相近的，说明该回归模型很好地反应各因素对多糖提取率的影响，证明使用该方法来研究亚临界水萃取火龙果茎多糖的工艺是可行的。
3. 讨论与结论
多糖的提取通常采用热水提醇沉法、超声波提取法、微波辅助提取法、生物酶解提取法和碱法提取，每种提取方法具有各自的优势，但也存在一些缺点，比如热水提醇沉法提取率低、耗时长，碱法提取溶剂的用量较大、同时产生一定的环境污染，生物酶解提取法提取成本较大，较难工业化生产。亚临界水提取技术提取范围广、提取效率高，是一项绿色、环保的新兴提取分离技术。目前采用亚临界水提取技术提取火龙果茎多糖的相关研究鲜有报道。因此，本研究通过单因素的探究提供的依据下，选取多糖提取率为响应值，采用响应面法分析优化亚临界水提取火龙果茎多糖的工艺条件，得出最佳提取工艺为：提取温度144 ℃、提取时间19 min、液料比 （mL·g−1） 31∶1，pH值5.9，在优化条件下火龙果茎多糖提取率是26.47%。此外，本研究多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，使用的标准品是葡萄糖，但李丹丹[19]指出植物多糖水解后的单糖成分有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸等成分，所以测出来的吸光度就只是葡萄糖的数据，其他的糖分则测不出来，如果能采用各种糖并且按照合理比例配成标准液，试验结果将更加准确。
通过响应面法优化的火龙果茎多糖提取工艺模型具有较高的可行性，优化后的工艺条件可提高火龙果茎多糖提取率。
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表 1 供试莱豆种质资源
Table 1 P. lunatus germplasms studied
编号 Code 材料名称 Name 原产地 Orign 编号 Code 材料名称 Name 原产地 Orign 1 铁灶本 莆田市城厢区霞林办铁灶村 12 DJ-11-3-1-1 莆田市仙游县大济镇 2 莆1046 莆田市荔城区新度镇渠桥村 13 FT-08-2-5-3 莆田市仙游县枫亭镇 3 JD-1603 莆田市荔城区黄石镇清前村 14 DW17-1-5 莆田市仙游县度尾镇 4 莆莱1号 莆田市农科所选育 15 14LD-5-2-7 莆田市仙游县赖店镇 5 龙莱1号 龙岩市龙津作物所选育 16 DW15-6-1 莆田市仙游县度尾镇 6 QC12-1-17-3 莆田市荔城区新度镇青垞村 17 小莱豆16-5-6 莆田市城厢区常太镇 7 QC12-2-6-5 莆田市荔城区新度镇青垞村 18 小莱豆16-21-11 莆田市城厢区常太镇 8 横山10-1—1 莆田市荔城区新度镇横山村 19 中莱16-12-5 莆田市新度镇渠桥村 9 上横山10-2-6 莆田市荔城区新度镇横山村 20 武平黑花籽扁豆 龙岩市武平县 10 下横山10-3-3 莆田市荔城区新度镇横山村 21 PLQQ-08-2-6 莆田市荔城区新度镇渠桥村 11 新周13-6-2-7 莆田市仙游县园庄镇新周村 22 PLQQ-08-5-3 莆田市荔城区新度镇渠桥村 
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表 2 SRAP分析所用的引物序列
Table 2 Primer sequences used in SRAP analysis
编号Code 上游引物序列（5′-3′）Upstream primer sequences 下游引物序列（5′-3′）Downstream primer sequences me1em20 TGAGTCCAAACCGGATA GACTGCGTACGAATTCAG me2em13 TGAGTCCAAACCGGAGC GACTGCGTACGAATTGGT me2em20 TGAGTCCAAACCGGAGC GACTGCGTACGAATTCAG me4em2 TGAGTCCAAACCGGACC GACTGCGTACGAATTTGC me4em4 TGAGTCCAAACCGGACC GACTGCGTACGAATTTGA me4em11 TGAGTCCAAACCGGACC GACTGCGTACGAATTTCG me5em2 TGAGTCCAAACCGGAAG GACTGCGTACGAATTTGC me5em8 TGAGTCCAAACCGGAAG GACTGCGTACGAATTCTG me5em13 TGAGTCCAAACCGGAAG GACTGCGTACGAATTGGT me6em2 TGAGTCCAAACCGGTAA GACTGCGTACGAATTTGC me6em3 TGAGTCCAAACCGGTAA GACTGCGTACGAATTGAC me7em12 TGAGTCCAAACCGGTCC GACTGCGTACGAATTGTC me8em2 TGAGTCCAAACCGGTGC GACTGCGTACGAATTTGC me8em4 TGAGTCCAAACCGGTGC GACTGCGTACGAATTTGC me8em11 TGAGTCCAAACCGGTGC GACTGCGTACGAATTTCG me10em2 TGGGGACAACCCGGCTT GACTGCGTACGAATTTGC me10em3 TGGGGACAACCCGGCTT TGAGTCCAAACCGGAAT me10em4 TGGGGACAACCCGGCTT TGAGTCCAAACCGGACC me11em4 TGGGGACAACCCGGTTC TGAGTCCAAACCGGACC me11em7 TGGGGACAACCCGGTTC GACTGCGTACGAATTATG me12em4 TGGGGACAACCCGGTAG GACTGCGTACGAATTTGA me13em1 TGGGGACAACCCGGTCA GACTGCGTACGAATTAAT me13em3 TGGGGACAACCCGGTCA TGAGTCCAAACCGGAAT me13em9 TGGGGACAACCCGGTCA GACTGCGTACGAATTACG me13em14 TGGGGACAACCCGGTCA GACTGCGTACGAATTCAG me13em15 TGGGGACAACCCGGTCA GACTGCGTACGAATTCTG me14em1 TGGGGACAACCCGGTGT GACTGCGTACGAATTAAT me14em3 TGGGGACAACCCGGTGT GACTGCGTACGAATTGAC
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表 3 莱豆种质资源数量性状
Table 3 Quantifiable traits of P. lunatus
品种编号Variety code 第一对真叶First pair of true leaves 顶端小叶Top lobule 主蔓粗Main stem diamete/cm 鲜荚fresh pods 鲜豆百粒重hundred-grain weight of frsh bean/g 干荚Dry pods 干豆百粒重hundred-grain weight of dry bean/g 真叶长True leaf length/cm 真叶宽True leaf width/cm 叶长Leaf length/cm 叶宽Leaf width/cm 叶柄长Petiole length/cm 叶柄粗Petiole thickness/mm 荚长Pod length/cm 荚宽Pod width/cm 荚重Pod weight/g 荚粒数pod seednumber 荚长Pod length/cm 荚宽Pod length/cm 荚重Pod weight/g 荚粒数pod seed number 1 9.39 9.10 11.18 7.70 9.10 2.33 1.23 10.74 2.79 12.66 2.61 312.21 10.78 2.50 4.92 2.40 155.08 2 7.75 6.43 10.82 7.02 9.47 2.22 1.39 10.14 2.75 13.45 2.62 349.17 11.15 2.32 5.55 2.60 163.73 3 8.48 8.08 10.72 6.22 10.32 2.00 1.30 10.69 2.56 12.81 2.53 313.80 15.69 2.24 5.08 2.50 155.24 4 8.79 7.31 12.11 6.87 11.27 2.04 1.47 11.44 2.92 19.17 3.00 374.30 11.33 2.41 7.56 2.50 175.80 5 8.74 8.18 10.37 6.58 9.98 2.00 1.63 10.14 2.63 14.42 2.50 356.62 9.78 2.49 5.86 2.60 167.58 6 8.57 8.83 10.38 6.12 8.95 1.84 1.26 10.77 2.72 11.49 2.35 311.38 11.68 2.37 5.62 2.90 150.83 7 8.78 9.19 10.02 5.67 8.92 1.83 1.33 10.44 2.69 10.69 2.45 330.77 11.61 2.51 5.62 3.00 136.77 8 7.21 8.07 12.27 6.92 11.21 1.97 1.51 11.88 2.66 15.06 2.88 373.22 11.63 2.38 6.80 3.00 179.93 9 10.48 9.54 10.44 6.32 9.59 2.51 1.34 11.50 2.55 12.50 2.80 320.50 10.29 2.07 4.43 2.50 136.68 10 10.17 9.20 11.61 7.28 9.93 1.99 1.35 10.42 2.94 11.19 2.40 333.05 10.10 2.38 4.05 2.40 129.67 11 9.41 8.53 12.15 6.67 10.11 1.99 1.69 10.57 2.70 11.38 2.55 333.33 11.19 2.39 5.56 2.80 160.96 12 8.77 9.03 11.62 6.47 11.36 1.97 1.89 11.18 2.76 12.24 2.63 364.39 11.33 2.60 6.36 3.00 170.63 13 8.01 7.30 10.68 6.36 10.20 1.94 1.31 11.06 2.58 13.11 2.80 307.26 10.50 2.26 5.24 2.50 165.52 14 8.40 7.77 11.75 6.78 10.32 1.88 1.66 11.34 3.00 14.17 2.42 363.45 11.12 2.42 5.19 2.50 157.92 15 9.43 8.01 12.45 7.09 11.12 1.93 1.37 12.56 2.82 17.17 2.90 335.03 11.63 2.28 5.37 2.45 161.52 16 5.28 8.26 11.31 6.25 9.23 1.90 1.63 11.20 2.66 14.09 2.60 351.20 10.07 2.24 7.29 2.40 136.75 17 10.23 7.04 6.50 5.67 6.25 1.48 0.92 7.25 1.47 4.71 2.85 104.61 7.53 1.47 2.61 2.85 55.19 18 9.79 7.58 6.94 6.08 9.37 1.69 1.03 7.23 1.44 4.67 3.05 99.61 7.39 1.45 2.66 2.80 57.20 19 9.04 7.16 6.78 5.54 6.33 1.40 1.01 7.09 1.66 4.32 2.70 93.97 7.30 1.65 2.29 2.75 54.67 20 9.47 7.99 9.24 6.79 8.89 1.71 1.02 7.56 1.93 6.47 3.30 128.35 6.81 1.55 2.26 2.70 57.59 21 8.93 8.62 10.88 6.35 12.61 2.28 1.77 12.06 2.74 17.62 2.80 417.11 11.73 2.49 5.93 2.60 167.46 22 8.98 8.38 11.19 7.10 12.54 2.15 1.85 13.10 2.77 19.62 3.09 411.34 12.02 2.33 6.72 3.00 169.70
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表 4 28对引物的扩增结果
Table 4 Amplicon of 28 primer pairs
引物组合Primer combination 总带数Total bands 差异带Difference band 基本带Basic bands 多态性Polymorphism/ % ME2EM13 9 9 0 100.0 ME4EM4 4 2 2 50.0 ME5EM8 8 8 0 100.0 ME5EM13 9 8 1 88.89 ME6EM2 7 5 2 71.43 ME6EM3 10 10 0 100.0 ME7EM12 5 4 1 80.0 ME8EM2 6 3 3 50.0 ME10EM2 5 5 0 100.0 ME10EM3 3 2 1 66.67 ME10EM4 3 3 0 100.0 ME11EM4 6 5 1 83.33 ME11EM7 6 6 0 100.0 ME8EM11 5 4 1 80.0 ME12EM4 6 4 2 66.67 ME13EM1 8 5 3 62.5 ME13EM3 5 4 1 80.0 ME13EM9 4 4 0 100.0 ME13EM14 4 4 0 100.0 ME13EM15 4 1 3 25.0 ME14EM1 4 2 2 50.0 ME14EM3 6 4 2 66.67 ME4EM2 5 4 1 80.0 ME4EM11 5 3 2 60.0 ME5EM2 5 4 1 80.0 ME8EM4 7 6 1 85.71 ME2EM20 5 5 0 100.0 ME13EM5 4 2 2 50.0 合计Total 158 126 32 平均 Mean 5.64 4.5 1.14 77.75
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