Active Ingredients and Volatiles in Anoectochilus roxburghii Strains at Various Growth Stages
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摘要:目的 比较2个不同品系及不同生长时间金线莲主要活性成分和挥发性物质含量变化，为金线莲鉴别、筛选及评价提供理论依据。方法 以福建小叶栽培品系土豪金以及大叶栽培品系大元宝为材料，分析评价不同生长时间金线莲中的挥发性物质并测定主要活性成分。结果 总酚含量以种植18个月大元宝最高（265.07 mg·kg−1），总黄酮和可溶性糖均以种植12个月土豪金最高（32.68 mg·g−1、27.71 mg·kg−1），可溶性蛋白则以种植18个月的土豪金最高（600.62 mg·g−1）。通过SPME-GC-MS共检测到6种醇、8种醛、4种酮及2-戊基呋喃，其总量以种植24个月的大元宝最高，而组织培养6个月的土豪金和大元宝挥发性物质含量为栽培苗峰值的22.9%与16.7%。此外，通过气味活性值（Odor activity value，OAV）和主成分分析（Principal component analysis，PCA）发现，（反）-2-己烯醛、辛醛、壬醛是土豪金关键挥发性物质，1-辛烯-3-醇、芳樟醇和β-紫罗兰酮是大元宝关键挥发性物质。 PCA和偏最小二乘法判别分析（Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）表明，通过挥发性物质可以较好地区分不同品系及生长时间金线莲。结论 不同品系及不同生长时间金线莲活性成分和挥发性物质差异显著，利用其活性成分和挥发性物质可区分不同品系及不同生长时间金线莲，这为建立适宜的质量控制体系鉴别金线莲以及筛选优质加工品种提供了依据。Abstract:Objective Contents of active ingredients and volatiles in Anoectochilus roxburghii of different strains at different growth stages were determined.Method SPME-GC-MS analysis was conducted to determine the chemical compositions in Fujian small-leaf Tuhaojin and large-leaf Dayuanbao A. roxburghii.Result The highest total polyphenols of 265.07 mg·kg−1 was found in Dayuanbao 18 months after planting, so were the total flavonoids of 32.68 mg·g−1 and soluble sugars of 27.71 mg·kg−1 in 12-month-old and soluble protein of 600.62 mg·g−1 in 18-month-old Dayunbao plants. There were 6 alcohols, 8 aldehydes, and 4 ketones and 2-pentyl-furan identified with the greatest total amount in Dayunabao grown for 24 months. The volatile content of the 6-month-old tissue culture in Tuhaojin was merely 22.9% of the peak value in the respective cultivated seedlings, and in Dayuanbao, 16.7%. The odor activity value (OAV) and principal component analysis (PCA) concluded that (E)-2-hexenal, octanal, and nonanal were the major aromatic compounds in Tuhaojin, while 1-octen-3-ol, 3,7-dimethyl-1,6-octadien-3-ol, and β-ionone in Dayuanbao. The PCA and PLS-DA indicated that these volatiles could adequately distinguish A. roxburghii of different strains harvested at different times.Conclusion Active ingredients and volatiles in A. roxburghii significantly varied by the strains and growth stages. It was plausible that a chemical analysis could suffice for quality control and authentication purpose on the products in commerce.
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Keywords:
- Anoectochilus roxburghi /
- growth stages /
- active ingredients /
- volatile compounds
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0. 引言
【研究意义】金线莲[Anoectochilus roxburghii （Wall.） Lindl.]，为兰科（Orchidaceae）开唇兰属（Anoectochilus）多年生草本植物[1]，在我国福建、台湾、江西、广西、云南、四川和海南等地均有种植。金线莲作为药食两用的草本植物，民间素有“药王” “金草”之美誉，其味甘微苦，性平微寒，具有清热凉血、祛风利湿、 强心、固肾、利尿、平肝、降血压等功效[2, 3]，含有丰富的多糖、氨基酸、生物碱、类黄酮和有机酸，被用于预防和治疗糖尿病、高脂血症、肝炎[4]和肿瘤[5]。近年来，由于金线莲广泛应用于医药、保健、美容和饮料等诸多领域，其市场需求量不断增加[6]。然而，金线莲种子的萌发需要相关真菌伴生，自然萌发率较低，对生态环境要求十分苛刻，加之人为过量采挖，造成金线莲赖以生存的环境条件被破坏，野生金线莲资源锐减[7]。目前生产上以金线莲种子、茎、叶作为外植体，经愈伤组织的诱导及分化，生根壮苗的组培技术已快速发展，一定程度上解决了金线莲在自然环境中繁殖率低的问题[8]，但目前市场上金线莲主要以干、湿等初级产品流通，难以区别组培苗和不同种植时间的栽培苗，加之我国各省尚未建立统一规范的金线莲质量评价标准，导致市场上金线莲良莠不齐，制约了产业发展[9]。活性成分与挥发性物质是评价金线莲品质和经济效益的重要指标。因此金线莲不同品种、不同生产时间的比较研究对金线莲鉴定与评价提供指导。【前人研究进展】林蔚等[10]研究发现，林下栽培，繁殖瓶苗和大棚栽培等栽培方式，以林下栽培多糖含量最高。林晨等[11]采用GC-MS分析发现组培和人工栽培金线莲的甾醇含量略高于野生金线莲。前人对金线莲品种区分和鉴伪也做了大量研究，如黄哲等[12]利用显微鉴别方法区分黔产金线莲与易混品斑叶兰，张超等[13]研究发现，金线莲和混伪品间黄酮含量差异显著，黄哲等[14]建立的UPLC指纹图谱能快速鉴别金线莲药材与混淆品，并能同时测定4种黄酮含量，李轶奕等[9]建立了野生样品和常见栽培品种HPLC指纹图谱，能将其与易混品种银线莲区分开。【本研究切入点】而有关不同品系和不同生长时期金线莲主要活性成分和挥发性物质差异以及能否利用其差异进行金线莲品质鉴定依据尚待明确。【拟解决的关键问题】本研究对不同品系及不同采集时间金线莲主要活性物质进行测定，并采用SPME-GC-MS测定并筛选主要挥发性物质，以期从挥发性物质的角度，建立适宜的金线莲评价体系，评价不同品系及不同生长时间金线莲，为金线莲药材鉴别及筛选优质加工品种提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
选择小叶栽培品系土豪金、大叶栽培品系大元宝作为试验材料。不同生长时间金线莲样品：组培生根阶段6个月的试管苗，试管苗练苗7～12 d后移栽至大棚种植12个月、18个月及24个月。分别取样后液氮冻存，于-80 ℃冰箱保存，分别进行各指标的测定。以上所有样品均来自于漳州市南靖县忆闽南金线莲合作社，其中大棚种植基地位于南靖县水尖山，样品在产地随机取样，每个样品取3个重复，每个重复取15株。
1.2 试验方法
1.2.1 总酚含量的测定
总酚含量采用福林酚法测定[15]。称取1 g新鲜冷冻组织样品，用5 mL 80%的甲醇均质，12000 r·min−1、4 ℃离心20 min，上清液即为总酚粗提液。总酚反应体系包含0.5 mL上清液，1 mL福林酚试剂和3.5 mL 1 mol·L−1的碳酸钠溶液，混合液在30 ℃水浴中保温1 h，在760 nm处测定吸光值，以没食子酸为标准物质建立标准曲线计算含量，结果以鲜质量计，单位为mg·kg−1。
1.2.2 总黄酮含量的测定
称取1 g新鲜冷冻组织样品，加入4 mL 60%的乙醇，4 ℃、12000 r·min−1离心20 min，收集上清液分析总黄酮含量。总黄酮含量的测定参照陈莹等[16]的方法略作修改。总黄酮反应体系包括2 mL上清液、1 mL乙醇、1 mL 3% AlCl3和2 mL乙酸钠缓冲液（pH 5.5），在510 nm处测定吸光值，以芦丁为标准物质建立标准曲线计算含量，结果以鲜质量计，单位为mg·g−1。
1.2.3 可溶性糖含量的测定
可溶性糖含量采用苯酚硫酸法测定[17]。于试管中称取1 g组织粉末，加入5 mL蒸馏水，用封口膜封口，于沸水中煮沸提取30 min，冷却后过滤，将滤液直接滤入100 mL容量瓶中，再将残渣回收至试管，再次煮沸提取，并过滤至容量瓶中，用水反复漂洗试管残渣，过滤后一并转入容量瓶并定容至刻度。反应体系包含2 mL上清液，1 mL 6%苯酚，5 mL硫酸，煮沸30 min后，在490 nm处测定吸光值，以葡萄糖为标准物质建立标准曲线计算含量，结果以鲜质量计，单位为mg·kg−1。
1.2.4 可溶性蛋白含量的测定
可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定[15]，称取1 g新鲜冷冻组织样品，加入5 mL蒸馏水，于4 ℃、12000 r·min−1离心20 min，收集上清液备用。取1 mL上清液，加入5 mL考马斯亮蓝溶液，充分混匀，放置2 min后在波长525 nm处测定吸光值，以标准蛋白建立标准曲线计算含量，结果以鲜质量计，表示为mg·g−1。
1.2.5 挥发性物质含量的测定
金线莲挥发性物质含量参照Liu等[18]的方法，采用SPME-GC-MS测定。称取金线莲鲜样组织2 g，加入3 mL 200 mmol·L−1乙二胺四乙酸-二钠（EDTA-Na2）和3 mL 20% CaCl2溶液，以2-辛醇（0.004 mg·mL−1）作为内标，采用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS 美国 Agilent 公司，7890A-5975C）进行挥发性物质的测定，色谱条件：载气He，流量为l mL·min−1。柱箱升温程序为：40 ℃保持2 min，3 ℃·min−1升至100 ℃后，5 ℃·min−1升至245 ℃，采取不分流进样。分离柱为DB-WAX 毛细管柱（30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm），离子化方式为电子轰击电离，电子能量70 eV，四级杆温度为150 ℃，传输线温度为250 ℃。挥发性化合物的定性通过与NIST质谱库（NIST-08）对比确定，根据内标物的峰面积计算挥发性化合物的相对含量，单位为μg·kg−1。
1.2.6 主体风味物质评价
采用气味活性值（OAV）评价样品的总体风味，OAV按照以下公式计算：
OAVi=CiOTi 式中，OAVi为风味物质i的气味活性值；
Ci 为挥发性物质含量（μg·kg−1）；OTi 为该化合物在水中的风味阈值（μg·kg−1）。1.2.7 数据统计
数据采用Excel整理绘表并采用Origin 2018软件作图，PCA和PLS-DA分析通过MetaboAnalyst5.0网站进行（https://www.metaboanalyst.ca），采用SPSS 20.0对数据进行统计分析，采用单因素方差分析和Duncan法进行多重比较（α=0.05）。试验结果均表示为平均值±标准偏差。
2. 结果与分析
2.1 总酚和总黄酮含量变化分析
总酚和总黄酮是金线莲中重要的活性成分，也是评价金线莲品质的重要指标。如图1-A所示，2个品系金线莲总酚含量在不同生长时间表现为先上升后降低，二者均在生长的18个月达到峰值，此时大元宝总酚含量为265.07 mg·kg−1，显著高于土豪金（238.92 mg·kg−1，P＜0.05）。与总酚积累模式不同，土豪金黄酮含量在不同生长时间并无明显变化趋势，大元宝则略微下降（图1-B）。此外，18个月时土豪金和大元宝总酚含量分别为组培苗的1.3倍和2倍，黄酮含量分别为组培苗1.3倍和1.6倍。
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图 1 不同生长时间不同品系金线莲总酚（A）和总黄酮（B）含量变化不同大写字母表示同一品系不同生长时间之间差异显著（P＜0.05），不同小写字母表示同一生长时间不同品系之间差异显著（P＜0.05），下图同。Figure 1. Total phenols (A) and flavonoids (B) in different strains and harvest timesData with different uppercase letters indicate significant differences of the same strain at different harvest times (P＜0.05); those with different lowercase letters indicate significant differences between different strains at the same growth stage (P＜0.05). Same for following Figs.2.2 可溶性糖和可溶性蛋白含量变化分析
可溶性糖含量变化如图2-A所示，随着生长时间的延长，可溶性糖含量呈下降趋势，2个品系可溶性糖含量均在生长12个月最高（土豪金为27.71 mg·kg−1，大元宝为24.22 mg·kg−1）。此外，2个品系组织培养的金线莲可溶性糖含量显著低于栽培12个月的金线莲，二者的组培苗之间可溶性糖含量并无明显差异。土豪金可溶性蛋白含量在不同生长时间表现为先上升后下降，在18个月时达到峰值（600.62 mg·g−1），显著高于大元宝（425.90 mg·g−1，P＜0.05），而大元宝可溶性蛋白含量并无明显变化，且组织培养的金线莲可溶性蛋白含量与栽培品系峰值间并无显著性差异（图2-B)。
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图 2 不同生长时间不同品系金线莲可溶性糖（A）和可溶性蛋白（B）含量变化Figure 2. Soluble sugars (A) and soluble protein (B) in different strains and harvest times2.3 挥发性物质GC-MS分析
挥发性芳香物质可作为金线莲生产加工的重要参考标准之一，通过SPME-GC-MS共定性并量化出19种挥发性物质，包括6种醇类（正己醇、1-辛烯-3醇、2-乙基己醇、芳樟醇、1-辛醇、苯甲醇），8种醛类[正己醛、庚醛、（反）-2-己烯醛、（反）-2-庚烯醛、辛醛、壬醛、苯甲醛、（反）-2-壬烯醛]，4种酮类（2-辛酮、香叶基丙酮、甲基庚烯酮、β-紫罗兰酮）及1种其他类物质（2-戊基呋喃）。
随着生长年限的延长，2个品系金线莲挥发性物质含量不断积累，生长时间越长，总挥发性物质含量越高，相比于12个月，24个月的土豪金总挥发性物质含量增长了3.9倍，大元宝增长了4.9倍，而组织培养的土豪金和大元宝中挥发性物质含量仅为24个月生的22.9%与16.7%（图3-A）。类似的，醇类、醛类和酮类在生长过程中不断积累，但不同品系醇类和醛类物质积累模式不同，在生长的24个月时，大元宝醇类物质积累量是土豪金的5倍（图3-B），醛类物质积累量为土豪金的55.4%（P＜0.05，图3-C），而酮类物质则没有明显差异（图3-D）。此外，2个品系组培金线莲醇类、醛类和酮类物质含量均低于任意种植时期的金线莲，这些结果表明， 大元宝的挥发性物质总量显著高于土豪金，大元宝中以醇类物质含量最高，土豪金中以醛类物质含量最高，而组培金线莲挥发性物质的积累量显著低于栽培苗。
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图 3 不同品系及生长时间金线莲总挥发性物质（A）、醇类（B）、醛类（C）和酮类（D）含量变化Figure 3. Total volatiles (A), alcohols (B), aldehydes (C), and ketones (D) in different strains and harvest times2.4 金线莲主要活性成分及挥发性物质PCA和PLS-DA分析
为进一步区分不同品系及生长时间金线莲，对金线莲品质作出全面评价，利用其主要活性成分及挥发性物质做无监督PCA分析和有监督PLS-DA分析，结果如图4所示。通过PCA分析，观察到位于PC1右侧的组织培养的土豪金（B4-1、B4-2、B4-3）与18个月（B2-1、B2-2、B2-3）及24个月生的金线莲（B3-1、B3-2、B3-3）距离较远，类似的，位于PC1左侧组织培养的大元宝（A4-1、A4-2、A4-3）与12个月（A1-1、A1-2、A1-3）及24个月生的金线莲（A3-1、A3-2、A3-3）距离较远，这说明同一品系不同生长时间的主要活性物质与挥发性物质含量差异较大，同时，总酚，总黄酮、可溶性糖和可溶性蛋白均位于PC1的正轴，因此金线莲中主要活性成分对第一主成分贡献大。此外，2个品系组培金线莲的挥发性物质特征较少，而生长时间12个月和24个月的金线莲则聚集了更多的特征性挥发物质，包括正己醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、辛醛，壬醛，（反）-2-己烯醛和β-紫罗兰酮等。通过PLS-DA分析模型可以看出，利用挥发性物质可以将2个品系组织培养的金线莲与长期种植金线莲很好地区分开来，不同品系和生长时间的金线莲被分为了不同的集群，特别是与24个月的金线莲间差异显著。以上结果说明，利用挥发性物质可以较好区分不同品系金线莲以及同一品系组培和种植金线莲，可为金线莲鉴别、筛选及加工提供理论依据。
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图 4 不同生长时间不同品系主要活性成分和挥发性物质PCA（左）和PLS-DA（右）分析A1~A3：大元宝12~24个月样品，A4：大元宝组培苗，B1~B3：土豪金12~24个月，B4：土豪金组培苗。Figure 4. PCA and PLS-DA on main active ingredients and volatiles in different strains and harvest timesA1–A3: 12–24-month-old Dayuanbao; A4: Dayuanbao tissue culture; B1–B3: 12–24-month-old Tuhaojin; B4: Tuhaojin tissue culture.![]()
图 5 不同生长时间不同品系挥发性物质含量Figure 5. Content of volatiles in different strains and harvest times2.5 挥发性物质OAV分析
OAV可用于评价单一组分对整体香气的贡献，一般OAV越大，其对整体香气的贡献度越高。本研究利用OAV＞1筛选关键风味物质，具体结果可见表1。结果表明，3种醇类（正己醇、1-辛烯-3-醇、芳樟醇），8种醛类[正己醛、庚醛、（反）-2-己烯醛、辛醛、（反）-2-庚烯醛、壬醛、苯甲醛]以及β-紫罗兰酮、2-戊基呋喃的OAV值大于1，可认为是金线莲中的关键风味物质。为进一步分析不同品系及不同生长时间金线莲挥发性物质差异，基于OAV值，选取8种差异性物质作进一步分析（图5）。
表 1 不同品系及采集时间挥发性物质OAV值Table 1. OAV of volatiles in different strains and harvest times挥发性物质
Volatile substances水中的阈值
The threshold in
water/（μg·kg−1）品系
Strain不同生长采集时间OAV值
OAV values at different growth times12个月
12 months18个月
18 months24个月
24 months组培苗
Tissue culture醇类 Alcohols 正己醇 1-Hexanol 5.6 土豪金 Tu Hao Jin 0.95 2.20 0.52 2.11 大元宝 Da Yuan Bao 0.94 0.97 1.68 2.31 1-辛烯-3-醇 1-Octen-3-ol 7 土豪金 Tu Hao Jin 9.16 47.33 31.03 1.92 大元宝 Da Yuan Bao 18.18 65.48 541.24 2.49 芳樟醇 Linalool 0.22 土豪金 Tu Hao Jin — 8.50 — — 大元宝 Da Yuan Bao 14.13 17.81 23.86 — 醛类 Aldehydes 正己醛 Hexanal 200 土豪金 Tu Hao Jin 0.58 4.17 3.53 1.48 大元宝 Da Yuan Bao 1.14 1.12 2.30 1.30 庚醛 Heptanal 10 土豪金 Tu Hao Jin 1.57 1.28 2.23 2.00 大元宝 Da Yuan Bao 1.54 1.63 2.11 1.60 （反）-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal 82 土豪金 Tu Hao Jin 0.29 2.11 8.95 0.77 大元宝 Da Yuan Bao 0.68 0.56 2.00 0.95 辛醛 Octanal 0.1 土豪金 Tu Hao Jin 380.10 278.00 980.40 193.70 大元宝 Da Yuan Bao 295.00 278.40 599.80 295.30 （反）-2-庚烯醛 (E)-2-Heptenal, 10 土豪金 Tu Hao Jin 0.95 1.34 1.53 1.43 大元宝 Da Yuan Bao 1.20 1.52 2.15 2.08 壬醛 Nonanal 3.5 土豪金 Tu Hao Jin 33.37 31.47 67.67 15.26 大元宝 Da Yuan Bao 39.47 37.52 74.18 41.06 苯甲醛 Benzaldehyde 3 土豪金 Tu Hao Jin 0.87 1.44 7.60 — 大元宝 Da Yuan Bao — 1.32 3.47 19.33 （反）2-壬烯醛 (E)-2-Nonenal 0.07 土豪金 Tu Hao Jin 175.57 128.28 179.14 103.57 大元宝 Da Yuan Bao 179.00 280.71 501.28 260.71 酮类 Ketones β-紫罗兰酮 β-Ionone 0.007 土豪金 Tu Hao Jin — 485.71 454.28 460.00 大元宝 Da Yuan Bao 1581.42 1927.14 1221.42 1074.28 其他 Others 2-戊基呋喃 2-pentyl-Furan 4.8 土豪金 Tu Hao Jin 1.00 3.36 4.30 1.29 大元宝 Da Yuan Bao 3.38 3.91 5.79 4.44 —：代表未检测到。
—：indicates no detection.1-辛烯-3-醇是蘑菇风味的重要来源，是2个品系的金线莲中OAV值最高的醇类物质，大元宝在生长的24个月时含量达到最高，此时，大元宝1-辛烯-3-醇含量高达2575.52 μg·kg−1，是土豪金的11.8倍。此外，24个月时， 大元宝1-辛烯-3-醇含量较12个月时提高了20倍，而组织培养的含量显著低于生长24个月的金线莲（P＜0.05）。芳樟醇是清香型化合物，也略带果香，在土豪金中，芳樟醇仅在18个月时检测到，在大元宝中，除组织培养外，其余时间段均检测到芳樟醇。
醛类物质是金线莲中重要挥发性物质，种类多，含量高。正己醛香气描述为草或油脂味，是金线莲中含量最高的醛类物质，土豪金中正己醛含量18个月达峰值（834.39 μg·kg−1），大元宝在24个月达峰值（460.37 μg·kg−1），而组织培养的土豪金和大元宝正己醛含量仅为栽培苗峰值的35%和56%。（反）-2-己烯醛呈青草味，其含量随着生长时间的延长不断增加，至生长24个月，土豪金（反）-2-己烯醛含量是大元宝的4.47倍。另外，相比于12个月，24个月时土豪金（反）-2-己烯醛含量增长了30倍，大元宝仅增长了1.93倍，其含量分别为组织培养的11倍和3.4倍。类似的，2个品系辛醛和壬醛含量均在生长的24个月时达到峰值，至24个月，土豪金中辛醛和壬醛含量分别为组织培养的2.5倍和2倍，大元宝中含量为组织培养的1.7倍和4.3倍。β-紫罗兰酮是花香型呈味物质，其在水中的阈值仅为0.007 μg·kg−1，故而对整体风味的贡献度较大。大元宝β-紫罗兰酮显著高于土豪金，且组织培养含量显著低于栽培品种。以上结果说明土豪金醛类物质的积累量显著高于大元宝，且组织培养的金线莲单一挥发性物质含量显著低于栽培品种。
3. 讨论与结论
在金线莲中，活性成分是评价其品质和经济效益的重要指标，因此，许多研究往往基于活性物质筛选优质资源。如施满容等[19]比较不同地区野生金线莲总酚、黄酮、总氨基酸和生物碱含量，结果发现闽东野生金线莲有效成分含量较高，具有一定开发和利用优势；唐楠楠等[20]研究发现浙江金线莲的多糖含量及清除羟自由基能力均优于台湾金线莲；曾碧玉等[21]认为，相比于漳州 尖叶、 三明圆叶、三明尖叶，台湾 AF在多酚及黄酮资源开发利用上具有一定优势。在本研究中，2个品系金线莲总酚含量均在18个月时达到峰值，且大元宝含量高于土豪金，而总黄酮含量无明显差异，因此，若以总酚和总黄酮为开发目的，可选择18个月的大元宝作为材料。此外，本研究中总酚和多糖的变化规律不同，多糖含量在12个月时最高，随着生长时间的延长总体呈下降趋势， 这可能是由于金线莲长期生长后多糖成分逐渐转化为纤维素等非可溶性多糖[22]，研究结果与黄瑞平等[23]研究发现移栽0 d的金线莲多糖含量最高类似。不同的是，金线莲中可溶性蛋白含量组培苗较高，若以蛋白含量为研究目的，可直接选用组培苗，但组培苗中，总酚、总黄酮和可溶性糖含量显著低于移栽苗，这与文献[24]研究结果基本一致。因此，组培苗虽可弥补野生金线莲资源稀缺的现状，但二者间差异较大，组培金线莲不可替代野生金线莲。
挥发性物质可作为质量评价的重要指标，多种动植物的挥发性物质已经通过SPME-GC-MS鉴别[25, 26]，然而有关金线莲挥发性物质研究较少。本研究通过GC-MS共从金线莲中鉴定出19种挥发性物质，大元宝的总挥发性物质含量在24个月时显著高于土豪金。通过OAV及PCA分析发现，13种物质OAV＞1，其中8种是醛类，这可能是由于醛类物质具有较高的含量和较低的阈值。此外土豪金关键挥发性物质为醛类，主要是（反）-2-己烯醛、辛醛、壬醛，大元宝关键挥发性物质为醇类、酮类，包括1-辛烯-3-醇、芳樟醇和β-紫罗兰酮。醛类拥有比较特殊的芳香气味，大多源于脂质的氧化降解作用，被认为是枇杷花[27]、藜麦[28]、沙枣花[29]、驴肉[30]等动植物中的关键挥发性物质。1-辛烯-3醇又称蘑菇醇，是蘑菇中的关键风味物质，β-紫罗兰酮作为花香型物质，其在水中的阈值仅为0.007 μg·kg−1[31]，故而对整体的风味贡献较大。此外，本研究中2个品种组织培养的金线莲挥发性物质含量显著低于栽培金线莲，采用挥发性物质进行PCA和PLS-DA分析发现，组培金线莲中挥发性物质特征较少，而栽培品种则聚集了壬醛、辛醛、（反）-2-己烯醛、1-辛烯-3醇等关键挥发性物质；PLS-DA显示，根据挥发性物质可以将组织培养与栽培金线莲区分开来，因此，根据挥发性物质可以对不同品系金线莲进行品质评价和质量控制。
综上所述，不同生长时间不同品系金线莲主要活性物质和挥发性物质差异显著，大元宝中积累了更多的总酚和可溶性糖，而土豪金则积累了更多的可溶性蛋白，2个品系组织培养的金线莲总酚、总黄酮和可溶性糖含量均显著低于移栽金线莲。此外，通过OAV和PCA分析发现，（反）-2-己烯醛、辛醛、壬醛是土豪金关键挥发性物质，1-辛烯-3-醇、芳樟醇和β-紫罗兰酮是大元宝关键挥发性物质，2个品系组织培养的金线莲挥发性物质含量显著低于栽培金线莲，组培金线莲中挥发性物质特征较少，而栽培金线莲则聚集了壬醛、辛醛、（反）-2-己烯醛、1-辛烯-3醇等关键挥发性物质。因此，根据挥发性物质可以对不同生长时间不同品系金线莲进行品质评价和质量控制，可为金线莲药材鉴别及筛选优质加工材料提供一定的参考。
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图 1 不同生长时间不同品系金线莲总酚（A）和总黄酮（B）含量变化
不同大写字母表示同一品系不同生长时间之间差异显著（P＜0.05），不同小写字母表示同一生长时间不同品系之间差异显著（P＜0.05），下图同。
Figure 1. Total phenols (A) and flavonoids (B) in different strains and harvest times
Data with different uppercase letters indicate significant differences of the same strain at different harvest times (P＜0.05); those with different lowercase letters indicate significant differences between different strains at the same growth stage (P＜0.05). Same for following Figs.
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图 2 不同生长时间不同品系金线莲可溶性糖（A）和可溶性蛋白（B）含量变化
Figure 2. Soluble sugars (A) and soluble protein (B) in different strains and harvest times
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图 3 不同品系及生长时间金线莲总挥发性物质（A）、醇类（B）、醛类（C）和酮类（D）含量变化
Figure 3. Total volatiles (A), alcohols (B), aldehydes (C), and ketones (D) in different strains and harvest times
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图 4 不同生长时间不同品系主要活性成分和挥发性物质PCA（左）和PLS-DA（右）分析
A1~A3：大元宝12~24个月样品，A4：大元宝组培苗，B1~B3：土豪金12~24个月，B4：土豪金组培苗。
Figure 4. PCA and PLS-DA on main active ingredients and volatiles in different strains and harvest times
A1–A3: 12–24-month-old Dayuanbao; A4: Dayuanbao tissue culture; B1–B3: 12–24-month-old Tuhaojin; B4: Tuhaojin tissue culture.
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图 5 不同生长时间不同品系挥发性物质含量
Figure 5. Content of volatiles in different strains and harvest times
表 1 不同品系及采集时间挥发性物质OAV值
Table 1 OAV of volatiles in different strains and harvest times
挥发性物质
Volatile substances水中的阈值
The threshold in
water/（μg·kg−1）品系
Strain不同生长采集时间OAV值
OAV values at different growth times12个月
12 months18个月
18 months24个月
24 months组培苗
Tissue culture醇类 Alcohols 正己醇 1-Hexanol 5.6 土豪金 Tu Hao Jin 0.95 2.20 0.52 2.11 大元宝 Da Yuan Bao 0.94 0.97 1.68 2.31 1-辛烯-3-醇 1-Octen-3-ol 7 土豪金 Tu Hao Jin 9.16 47.33 31.03 1.92 大元宝 Da Yuan Bao 18.18 65.48 541.24 2.49 芳樟醇 Linalool 0.22 土豪金 Tu Hao Jin — 8.50 — — 大元宝 Da Yuan Bao 14.13 17.81 23.86 — 醛类 Aldehydes 正己醛 Hexanal 200 土豪金 Tu Hao Jin 0.58 4.17 3.53 1.48 大元宝 Da Yuan Bao 1.14 1.12 2.30 1.30 庚醛 Heptanal 10 土豪金 Tu Hao Jin 1.57 1.28 2.23 2.00 大元宝 Da Yuan Bao 1.54 1.63 2.11 1.60 （反）-2-己烯醛 (E)-2-Hexenal 82 土豪金 Tu Hao Jin 0.29 2.11 8.95 0.77 大元宝 Da Yuan Bao 0.68 0.56 2.00 0.95 辛醛 Octanal 0.1 土豪金 Tu Hao Jin 380.10 278.00 980.40 193.70 大元宝 Da Yuan Bao 295.00 278.40 599.80 295.30 （反）-2-庚烯醛 (E)-2-Heptenal, 10 土豪金 Tu Hao Jin 0.95 1.34 1.53 1.43 大元宝 Da Yuan Bao 1.20 1.52 2.15 2.08 壬醛 Nonanal 3.5 土豪金 Tu Hao Jin 33.37 31.47 67.67 15.26 大元宝 Da Yuan Bao 39.47 37.52 74.18 41.06 苯甲醛 Benzaldehyde 3 土豪金 Tu Hao Jin 0.87 1.44 7.60 — 大元宝 Da Yuan Bao — 1.32 3.47 19.33 （反）2-壬烯醛 (E)-2-Nonenal 0.07 土豪金 Tu Hao Jin 175.57 128.28 179.14 103.57 大元宝 Da Yuan Bao 179.00 280.71 501.28 260.71 酮类 Ketones β-紫罗兰酮 β-Ionone 0.007 土豪金 Tu Hao Jin — 485.71 454.28 460.00 大元宝 Da Yuan Bao 1581.42 1927.14 1221.42 1074.28 其他 Others 2-戊基呋喃 2-pentyl-Furan 4.8 土豪金 Tu Hao Jin 1.00 3.36 4.30 1.29 大元宝 Da Yuan Bao 3.38 3.91 5.79 4.44 —：代表未检测到。
—：indicates no detection.
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