Genetic Differences and Mycelial Morphology of Lyophyllum decastes Strains
-
摘要:目的 比较荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes，Lyd）外地引进菌株与本地栽培菌株的遗传差异性和菌丝形态特征，为荷叶离褶伞选育提供参考。方法 以真菌18S rRNA（V4）和ITS（ITS1–ITS4）（18S rRNA-ITS）序列对外地引进和本地栽培的荷叶离褶伞进行序列同源性分析、多重序列比对和构建系统发育进化树，通过分析碱基序列突变和遗传距离远近明确荷叶离褶伞菌株间的亲缘关系，并通过菌丝体生长及形态变化确定荷叶离褶伞的遗传学差异。结果 18S rRNA-ITS序列比对结果显示，外地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）发生较高比例的碱基缺失和碱基替换突变，且ITS序列同源性下降至80.09%～89.72%； Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株的碱基突变比例高于Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17以及福建本地栽培菌株（Lyd-LRX和Lyd-LRY）。进化树分析结果进一步显示，Lyd-LR1和Lyd-LR6与Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX、Lyd-LRY以及NCBI已经登录的部分荷叶离褶伞或离褶伞（Lyophyllum，Ly）菌株有较远的遗传距离和亲缘关系。Lyd-LR1梭子状菌丝生长较慢且不规则生长，菌丝体呈松散放射状；Lyd-LR6凹陷状菌丝生长较快且明显聚合生长，菌丝体呈平铺状且边缘厚度较高。Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株的菌丝体生长速度和菌丝形态均不同于Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX、Lyd-LRY菌株圆柱形饱满的菌丝和厚度高生长快的突起状菌丝体。而与Lyd-LR1菌株相比，Lyd-LR6菌株的碱基序列突变位置、碱基突变比例和菌丝形态发生的变化更明显。结论 外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR6的基因序列碱基突变位置（碱基替换和碱基缺失）、18S rRNA-ITS序列同源性和种属亲缘关系明显区别于其他外地及本地的荷叶离褶伞菌株。高比例的基因序列碱基突变造成Lyd-LR6菌株的菌丝体生长速度和菌丝形态发生明显改变，可作为选育荷叶离褶伞新菌株的材料。
-
关键词:
- 荷叶离褶伞 /
- 18S rRNA-ITS /
- 同源性分析 /
- 发育进化树 /
- 菌丝生长
Abstract:Objective Genetic differences and mycelial morphology of imported and locally cultivated Lyophyllum decastes (Lyd) were compared.Methods Sequence homology, multiple sequence alignment, and phylogenetic tree were examined and constructed based on the sequences of the fungal 18S rRNA (V4) and ITS (ITS1-ITS4) (18S rRNA-ITS) of the imported and locally cultivated Lyd strains. Mutation analysis and genetic distance determination were performed to identify the phylogenetic relationship, while mycelium growth and scanning electron microscopic images observed to differentiate the morphology of the strains.Results The 18S rRNA-ITS sequence alignment between the two strains showed the imported Lyd-LR1, Lyd-LR6, Lyd-LR10, Lyd-LR15, and Lyd-LR17 to be higher on the ratio of base deletion and base substitution mutations. The ITS sequence homology between them decreased to 80.09%–89.72% with Lyd-LR1 and Lyd-LR6 being higher than Lyd-LR10, Lyd-LR15, Lyd-LR17 as well as the local Lyd-LRX and Lyd-LRY on the proportions of base mutation. The phylogenetic tree analysis indicated a distant genetic relationship between Lyd-LR1 and Lyd-LR6 and Lyd-LR10, Lyd-LR15, Lyd-LR17, Lyd-LRX, Lyd-LRY, and some Lyd or Lyophyllum (Ly) registered by NCBI. The loose and radial fusiform mycelia of Lyd-LR1 grew slowly and irregularly, whereas the pitted mycelia of Lyd-LR6 tiled with high margin thickness proliferated rapidly and polymerized considerably. The growth rates and morphology of Lyd-LR1 and Lyd-LR6 mycelia differed from those of Lyd-LR10, Lyd-LR15, Lyd-LR17, Lyd-LRX, and Lyd-LRY, which had full cylindrical mycelia and thick and fast-growing protuberant mycelia. Compared to Lyd-LR1, Lyd-LR6 exhibited more apparent changes in gene sequence base mutation location, base mutation proportion, and mycelial morphology.Conclusion The gene sequence base mutation location (base substitution and base deletion), 18S rRNA-ITS sequence homology, and phylogenetic relationship of Lyd-LR6 significantly differed from those of the other imported and the locally cultivated Lyd strains. A high proportion of gene sequence base mutations induced significant changes in the growth and morphology of Lyd-LR6 mycelia indicating a potential use of it in breeding new varieties of Lyd mushrooms.-
Keywords:
- Lyophyllum decastes /
- 18S rRNA-ITS /
- homology analysis /
- phylogenetic tree /
- mycelial growth
-
0. 引 言
【研究意义】荷叶离褶伞（Lyophyllum decastes，Lyd），又称鹿茸菇，属于离褶伞科（Lyophyllaceae），离褶伞属（Lyophyllum，Ly），是一种木腐型珍贵食药用真菌[1-2]。荷叶离褶伞子实体分叉成丛生的细枝，菌盖外观似鹿茸切片[3]，广泛分布于北半球温带的山区和丛林之中[2, 4]。荷叶离褶伞口感丝滑爽脆，子实体脂肪含量低，粗纤维成分高，富含人体所需的氨基酸和微量元素[2]。荷叶离褶伞子实体含有粗蛋白22.16%，粗脂肪2.69%，多糖44.29%，粗纤维8.66%，属于高蛋白低脂肪的食用菌[5]。荷叶离褶伞富含的致密型膳食纤维可改善人体肠道的消化能力[6-7]，是近年来新兴的工厂化栽培药食兼用菌品种[8-10]，且在我国已实现工厂化栽培[2]。当前荷叶离褶伞工厂化栽培仍存在着发菌较慢、成活较迟、易发生有害菌污染等问题[4]，获得荷叶离褶伞优良品种是栽培成功的关键[11-13]。筛选出菌种纯度高、菌丝遗传性状稳定、生长活力强和普通培养基易于栽培的品种是当下荷叶离褶伞菌株市场化规模化袋式栽培生产的关键。将本地区与其他地区引进的荷叶离褶伞菌株进行基因组序列突变比对和菌丝形态分析研究，对丰富本地区荷叶离褶伞种质资源有重要意义。【前人研究进展】在自然环境下荷叶离褶伞自身能产生基因组序列突变，且在漫长的进化过程中逐渐累积突变，形成子实体和菌丝形态差异明显的菌株[1]。不同地区的地理气候环境差异较大，对自然突变的荷叶离褶伞有着不同的筛选机制，形成地区之间基因组序列差异较大的菌株，突出表现为菌丝生长和形态的多样性和差异性。荷叶离褶伞子实体由组织化的菌丝体构成，菌丝稳定的生长速度决定子实体的大小[2]。菌丝的生长活力和遗传性状以及将优良性状稳定遗传到子代受其基因序列控制，而基因序列的突变是产生菌丝形态差异的根本原因[4,6]。通过基因序列差异性获得菌丝形态遗传稳定的荷叶离褶伞菌株，能克服由外界不利环境胁迫造成菌丝变异生长的假阳性现象，加快获得菌丝形态优良的菌株。【本研究切入点】 传统分类方法通过子实体生长和菌丝形态对不同地区来源的荷叶离褶伞菌株进行筛选和建立菌种资源库，不但进度慢且无法明确菌丝变异的原因。鉴定到基因组序列碱基突变且变异菌丝稳定遗传是有效增加荷叶离褶伞菌株资源库的关键，而采取真菌18S rRNA（V4）和ITS（ITS1～ITS4）序列结合菌丝形态对不同地区的荷叶离褶伞进行鉴定尚无相关报道。【拟解决的关键问题】通过比较从上海、云南和吉林等地引进的荷叶离褶伞与福建本地栽培的荷叶离褶伞之间基因序列和菌丝生长的差异性，获得基因序列变异大且菌丝形态稳定遗传的荷叶离褶伞，为选育菌丝生长较快且适合工厂袋式栽培的荷叶离褶伞菌株提供参考。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
荷叶离褶伞菌株包括从云南、吉林和上海等地引进的Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17，福建省本地工厂化栽培菌株Lyd-LRX和Lyd-LRY。
1.2 试验方法
1.2.1 荷叶离褶伞的纯化培养及电镜观察
荷叶离褶伞菌株均在实验室进行多次菌丝分离和继代培养。挑取荷叶离褶伞菌丝在PDA固体培养基上连续继代培养5次，获得纯化的菌丝体用于后续的菌丝生长试验。将相同量的菌丝块（直径＜5 mm）接种至PDA固体培养基上暗培养10 d 和20 d（温度恒定在30 ℃，每个菌株5次重复），用化学方法制备扫描电镜观察样品，对荷叶离褶伞菌丝的生长情况和形态特征进行观察拍照。
1.2.2 荷叶离褶伞基因组DNA的提取
挑选荷叶离褶伞菌丝体（新鲜菌丝1 g左右）到研钵，加入液氮充分碾磨破碎，选取部分粉末转入2 mL离心管中，按照真菌基因组DNA提取试剂盒步骤提取荷叶离褶伞菌丝体DNA。提取的基因组DNA 经 1.20%琼脂糖凝胶电泳检测，确定荷叶离褶伞菌丝体DNA的完整性。
1.2.3 18S rRNA和ITS区段序列的PCR扩增和测序
配制Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（诺唯赞Vazyme Biotech, Co., Ltd#P505-d1, 中国）PCR反应试剂。PCR 反应体系（50 μL）： 2×Phanta Max Buffer 25 μL， dNTPs 1 μL，引物（10 μmol·L−1）各 2 μL，DNA Polymerase 1 μL， DNA 模板1 μL （＜50 ng）， ddH2O 18 μL。PCR反应条件：95 °C变性 3 min；95 °C 变性15 s，55 °C 退火15 s，72 °C 延伸1 min，35 个循环；72 °C 总延伸5 min。对18S rRNA的V4变量区（623～853）和ITS1～ITS4区段分别进行PCR扩增。18S rRNA的引物序列为18S_3NDF（正向引物序列）：5′ -GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′；18S_V4_euk_R2（反向引物序列）: 5′-ACGGTATCT（AG）ATC（AG）TCTTCG-3′。ITS区段引物序列为ITS1（正向引物序列）: 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4（反向引物序列）: 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。采用PCR仪Eppendorf 5331（德国eppendorf公司）进行PCR扩增，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定PCR产物的大小和特异性。PCR产物使用通用型DNA纯化回收试剂盒进行回收（TIANGEN DP214，天根生化科技有限公司，中国）。纯化的PCR产物送北京擎科生物科技有限公司进行测序分析。
1.2.4 18S rRNA和ITS序列的同源性比对
测序获得荷叶离褶伞18S rRNA的V4区序列和ITS的ITS1～ITS4区序列，去除杂峰序列后，登录NCBI Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）并选用Nucleotide BLAST进行核酸序列同源性比对，同时在NCBI GenBank获得同源性较高（＞90%）的部分荷叶离褶伞菌株序列编号（Accession）及其序列信息，使用生物软件DNAMAN 9进行多重序列比对。
1.2.5 构建系统发育进化树
采用MEGA 7.0.26（MolecularEvolutionary Genetics Analysis，http://www.megasoftware.net/）软件分别对18S rRNA（V4）和ITS（ITS1～ITS4）序列同源性较高的荷叶离褶伞序列构建系统进化树。用 ClustalW 进行多序列匹配比对，重复数（Bootstrap）为1000，以Neighbor-Joining（NJ）法构建系统发育进化树。
2. 结果与分析
2.1 荷叶离褶伞菌株18S rRNA-ITS同源性分析和多重序列比对
18S rRNA（V4）序列的NCBI Blast比对结果显示，外地离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）、福建本地离褶伞菌株（Lyd-LRX和Lyd-LRY）与NCBI登录的荷叶离褶伞菌株（Lyd-PBM3069和Lyd-JM87/16）序列同源性为97.55%～98.88%（表1）；与NCBI登录的离褶伞属菌株Ly-shimeji（D84555.1）、Ly-sp. MSG166、Ly-sp. PBM 2688、Ly-praslinense 10295、Ly-leucophaeatum HAe251和Ly-shimeji（D84553.1）的序列同源性为94.21%～100%。序列同源性均大于94%，确定试验菌株Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17菌株为荷叶离褶伞。
表 1 荷叶离褶伞菌株的18S rRNA（V4）序列同源性分析Table 1. Homology of 18S rRNA (V4) sequences in Lyd strains（单位：%） 菌株 Strain Lyd-LR1 Lyd-LR6 Lyd-LR10 Lyd-LR15 Lyd-LR17 Lyd-LRX Lyd-LRY Lyd-PBM3069 98.45 98.22 98.88 99.11 98.48 98.66 98.21 Lyd-JM87/16 98.23 97.55 98.66 98.44 97.83 97.99 97.54 Ly-shimeji（D84555.1） 97.96 97.90 98.59 98.83 97.95 98.13 97.90 Ly-sp. MSG166 96.69 96.44 97.10 97.32 96.96 96.88 96.64 Ly-sp. PBM 2688 96.47 96.21 96.88 97.10 96.75 96.65 96.42 Ly-praslinense 10295 94.92 94.65 95.31 95.54 95.23 95.09 94.85 Ly-leucophaeatum HAe251 94.48 94.21 94.87 95.09 94.79 94.64 94.41 Ly-shimeji（D84553.1） 100.00 93.44 98.36 98.36 100.00 95.08 93.22 根据18S rRNA多重序列比对结果（图1），与NCBI登录菌株Lyd-PBM3069和Lyd-JM87/16相比较，外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17以及福建本地荷叶离褶伞菌株Lyd-LRX和Lyd-LRY均发生4处碱基替换以及1处碱基缺失。与本地荷叶离褶伞菌株Lyd-LRX和Lyd-LRY相比较，外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17部分发生3处碱基缺失/插入突变。外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17在真菌非常保守的18S rRNA（V4）序列发生碱基替换和碱基缺失的多处突变，需继续以碱基突变概率较高的ITS（ITS1-ITS4）序列进一步分析外地荷叶离褶伞菌株的基因序列差异性。
![]()
图 1 荷叶离褶伞菌株的18S rRNA（V4）区序列多重比对分析A1–A9为序列比对发生碱基突变的位置。Figure 1. Multiple alignment of 18S rRNA(V4) sequences in Lyd strainsA1–A9 are the location where base mutations occur in sequence alignment.ITS（ITS1-ITS4）序列NCBI Blast比对结果显示，与Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌株序列均高度同源（＞80%）的荷叶离褶伞菌株达到45个，但序列同源性下降至80.09%～90.33%（表2），提示菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列已发生较高比例的碱基突变。根据ITS（ITS1–ITS4）多重序列比对结果，与NCBI登录菌株Lyd-Ld418和Lyd-ywy1相比较，Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌株均发生基本相同的7处碱基替换、1处碱基缺失以及1处碱基插入。与本地荷叶离褶伞菌株Lyd-LRX和Lyd-LRY相比较，外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17菌株均发生相同的5处碱基替换以及1处碱基插入。与其他荷叶离褶伞菌株相比较， Lyd-LR1、Lyd-LR6菌株发生更高的碱基突变（图2）。与NCBI登录荷叶离褶伞菌株相比，外地荷叶离褶伞菌株和福建本地荷叶离褶伞菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列均发生较高比例的碱基替换和碱基缺失，且外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1和Lyd-LR6的碱基突变明显高于其他荷叶离褶伞菌株，而Lyd-LR6菌株ITS（ITS1–ITS4）序列发生碱基替换和碱基缺失的突变比例高于Lyd-LR1菌株。
表 2 荷叶离褶伞菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列同源性分析Table 2. Homology of ITS (ITS1–ITS4) sequences in Lyd strains(单位：%) 菌株
StrainLyd-LR1 Lyd-LR6 Lyd-LR10 Lyd-LR15 Lyd-LR17 Lyd-LRX Lyd-LRY Lyd-dcy2255 89.72 83.52 90.33 84.64 89.38 86.52 82.92 Lyd-ywy1 89.42 82.76 90.05 84.33 89.06 86.06 82.49 Lyd-Ld418 89.27 82.92 89.94 84.45 89.24 85.67 82.58 Lyd-060926 89.30 82.82 90.08 84.07 88.79 85.80 82.24 Lyd-060801 89.15 82.66 89.94 83.94 88.61 85.91 82.06 Lyd-061011 88.98 82.35 89.77 83.33 88.02 85.76 81.65 Lyd-iNAT 88.34 82.37 88.99 83.26 87.95 85.23 81.26 Lyd-22/14DMRJU 88.69 81.74 88.98 83.14 88.69 85.60 80.09 ![]()
图 2 荷叶离褶伞菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列多重比对分析B1–B37为序列比对发生碱基突变的位置。Figure 2. Multiple alignment of ITS (ITS1-ITS4) sequences in Lyd strainsB1–B37 are the location where base mutations occur in sequence alignment.2.2 荷叶离褶伞菌株的18S rRNA-ITS系统发育进化树分析
为明确外地荷叶离褶伞菌株和福建本地荷叶离褶伞菌株之间的进化关系，同时根据NCBI Blast提供的同源性分析结果，选取部分NCBI登录的荷叶离褶伞、离褶伞属菌株和其食用菌[18S rRNA（V4）同源性＞80%]进行系统发育进化树分析。18S rRNA（V4区）序列的进化树分析结果显示，外地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）聚为一类，再与福建本地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LRX和Lyd-LRY）聚为一类，最后与NCBI登录的荷叶离褶伞菌株（Lyophyllum decastes PBM3069和Lyophyllum decastes JM87/16）聚合（图3），但均不与NCBI登录的其他食用菌进行聚合，说明外地荷叶离褶伞菌株在遗传距离上有着近似的亲缘关系，但与福建本地荷叶离褶伞已存在遗传进化上的差别，而与NCBI登录的荷叶离褶伞和其他食用菌有较远的遗传距离和亲缘关系。
![]()
图 3 基于18S rRNA（V4）序列构建的系统进化树Figure 3. Phylogenetic tree based on 18S rRNA (V4) sequencesITS（ITS1–ITS4）序列的系统发育进化树分析结果显示，Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株聚合在一起，而Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌株聚合在一起，再与NCBI登录的荷叶离褶伞菌株进行聚合（图4）。从遗传距离和进化关系进行分析，外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17与福建本地离褶伞菌株Lyd-LRX和Lyd-LRY亲缘关系更接近。Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株保持相近的亲缘关系，与其他荷叶离褶伞菌株亲缘关系较远。外地荷叶离褶伞菌株Lyd-LR1和Lyd-LR6的遗传进化距离大于其他荷叶离褶伞菌株，表现出较远的种属亲缘关系。
![]()
图 4 基于ITS（ITS1–ITS4）序列构建的系统进化树Figure 4. Phylogenetic tree based on ITS (ITS1–ITS4) sequences2.3 荷叶离褶伞的菌丝体生长和菌丝形态观察
将外地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）接菌至PDA培养基暗培养10 d 和20 d（30 ℃）。在菌丝体生长的第10 天，Lyd-LR6菌株在生长圈边缘形成厚实的菌丝体且菌丝体生长的速度明显快于Lyd-LR1、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17菌株；Lyd-LR10和Lyd-LR17菌株的菌丝体生长速度基本一致；Lyd-LR1和Lyd-LR15菌株的菌丝体厚度较低且菌丝体生长速度慢于Lyd-LR6、Lyd-LR10和Lyd-LR17菌株（图5）。在菌丝体生长的第20天，Lyd-LR1菌株的菌丝体不能铺满整个培养基，菌丝呈现松散放射状且菌丝厚度较薄，生长较慢；Lyd-LR6厚实的菌丝体呈平铺状且铺满整个培养基，菌丝厚度较高且均一，生长速度较快；Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌丝体生长基本相同且菌丝体铺满整个培养基，菌丝体厚度较高且呈现突起状，生长较为迅速（图5）。荷叶离褶伞的菌丝体生长结果显示，Lyd-LR6菌丝体生长迅速，而Lyd-LR1菌丝体生长缓慢。Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株之间的菌丝体生长速度差别明显且均不同于Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17菌株的菌丝体生长。
挑取生长20 d的外地荷叶离褶伞菌株菌丝体进行扫描电镜观察，Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌株的菌丝形态基本相似，均为圆柱形的菌丝，菌丝饱满且交织在一起；Lyd-LR1菌株的菌丝呈现梭子状，菌丝生长不规则且有聚合生长的倾向；Lyd-LR6菌株的菌丝生长更加不规则且呈现凹陷状，菌丝明显聚合生长（图6）。与Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY菌株相比较，Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株的菌丝形态发生了明显的变异，且Lyd-LR6菌株的菌丝形态变异幅度大于Lyd-LR1菌株。
3. 讨论与结论
快速鉴定外地引进的菌株是提高荷叶离褶伞品种选育效率的重要手段。目前对荷叶离褶伞菌株的研究主要集中在改良栽培技术、营养成分分析、甾类和多糖等活性物质的提取纯化[14-16]，缺乏对于不同地区来源的荷叶离褶伞菌株的有效快速鉴定。随着分子生物学的发展，通过PCR扩增部分基因组序列对不同地区的食用菌菌株进行鉴定和确定其种属关系及基因组碱基序列变异情况的方法逐渐成熟，为优良菌株的筛选提供快捷方法[17]。采用传统的形态学鉴定食用菌有易于观察和比较优势，但菌丝形态多样性易受到外界因素的影响而出现假阳性。根据基因组序列同源性的特征（＞95%）可确定食用菌菌株之间的序列差异性和种属亲缘关系[18]。基因组碱基序列的鉴定方法通过分析碱基序列的突变而明确菌丝形态变异和菌丝体性状能遗传稳定的本质原因。利用菌体形态学和基因组序列测序结合的方法，鉴定了蘑菇属的双孢蘑菇（Agaricus bisporus），香菇属的香菇（Lentinula edodes）和小包脚菇属的草菇（Volvariella volvacea）[19]，以及快速将野生菌鉴定为Paxillus ammoniavirescens[18]。基因组部分序列测序和菌丝形态的结合是鉴定食用菌新菌株的有效方法。真菌食用菌具有物种多样性和序列保守性，其18S rRNA（V4）序列在遗传进化上较为保守，而ITS（ITS1–ITS4）序列常发生较高概率的碱基突变，常用于快速鉴定食用菌的基因序列同源性、种属关系和碱基序列突变程度，为进一步分析菌丝形态变异提供依据。
外地引进的荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）与福建本地的荷叶离褶伞菌株（Lyd-LRX和Lyd-LRY）以及NCBI登录的荷叶离褶伞菌株在18S rRNA-ITS序列的系统发育进化树均聚合在一起，且菌株间的18S rRNA 序列同源性大于97.55%，与离褶伞菌株的同源性也大于94.21%，确定此次从外地引进的食用菌均为荷叶离褶伞菌株。18S rRNA-ITS序列的同源性分析、多重序列比对和遗传进化树分析均显示外地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LR1、Lyd-LR6、Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17）和福建本地荷叶离褶伞菌株（Lyd-LRX和Lyd-LRY）存在较高比例的碱基序列突变，ITS序列同源性下降至80.09%～89.72%，从而明确外地荷叶离褶伞菌株已明显不同于福建本地荷叶离褶伞菌株以及NCBI登录的荷叶离褶伞菌株（45个）。这些外地引进的荷叶离褶伞菌株具有丰富本地区荷叶离褶伞菌株资源库的研究价值。ITS（ITS1–ITS4）的多重序列比对和遗传进化树显示Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株的基因序列差异性和碱基序列突变比例明显区别于其他荷叶离褶伞菌株，且仅在Lyd-LR6菌株发生的碱基替换和碱基缺失明显高于Lyd-LR1、Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY。菌丝体生长速度和菌丝形态进一步表明，Lyd-LR1梭子状不规则菌丝和松散放射状菌丝体以及Lyd-LR6凹陷状聚合生长菌丝和边缘厚实平铺状菌丝体，均不同于Lyd-LR10、Lyd-LR15和Lyd-LR17圆柱形饱满的菌丝和突起状菌丝体，且Lyd-LR6菌丝体生长速度明显快于Lyd-LR1，Lyd-LR6菌丝形态的变异程度也高于Lyd-LR1。基因组碱基序列高比例的突变是造成Lyd-LR1和Lyd-LR6菌株菌丝体生长速度和菌丝形态明显不同于Lyd-LR10、Lyd-LR15、Lyd-LR17、Lyd-LRX和Lyd-LRY的根本原因。而与Lyd-LR1菌株相比，Lyd-LR6菌株的碱基序列突变比例更高且碱基突变位置更多变（碱基替换和碱基缺失），使得Lyd-LR6菌株的菌丝形态明显区别于Lyd-LR1菌株。
-
![]()
图 1 荷叶离褶伞菌株的18S rRNA（V4）区序列多重比对分析
A1–A9为序列比对发生碱基突变的位置。
Figure 1. Multiple alignment of 18S rRNA(V4) sequences in Lyd strains
A1–A9 are the location where base mutations occur in sequence alignment.
![]()
图 2 荷叶离褶伞菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列多重比对分析
B1–B37为序列比对发生碱基突变的位置。
Figure 2. Multiple alignment of ITS (ITS1-ITS4) sequences in Lyd strains
B1–B37 are the location where base mutations occur in sequence alignment.
![]()
图 3 基于18S rRNA（V4）序列构建的系统进化树
Figure 3. Phylogenetic tree based on 18S rRNA (V4) sequences
![]()
图 4 基于ITS（ITS1–ITS4）序列构建的系统进化树
Figure 4. Phylogenetic tree based on ITS (ITS1–ITS4) sequences
表 1 荷叶离褶伞菌株的18S rRNA（V4）序列同源性分析
Table 1 Homology of 18S rRNA (V4) sequences in Lyd strains
（单位：%） 菌株 Strain Lyd-LR1 Lyd-LR6 Lyd-LR10 Lyd-LR15 Lyd-LR17 Lyd-LRX Lyd-LRY Lyd-PBM3069 98.45 98.22 98.88 99.11 98.48 98.66 98.21 Lyd-JM87/16 98.23 97.55 98.66 98.44 97.83 97.99 97.54 Ly-shimeji（D84555.1） 97.96 97.90 98.59 98.83 97.95 98.13 97.90 Ly-sp. MSG166 96.69 96.44 97.10 97.32 96.96 96.88 96.64 Ly-sp. PBM 2688 96.47 96.21 96.88 97.10 96.75 96.65 96.42 Ly-praslinense 10295 94.92 94.65 95.31 95.54 95.23 95.09 94.85 Ly-leucophaeatum HAe251 94.48 94.21 94.87 95.09 94.79 94.64 94.41 Ly-shimeji（D84553.1） 100.00 93.44 98.36 98.36 100.00 95.08 93.22 
下载: 导出CSV
表 2 荷叶离褶伞菌株的ITS（ITS1–ITS4）序列同源性分析
Table 2 Homology of ITS (ITS1–ITS4) sequences in Lyd strains
(单位：%) 菌株
StrainLyd-LR1 Lyd-LR6 Lyd-LR10 Lyd-LR15 Lyd-LR17 Lyd-LRX Lyd-LRY Lyd-dcy2255 89.72 83.52 90.33 84.64 89.38 86.52 82.92 Lyd-ywy1 89.42 82.76 90.05 84.33 89.06 86.06 82.49 Lyd-Ld418 89.27 82.92 89.94 84.45 89.24 85.67 82.58 Lyd-060926 89.30 82.82 90.08 84.07 88.79 85.80 82.24 Lyd-060801 89.15 82.66 89.94 83.94 88.61 85.91 82.06 Lyd-061011 88.98 82.35 89.77 83.33 88.02 85.76 81.65 Lyd-iNAT 88.34 82.37 88.99 83.26 87.95 85.23 81.26 Lyd-22/14DMRJU 88.69 81.74 88.98 83.14 88.69 85.60 80.09
下载: 导出CSV
-
[1] 中国食用菌协会. 2019年度全国食用菌统计调查结果分析 [J]. 中国食用菌, 2021, 40(6):104−110. China Edible Fungi Association (CEFA). Analysis on the results of the national statistical survey of edible fungi in 2019 [J]. Edible Fungi of China, 2021, 40(6): 104−110.(in Chinese)
[2] 魏雨恬, 冯娜, 张劲松, 等. 荷叶离褶伞子实体有机溶剂萃取物的化学成分和抗肿瘤活性 [J]. 食用菌学报, 2016, 23(2):70−74. WEI Y T, FENG N, ZHANG J S, et al. Qualitative chemical analysis and antitumor activity of Lyophyllum decastes fruit body extracts [J]. Acta Edulis Fungi, 2016, 23(2): 70−74.(in Chinese)
[3] 程继红. 鹿茸菇的栽培现状与营养保健价值 [J]. 食药用菌, 2021, 29(1):12−15. CHENG J H. Cultivation status and its nutrition and health care value of Lyophyllum decastes [J]. Edible and Medicinal Mushrooms, 2021, 29(1): 12−15.(in Chinese)
[4] 木村荣一, 王建兵. 鹿茸菇的工厂化栽培 [J]. 食药用菌, 2019, 27(4):237−240. Eiichi Kimura, WANG J B. Industrial cultivation of Lyophyllum decastes [J]. Edible and Medicinal Mushrooms, 2019, 27(4): 237−240.(in Chinese)
[5] 秦春青. 鹿茸菇子实体多糖提取分离、结构鉴定及抗氧化研究[D]. 杭州: 浙江工业大学, 2019. QIN C Q. Study on extraction, isolation, structure identification and antioxidant activity of polysaccharide from the fruit body of velvet antler mushroom[D]. Hangzhou: Zhejiang University of Technology, 2019. (in Chinese)
[6] 黄健航, 郑峻, 杨斌, 等. 不同干燥温度对鹿茸菇品质及其抗氧化活性的比较分析 [J]. 中国食品添加剂, 2022, 33(2):194−200. HUANG J H, ZHENG J, YANG B, et al. Comparative analysis of quality and antioxidant activity of Lyophyllum decastes at different drying temperatures [J]. China Food Additives, 2022, 33(2): 194−200.(in Chinese)
[7] 张凤培, 徐慧, 邱绍峰, 等. 鹿茸菇多糖抗氧化保肝研究 [J]. 生物技术通报, 2021, 37(11):92−100. ZHANG F P, XU H, QIU S F, et al. Study on antioxidant and liver protection of polysaccharide from Lyophyllum decastes [J]. Biotechnology Bulletin, 2021, 37(11): 92−100.(in Chinese)
[8] 杨斌, 方柄栋, 郑峻, 等. 鹿茸菇多酚提取工艺优化及其抗氧化活性 [J]. 食品研究与开发, 2021, 42(24):41−49. DOI: 10.12161/j.issn.1005-6521.2021.24.007 YANG B, FANG B D, ZHENG J, et al. Extraction procedure optimization and antioxidant activity of polyphenols from Lyophyllum decastes [J]. Food Research and Development, 2021, 42(24): 41−49.(in Chinese) DOI: 10.12161/j.issn.1005-6521.2021.24.007
[9] 律诗, 代晹鑫, 刘野, 等. 食用菌鲜味强度评价及鲜味氨基酸和核苷酸提取工艺优化 [J]. 食品科学技术学报, 2022, 40(1):100−108. DOI: 10.12301/spxb202100376 LV S, DAI Y X, LIU Y, et al. Evaluation of umami intensity of edible fungi and optimization of umami amino acid and nucleotide extraction [J]. Journal of Food Science and Technology, 2022, 40(1): 100−108.(in Chinese) DOI: 10.12301/spxb202100376
[10] 汤倩倩, 孙育红. 以稻草和鹿茸菇菌渣为原料的大棚畦式草菇栽培技术 [J]. 中国蔬菜, 2022(1):118−120. DOI: 10.19928/j.cnki.1000-6346.2021.3061 TANG Q Q, SUN Y H. Cultivation techniques of straw mushroom in greenhouse with rice straw and antler mushroom residue as raw materials [J]. China Vegetables, 2022(1): 118−120.(in Chinese) DOI: 10.19928/j.cnki.1000-6346.2021.3061
[11] 张凌姗. 鹿茸菇生态学特性与液体菌种配方的优化研究 [J]. 食药用菌, 2020, 28(6):425−427,439. ZHANG L S. Study on ecological characteristics and optimization of liquid spawn formula of Lyophyllum decastes [J]. Edible and Medicinal Mushrooms, 2020, 28(6): 425−427,439.(in Chinese)
[12] 汤倩倩, 章超, 孙育红, 等. 以水稻秸秆和鹿茸菇菌渣为主要原料的草菇栽培技术 [J]. 中国食用菌, 2021, 40(6):34−36,40. TANG Q Q, ZHANG C, SUN Y H, et al. Facilities cultivation technology of Volvaria volvacea cultivated by Oryza sativa straw and lyoyllum decastes chaff fomula [J]. Edible Fungi of China, 2021, 40(6): 34−36,40.(in Chinese)
[13] 魏军, 赵青青, 石世达, 等. 不同容器室内栽培食用菌的应用与研究 [J]. 中国食用菌, 2021, 40(9):93−97. WEI J, ZHAO Q Q, SHI S D, et al. Application and study on edible fungi cultivation in different containers [J]. Edible Fungi of China, 2021, 40(9): 93−97.(in Chinese)
[14] 蒋宁, 李辉平, 林金盛, 等. 草菇培养料发酵过程中细菌菌群的变化研究 [J]. 湖北民族大学学报(自然科学版), 2021, 39(3):261−265. JIANG N, LI H P, LIN J S, et al. Study on bacterial community of Volvariella volvacea compost during fermentation [J]. Journal of Hubei Minzu University (Natural Science Edition), 2021, 39(3): 261−265.(in Chinese)
[15] 翟美珠, 张圆圆, 赵丽娜. 食用菌主题现代农业生态园规划设计 [J]. 中国食用菌, 2020, 39(6):202−204,208. ZHAI M Z, ZHANG Y Y, ZHAO L N. Planning and design of modern agricultural eco-park with edible fungi theme [J]. Edible Fungi of China, 2020, 39(6): 202−204,208.(in Chinese)
[16] 张鑫, 何井瑞, 徐国平, 等. 宿迁市工厂化食用菌产业现状及发展途径 [J]. 上海蔬菜, 2021(4):72−73,88. DOI: 10.3969/j.issn.1002-1469.2021.04.030 ZHANG X, HE J R, XU G P, et al. Present situation and development approach of industrialized edible fungi industry in Suqian city [J]. Shanghai Vegetables, 2021(4): 72−73,88.(in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1002-1469.2021.04.030
[17] 宋立志. 基于ITS序列对市售常见食用菌的鉴定及系统发育研究 [J]. 中国林副特产, 2019(3):7−10. SONG L Z. Identification and Phylogenic study of common commercial edible mushrooms based on ITS sequences [J]. Forest by-Product and Speciality in China, 2019(3): 7−10.(in Chinese)
[18] 杜萍, 凃慧, 蒋佳颖, 等. 野生Paxillus ammoniavirescens菌的分子鉴定及生物学特性研究 [J]. 林业科学研究, 2020, 33(3):146−155. DU P, TU H, JIANG J Y, et al. Molecular identification and biological characteristics of wild Paxillus ammoniavirescens strain [J]. Forest Research, 2020, 33(3): 146−155.(in Chinese)
[19] 胡扬楠, 张扬, 兰慧芳, 等. 徐州四种市售食用菌的分子鉴定 [J]. 农业与技术, 2016, 36(21):12−13,42. HU Y N, ZHANG Y, LAN H F, et al. Molecular identification of four kinds of edible fungi in Xuzhou [J]. Agriculture and Technology, 2016, 36(21): 12−13,42.(in Chinese)
-
期刊类型引用(1)
1. 刘娜，宋莹，张敏，吕立涛，李跃，黄磊. 二十三个离褶伞属菌株遗传多样性分析及分子身份证构建. 北方园艺. 2025(04): 8-14 . 
百度学术
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数: 657
- HTML全文浏览量: 231
- PDF下载量: 36
- 被引次数: 1
