High-performance Regeneration of Pyrethrum
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摘要:目的 筛选出适宜白花除虫菊外植体的消毒方法、外植体诱导、继代培养及生根培养阶段适宜的培养基配方，建立白花除虫菊高效再生体系。方法 以白花除虫菊尚未张开的花蕾作为再生体系的外植体材料，花蕾经过灭菌消毒以后，采用MS固体培养基，比较不同种类植物生长调节剂浓度配比对白花除虫菊花蕾诱导出芽、增殖及生根等关键环节的影响。结果 白花除虫菊花蕾外植体最适宜的消毒条件为75%酒精处理30 s后用0.10%氯化汞溶液消毒10 min，之后用15%次氯酸溶液处理15 min； 白花除虫菊花蕾诱导芽的最适培养基为MS+2.0 mg·L−16-BA+0.5 mg·L−1TDZ + 0.2 mg·L−1IBA；白花除虫菊芽增殖的最适培养基为MS+ 1.0 mg·L−16-BA+ 0.1 mg·L−1TDZ+0.1 mg·L−1IBA；白花除虫菊生根的最适培养基为MS+ 0.1 mg·L−1IAA+ 0.1 mg·L−1IBA；炼苗移栽的最适基质为泥炭 ∶ 珍珠岩=6 ∶ 1，成活率达90%以上，移栽效果良好。结论 基本建立了白花除虫菊高效再生体系，可为繁育白花除虫菊种苗提供技术支撑。Abstract:Objective Appropriate methods for efficient tissue disinfection, explant induction, and culture medium formulation were established for a high-performance program to propagate pyrethrum.Method Unopened flower buds of white flower pyrethrum were sterilized and used as explants on an MS solid medium for the experiment. Effects of various plant growth regulators on bud induction, proliferation, and rooting of the seedlings were monitored.Result The optimum conditions for disinfecting the explants were found to be a treatment of 75% alcohol for 30 s followed by one of 0.10% mercuric chloride solution for 10 min and another of 15% hypochlorite for 15 min. For bud induction, the choice medium was formulated with MS + 2.0 mg·L−1 6-BA + 0.5 mg·L−1 TDZ+ 0.2 mg·L−1 IBA; for bud proliferation, MS + 1.0 mg·L−1 6-BA + 0.1 mg·L−1TDZ + 0.1 mg·L−1 IBA; for rooting, MS + 0.1 mg·L−1 IAA + 0.1 mg·L−1 IBA; and for transplanting seedlings, peat:perlite at 6:1. A survival rate greater than 90% as well as adequate transplanting was achieved.Conclusion The newly developed in vitro regeneration system materially lessened the pressure of the recently encountered white flower pyrethrum germplasm degradation. In addition, a supply of high-quality seedlings could be assured with the proposed propagation program.
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Keywords:
- White flower pyrethrum /
- adventitious bud /
- regeneration system
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0. 引言
【研究意义】除虫菊是一种生物农药的原料植物，在云南的种植面积约6 500 hm2，占世界产量的30%。除虫菊（Tanacetum cinerariifolium）为菊科多年生草本植物，又名白花除虫菊。其株高30~80 cm，全株灰绿色，被白色绒毛。叶互生，卵形或长椭圆形，自根部丛生，叶片羽状全裂，叶柄细长。基部叶具长柄，上部叶几乎无柄。头状花序顶生，具长梗，花中心为黄色管状花，周围花为白色舌状花冠。细小瘦果，成熟时为淡褐色或黄色。从其花中能够提取出除虫菊酯，这种具有杀虫功能的活性物质由6种成分组成，包括杀虫主要成分除虫菊素（I、II）、瓜叶菊素（I、II）和茉莉菊素（I、II）。其中除虫菊素I和除虫菊素II杀虫活性最强，常被提取制成杀虫剂。除虫菊酯对人类、牲畜等无毒副作用，对环境也无污染，对害虫使用不易产生抗性。此外，除虫菊花朵可入药，外用于皮肤可治疥癣，并且除虫菊的花朵丰富美丽，其观赏价值的开发潜力巨大，可用来布置花坛、花境，还可以用作鲜切花。目前种植的除虫菊品种因长年自行留种，退化严重，混杂率增加，品质严重下降。因此，开展白花除虫菊高效再生体系的研究可从源头把住生产第一关，实现除虫菊的标准化生产。【前人研究进展】关于除虫菊的繁殖，国外对除虫菊组织培养的报道较少，仅对种子育苗有少量报道[1-2]。关于除虫菊的组织培养，1985年中国科学院昆明植物研究所黄仕周[3]对除虫菊腋芽进行离体培养及快速繁殖，建立了腋芽快繁体系，但其仅用了腋芽作外植体。1998年中国科学院昆明植物研究所陈宗莲等[4]以除虫菊小花蕾为外植体，发现先形成愈伤组织再分化，新芽生长细弱。谢庆华等[5]仅以芽条为外植体，建立了再生体系，筛选出适宜的诱导、增殖及生根培养基配方。张强等[6]研究了除虫菊种子和幼苗的消毒方法。董建新等[7]、李小六等[8]、李琰等[9]主要研究除虫菊愈伤组织的诱导和继代培养。任彦荣[10]以除虫菊嫩叶和茎段为外植体，筛选出适宜的诱导、增殖和生根培养基，但未采用花蕾作外植体。张军云等[11]采用除虫菊顶芽和带节的嫩茎段为外植体进行消毒试验，确定了消毒方法。于娅等[12]以除虫菊带柄叶片为外植体，对除虫菊不定芽的诱导、丛生芽的增殖以及生根诱导进行了系统的研究。李群等[13]以MS、ER、MG-5、B5、H、1/2MS、M9、NT及White为基本培养基，分析不同类型培养基对除虫菊细胞生长的影响。【本研究切入点】前人研究中均未涉及移栽基质的筛选。本研究对除虫菊炼苗移栽的基质配方进行了筛选，为建立完整的高效快繁体系提供参考。【拟解决的关键问题】采用除虫菊尚未张开的花蕾为外植体，探索适宜的消毒方法，筛选最适的诱导、增殖及生根培养基，炼苗移栽的基质配方，以期获得白花除虫菊的高效组织培养体系，获得优质种苗。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
选取除虫菊优良品种尚未张开的花蕾作为外植体材料，所选取的外植体材料健壮、无病虫害。
1.2 试验方法
1.2.1 外植体消毒
将所选取的小花蕾用3%的洗衣粉水清洗干净并于自来水下流水冲洗10~20 min，75%酒精消毒30 s；置于质量分数0.1%的升汞溶液中浸泡消毒10~15 min，再用质量分数15%的次氯酸钠溶液浸泡10~20 min，在浸泡和消毒过程中不断地搅拌和振荡，设置了不同消毒剂的时间组合；消毒完成以后，用无菌水冲洗小花蕾3~5遍，冲洗好的小花蕾接种备用；消毒剂组合及处理时间见表1，每个处理30个外植体，重复3次。
表 1 除虫菊小花蕾消毒试验结果Table 1. Disinfection of pyrethrum small buds处理
Treatment0.1%氯化汞处理
0.1% mercuric chloride treatment/min15%次氯酸钠溶液处理
15% sodium hypochlorite treatment/min污染率
Pollution rate/%褐化率
Brownning rate/%诱导率
Induction rate/%A1 10 10 50.00±2.72 a 16.67±2.72 d 22.22±4.16 d A2 10 15 31.11±4.16 c 8.89±1.57 e 64.44±1.57 a A3 10 20 47.78±1.57 b 36.67±2.72 a 32.22±1.57 c A4 15 10 46.67±2.72 b 30.00±2.72 c 38.89±4.16 c A5 15 15 28.89±1.57 d 27.78±1.57 c 50.00±2.72 b A6 15 20 24.44±1.57 d 33.33±2.72 b 58.89±4.16 a 同列数据后不同小写字母表示差异达0.05显著水平。表2～5同。
Data with different lowercase letters on the same column indicate significant difference at 0.05 level. Same for Table 2-5.1.2.2 丛生芽诱导
将冲洗好的小花蕾置于超净工作台中，用接种刀切下稍褐化的部分，将花蕾接种于不同的诱导培养基（表2）上，设置不同的生长调节剂浓度组合培养基，均添加0.7%琼脂和3%蔗糖，灭菌前将培养基的pH调至5.6后于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。每个处理30个外植体，重复3次；然后将其摆放到培养室内培养，调节控制培养室的温光条件为：温度（25±1） ℃，光照强度30~40 µmol·m−2·s−1，光照时间14 h·d−1，在此条件下培养20~30 d。
表 2 除虫菊花蕾诱导培养基筛选Table 2. Medium selection for pyrethrum bud induction处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)诱导率
Induction rate/%生长状态
Growth state6-BA TDZ IBA B1 1.0 0.1 0.2 65.56±1.57 d 诱导出不定芽，生长一般 B2 1.0 0.3 0.2 71.11±1.57 d 诱导出不定芽，较好 B3 1.0 0.5 0.2 80.00±2.72 b 诱导出不定芽，一般 B4 2.0 0.1 0.2 76.67±2.72 c 诱导出不定芽，一般 B5 2.0 0.3 0.2 87.78±4.16 a 诱导出不定芽，较好 B6 2.0 0.5 0.2 93.33±2.72 a 诱导出不定芽，生长健壮 1.2.3 无菌苗增殖
把出芽的除虫菊丛生苗转接到无菌苗增殖培养基上，设置不同的生长调节剂浓度组合培养基（表3），均添加0.7%琼脂和3%蔗糖，灭菌前将培养基的pH调至5.6后于121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。每个处理30瓶，重复3次；将接种有除虫菊丛生苗的培养瓶置于培养室中，调节控制培养室的温光条件为：温度（25±1 ）℃，光照强度30~40 µmol·m−2·s−1，光照时间12 h·d−1，在此条件下培养20~25 d。
表 3 除虫菊不定芽增殖培养基筛选Table 3. Medium selection for pyrethrum adventitious bud proliferation处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)增殖倍数
Proliferation rate生长状态
Growth state6-BA TDZ IBA C1 1 0.1 0.1 3.08±0.02 a 丛生芽生长健壮 C2 1 0.3 0.1 2.70±0.03 b 丛生芽生长较好 C3 1.5 0.1 0.1 2.50±0.03 d 丛生芽生长较好 C4 1.5 0.3 0.1 2.44±0.04 d 丛生芽生长一般 C5 2 0.1 0.1 2.54±0.04 c 丛生芽生长一般 C6 2 0.3 0.1 2.26±0.07 e 丛生芽生长较好，但部分有玻璃化 1.2.4 生根培养
将扩繁得到的除虫菊丛生苗用接种刀切成单株苗，然后将切成的单株苗转接到除虫菊生根培养基上，设置不同生长调节剂的培养基（表4）；将接种有除虫菊单株苗的培养瓶置于培养室中，调节控制培养室的温光条件为：温度（25±1） ℃，光照强度1 000~2 000 Lx，光照时间12 h·d−1，在此条件下培养15~20 d。
表 4 除虫菊花蕾生根培养基的筛选结果Table 4. Medium selection for pyrethrum seedling rooting处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)生根率
Rate of rooting/%生根情况
Rooting stateIAA IBA D1 0.1 0.1 98.89±1.57 a 根系生长状况良好 D2 0.1 0.2 86.67±2.72 b 根系生长状况好 D3 0.2 0.1 82.22±4.16 b 根系生长状况好 D4 0.2 0.2 80.00±2.72 b 根系生长状况一般 1.2.5 炼苗和移栽
将除虫菊生根瓶苗移至炼苗大棚中培养7~10 d，使其适应外界环境。从培养瓶中取出生根苗，洗去除虫菊生根苗根部的培养基，用0.01%的百菌清浸泡3~5 min后捞出，移栽至不同体积比的泥炭与珍珠岩基质（表5）中，将基质浇透水，然后进行常规的水肥管理，移栽60 d后测定成活率、株高、叶数等指标。
表 5 除虫菊不同体积配比基质筛选结果Table 5. Selected culture medium for pyrethrum propagation处理
Treatment泥炭与珍珠岩体积配比
Proportions of peat soil and perlite成活率
Rate of survival/%株高
Plant height/cm叶数
Leaf numberE1 1∶1 75.56±6.85 b 5.77±0.29 b 5.67±0.47 b E2 2∶1 73.33±2.72 b 5.83±0.12 b 6.33±1.25 b E3 4∶1 85.56±6.85 b 6.20±0.16 b 7.00±1.41 b E4 6∶1 96.67±2.72 a 6.43±0.21 a 7.33±1.25 a 1.3 数据统计与分析
采用SPSS 25.0软件对数据进行统计与方差分析。
2. 结果与分析
2.1 不同消毒剂组合对除虫菊小花蕾消毒效果的影响
不同的消毒剂组合及处理时间对除虫菊小花蕾的消毒效果见表1。从表1中可以看出，氯化汞处理15 min后，随着次氯酸钠处理时间的延长，外植体的污染率呈现下降的趋势，外植体诱导率呈上升的趋势；且不同的消毒剂组合及处理时间对除虫菊小花蕾的消毒效果显著（P＜0.05）。因此，认为除虫菊小花蕾消毒的最适宜方法为：75%酒精处理30 s后用0.10%氯化汞溶液消毒10 min，之后用15%次氯酸溶液处理15 min。
2.2 除虫菊小花蕾诱导结果
消毒过的除虫菊小花蕾培养20~30 d以后开始出芽，花蕾诱导培养基的筛选结果见表2。从表2可以看出，当生长素IBA质量浓度相同时，随着6-BA和TDZ质量浓度的增加，除虫菊小花蕾诱导率呈现上升趋势，说明除虫菊小花蕾对细胞分裂素和激动素响应较好，且不同质量浓度的植物生长调节剂对除虫菊小花蕾的诱导效果显著（P＜0.05）。最适宜的除虫菊小花蕾诱导培养基为：MS+2.0 mg·L−16-BA+ 0.5 mg·L−1TDZ+ 0.2 mg·L−1IBA，诱导率达93.33%，且诱导出的不定芽生长健壮。
2.3 除虫菊不定芽增殖培养结果
为获得大批量的除虫菊丛生苗，筛选了适宜的增殖培养基，结果见表3，从表3中可以看出，当生长素IBA质量浓度相同时，随着6-BA和TDZ质量浓度的增加，除虫菊不定芽增殖率呈现下降趋势，说明除虫菊小花蕾在诱导时累积了细胞分裂素和激动素，在增殖阶段应适当降低激素才能提高增殖率并让不定芽生长正常、健壮；且不同质量浓度的植物生长调节剂对除虫菊不定芽增殖效果显著（P＜0.05）。最适宜的除虫菊不定芽增殖培养基为：MS+ 1.0 mg·L−16-BA+ 0.1 mg·L−1TDZ+ 0.1 mg·L–1IBA，增殖倍数达3.08。
2.4 除虫菊生根培养结果
将除虫菊丛生苗切成单株苗后转接到生根培养基中，培养20 d左右即可生根，为使得除虫菊生根整齐，根系状况好，筛选了最适宜生根的培养基，结果见表4。从表4中可以看出，4个生长素组合的培养基其生根率均在80%以上，而当IAA和IBA质量浓度均为0.1 mg·L−1，其生根率达到了100%，且根系生长状况良好，根白；且D2、D3、D4处理与D1的差异显著（P＜0.05）。最适宜的除虫菊生根培养基为：MS+ 0.1 mg·L−1IAA+0.1 mg·L−1IBA ，生根率达98.89%。
2.5 炼苗和移栽
将除虫菊生根瓶苗移至大棚中炼苗，7~10 d后基本适应了大棚环境，移栽至不同配比的基质中，60 d后统计的移栽成活率均在70%以上，其中泥炭∶珍珠岩＝6∶1（体积比）时的移栽成活率最高，为96.67%，株高为6.43 cm，叶数为7.33；3个指标均与其他3个处理差异显著（P＜0.05）。
3. 讨论与结论
外植体消毒是进行除虫菊再生体系的第一步基础工作。除虫菊种子在自然状态下发芽率较低，且发芽缓慢，发芽不齐。通过试验发现以除虫菊小花蕾作为外植体进行消毒处理，氯化汞和次氯酸钠结合消毒处理后的污染率在50%以下，褐化率在40%以下，其中氯化汞处理10 min，次氯酸钠处理15 min的污染率为31.11%，褐化率为8.89%，诱导率为64.44%，诱导效果较好。
再生体系是加快除虫菊繁殖的有效途径，适宜的植物生长调节剂是促进植物再生体系建立的重要因素。目前，关于除虫菊组培快繁技术方面的研究已经有一些研究结果，其中，对除虫菊愈伤组织诱导培养的研究是比较多的，还有以除虫菊腋芽、种子、芽条嫩叶、茎段、带柄叶片、小花蕾为外植体做组织培养的，不同的外植体对再生体系的各个环节要求是不一样的，需要通过不同的植物生长调节剂组合及试验方法摸索，才能筛选出不同外植体最适宜的培养基配方。
本研究中，以除虫菊小花蕾为外植体材料，在前人研究基础上结合不同植物生长调节剂及不同浓度组合探讨对诱导小花蕾出芽、不定芽增殖、生根等关键环节的影响。结果表明获得的小花蕾最适诱导培养基配方为MS+ 2.0 mg·L−16-BA+ 0.5 mg·L−1TDZ+ 0.2 mg·L−1IBA，萌发率达93.33%。与陈宗莲等[4]的研究相比，本试验直接从小花蕾诱导出芽，而陈宗莲的研究则是先诱导出愈伤组织，这可能与我们的诱导培养基里面添加了TDZ有关。 有报道发现TDZ更有利于离体不定芽的再生，TDZ能显著促进较难诱导分化的植物的离体培养，能有效改善其诱导率[14-15]。本试验中，TDZ对除虫菊不定芽的增殖效果也是很显著的，试验筛选出适宜除虫菊不定芽增殖的培养基为MS+1.0 mg·L−16-BA +0.1 mg·L−1TDZ +0.1 mg·L−1IBA，增殖率3.08；适宜芽生根的培养基为MS+ 0.1 mg·L−1IAA+ 0.1 mg·L−1IBA，生根率98.89%。
炼苗移栽是除虫菊再生体系能否走向工厂化生产的关键环节。在以往的研究报道中均没有对除虫菊组培苗的移栽基质配比做过对比试验，本研究摸索出炼苗移栽的最适移栽基质为泥炭∶珍珠岩=6∶1（体积比），成活率高达96.67%，移栽效果良好。
本研究基本建立了白花除虫菊的高效再生体系，为防止除虫菊种苗退化提供了一条新的途径，还可为繁育白花除虫菊种苗提供技术支撑。
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表 1 除虫菊小花蕾消毒试验结果
Table 1 Disinfection of pyrethrum small buds
处理
Treatment0.1%氯化汞处理
0.1% mercuric chloride treatment/min15%次氯酸钠溶液处理
15% sodium hypochlorite treatment/min污染率
Pollution rate/%褐化率
Brownning rate/%诱导率
Induction rate/%A1 10 10 50.00±2.72 a 16.67±2.72 d 22.22±4.16 d A2 10 15 31.11±4.16 c 8.89±1.57 e 64.44±1.57 a A3 10 20 47.78±1.57 b 36.67±2.72 a 32.22±1.57 c A4 15 10 46.67±2.72 b 30.00±2.72 c 38.89±4.16 c A5 15 15 28.89±1.57 d 27.78±1.57 c 50.00±2.72 b A6 15 20 24.44±1.57 d 33.33±2.72 b 58.89±4.16 a 同列数据后不同小写字母表示差异达0.05显著水平。表2～5同。
Data with different lowercase letters on the same column indicate significant difference at 0.05 level. Same for Table 2-5.
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表 2 除虫菊花蕾诱导培养基筛选
Table 2 Medium selection for pyrethrum bud induction
处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)诱导率
Induction rate/%生长状态
Growth state6-BA TDZ IBA B1 1.0 0.1 0.2 65.56±1.57 d 诱导出不定芽，生长一般 B2 1.0 0.3 0.2 71.11±1.57 d 诱导出不定芽，较好 B3 1.0 0.5 0.2 80.00±2.72 b 诱导出不定芽，一般 B4 2.0 0.1 0.2 76.67±2.72 c 诱导出不定芽，一般 B5 2.0 0.3 0.2 87.78±4.16 a 诱导出不定芽，较好 B6 2.0 0.5 0.2 93.33±2.72 a 诱导出不定芽，生长健壮
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表 3 除虫菊不定芽增殖培养基筛选
Table 3 Medium selection for pyrethrum adventitious bud proliferation
处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)增殖倍数
Proliferation rate生长状态
Growth state6-BA TDZ IBA C1 1 0.1 0.1 3.08±0.02 a 丛生芽生长健壮 C2 1 0.3 0.1 2.70±0.03 b 丛生芽生长较好 C3 1.5 0.1 0.1 2.50±0.03 d 丛生芽生长较好 C4 1.5 0.3 0.1 2.44±0.04 d 丛生芽生长一般 C5 2 0.1 0.1 2.54±0.04 c 丛生芽生长一般 C6 2 0.3 0.1 2.26±0.07 e 丛生芽生长较好，但部分有玻璃化
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表 4 除虫菊花蕾生根培养基的筛选结果
Table 4 Medium selection for pyrethrum seedling rooting
处理
Treatment植物生长调节剂
Plant growth regulator/ (mg·L−1)生根率
Rate of rooting/%生根情况
Rooting stateIAA IBA D1 0.1 0.1 98.89±1.57 a 根系生长状况良好 D2 0.1 0.2 86.67±2.72 b 根系生长状况好 D3 0.2 0.1 82.22±4.16 b 根系生长状况好 D4 0.2 0.2 80.00±2.72 b 根系生长状况一般
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表 5 除虫菊不同体积配比基质筛选结果
Table 5 Selected culture medium for pyrethrum propagation
处理
Treatment泥炭与珍珠岩体积配比
Proportions of peat soil and perlite成活率
Rate of survival/%株高
Plant height/cm叶数
Leaf numberE1 1∶1 75.56±6.85 b 5.77±0.29 b 5.67±0.47 b E2 2∶1 73.33±2.72 b 5.83±0.12 b 6.33±1.25 b E3 4∶1 85.56±6.85 b 6.20±0.16 b 7.00±1.41 b E4 6∶1 96.67±2.72 a 6.43±0.21 a 7.33±1.25 a
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